魏文焯，鄭 超，劉靜波，皮勁松，張 昊*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢 430064；2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621010）

1976 年，Sanger 等[1]在馬鈴薯紡錘塊莖病的研究中發(fā)現(xiàn)類病毒Viroids 可侵染馬鈴薯植株并導(dǎo)致植株死亡，但與病毒不同的是，其不具備蛋白質(zhì)外殼，且基因組是單鏈、閉合的RNA。1979 年，洛克菲勒大學(xué)Hsu和Coca-Prados 研究員在電子顯微鏡下觀察到真核細胞細胞質(zhì)中circ RNA 的存在，隨后在小鼠、大鼠及果蠅中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)類似結(jié)構(gòu)的分子[2-4]，但受對ncRNA 的認知水平和技術(shù)手段限制，當(dāng)時僅認為它是RNA 錯誤剪切的副產(chǎn)物[5]。隨著高通量RNA 測序技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)和基因功能研究的不斷發(fā)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)circ RNA 在機體內(nèi)發(fā)揮著重要作用。2012 年，Salzman 等[6]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)circ RNA 在人類細胞中廣泛存在，引發(fā)學(xué)術(shù)界對circ RNA 的研究熱度不斷提升，目前已經(jīng)成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。

本文綜述了circ RNA 的分類、形成機制、生物學(xué)功能及circ RNA 成環(huán)的影響因素，并對近幾年來在動物腸道屏障功能方面的研究進展進行歸納與總結(jié)，以期為動物腸道屏障功能方面的研究提供參考，并對circ RNA 的研究進行展望。

1 circ RNA 的生物學(xué)特征

1.1 circ RNA 的結(jié)構(gòu)與分類 circ RNA 是一類不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共價鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA 分子[7-8]。在反向剪接過程中，下游5'端剪接位點與上游3' 端剪接位點反向連接，在連接位點形成一個具有3'，5'磷酸二酯鍵的circ RNA 分子[9-10]。circ RNA 與傳統(tǒng)線性RNA 不同，circ RNA 以環(huán)狀形式存在，其3' 頭端和5' 尾端以共價鍵連接而成，使其避免被RNA 核酸外切酶和脫支酶降解，是其表達穩(wěn)定，不易降解的重要原因[11-12]。Circ RNA 根據(jù)來源可分為三大類[13-15]：①外顯子來源的circ RNA（exonic circ RNA，ecirc RNA），ecirc RNA 是由一個或多個外顯子首尾拼接而成，其占circ RNA 的絕大多數(shù)（超過80%）[16]；②外顯子-內(nèi)含子來源的circ RNA（exon-intron circ RNA，EIcirc RNA），EIcirc RNA 由編碼基因的外顯子序列和內(nèi)含子序列組成，不同于僅由外顯子序列組成的特異RNA[17]；③內(nèi)含子來源的circ RNA（circular intronic RNA，ciRNA），ciRNA 廣泛存在于細胞核中，由內(nèi)含子自身環(huán)化形成[10]。

1.2 circ RNA 的環(huán)化方式 近年來研究表明，circ RNA的環(huán)化方式主要有4 種（圖1），分別是套索驅(qū)動環(huán)化、內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化、RNA 結(jié)合蛋白（RBP）驅(qū)動環(huán)化及ciRNA 的環(huán)化[10-11,18]。

圖1 circ RNA 形成示意圖[22]

套索驅(qū)動環(huán)化又稱為外顯子跳躍，即上游5' 剪接供體位點與下游3' 剪接受體位點結(jié)合，產(chǎn)生含有內(nèi)含子和外顯子的套索，然后通過反向剪接去除套索中的內(nèi)含子序列，產(chǎn)生circ RNA，剩余部分形成mRNA。

內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化又稱為直接反向剪接，側(cè)翼內(nèi)含子的反向互補序列堿基互補配對形成一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)（如Alu 序列），內(nèi)含子序列隨后經(jīng)前體RNA（premRNA）剪接生成circ RNA。

RNA 結(jié)合蛋白（RBP）驅(qū)動環(huán)化，近年來，有研究發(fā)現(xiàn)RBP 如RNA 特異性腺苷脫氨酶1（Adenosine Deaminase Acting on RNA1，ADAR1）和細胞核核糖核蛋白L（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L，hnRNP L）與circ RNA 的生成有重要聯(lián)系，RBP 可通過與側(cè)翼內(nèi)含子結(jié)合使供體位點與受體位點的距離縮短，從而促進外顯子的環(huán)化[19-20]。

ciRNA 的環(huán)化，由靠近5' 端剪切位點的一段長度為7 nt 的含有GU 堿基序列和3' 端分支位點的一段長度為11 nt 的含有C 堿基序列共有基序，以2'，5'-磷酸二酯鍵使首尾相連形成，ci-ankrd52 是具有代表性的ciRNA[21]。

1.3 circ RNA 的功能

1.3.1 充當(dāng)miRNA 海綿 miRNA 是一種由內(nèi)源基因編碼的長度在18～25 nt 的非編碼RNA，可以通過與mRNA的5'和3'端非編碼區(qū)（UTRs）結(jié)合，使目標mRNA 降解，在動植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控作用[23-24]。Circ RNA 可以依靠自身的miRNA 結(jié)合位點來吸附特定的miRNA，從而減少miRNA 與靶基因的結(jié)合，影響miRNA 對mRNA 的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[25]。第一個被發(fā)現(xiàn)并確認的miRNA 海綿是ciRS-7，它由小腦退化相關(guān)蛋白1（CDR1as）產(chǎn)生[26-28]。ciRS-7/CDR1as 包括70 多個miR-7 結(jié)合位點，當(dāng)CDR1as 表達升高時，miR-7 的表達降低，實現(xiàn)miR-7 的有效吸附，削弱miR-7 對靶mRNA的調(diào)控作用，致使miR-7的靶基因表達升高[26,29-31]。有研究發(fā)現(xiàn)，ciRS-7 上調(diào)或miR-7 敲除會損害斑馬魚中腦的發(fā)育[29]。同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶3（Homeodomain-Interacting Protein Kinases-3，HIPK3）基因來源的circ RNA 稱之為circ HIPK3，可與miR-124 結(jié)合，抑制miR-124 活性[32]。同時，circ HIPK3可吸附miR-558，并通過其靶向mRNA 抑制膀胱癌細胞肝素酶的表達[33]。此外，circ MTO1 能夠通過吸附促癌miR-9，促進肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1（p21）表達，抑制HCC 增殖，提示circ MTO1 是治療HCC 的一個潛在靶點[34]?？傊琧irc RNA 在疾病過程中起重要調(diào)控作用，可為疾病的檢測及治療提供新思路。

1.3.2 與蛋白質(zhì)的相互作用 circ RNA 可與蛋白質(zhì)相互作用，參與基因的表達調(diào)控。正常情況下，細胞周期蛋白依賴性激酶2（Cyclin Dependent Kinase 2，CDK2）與細胞周期蛋白結(jié)合推動細胞周期進程，而circ-Foxo3可與CDK2、p21 結(jié)合形成circ-Foxo3-p21-CDK2 三元復(fù)合物，阻礙CDK2 的功能，從而阻滯了細胞周期運行[35-36]。Abdelmohsen 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，circ PABPN1可抑制RNA 結(jié)合蛋白HUR 與核內(nèi)poly(A)結(jié)合蛋白1（PABPN1）mRNA 的結(jié)合，降低PABPN1 mRNA 表達水平。此外，有研究發(fā)現(xiàn)盲肌蛋白（Muscleblind，MBL）的表達與circ MBL 有密切聯(lián)系，當(dāng)MBL 表達升高，circ MBL 表達增加，若MBL 表達降低，增加的circ MBL 會與MBL 結(jié)合下調(diào)其表達，控制MBL 表達水平[38]。

1.3.3 參與蛋白質(zhì)合成 目前有研究表明，若circ RNA 含有內(nèi)部核糖體進入位點序列（Internal Ribosome Entry Site，IRES）或開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），通過滾動循環(huán)擴增（Rolling Circle Amplification，RCA）翻譯為有生物活性多肽或蛋白質(zhì)[39-41]。例如，肌肉組織中的circ-ZNF609 包含一個753nt 的ORF，可以被翻譯為肌細胞分化調(diào)節(jié)蛋白[42]。此外，circ 0041407 結(jié)構(gòu)中包含了IRES，可以翻譯為嵌合蛋白[43]。

1.3.4 調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄 此外，circ RNA 還具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄等功能：在人體細胞中，ciRNA（例如ciankrd52）累積在細胞核內(nèi)，通過與RNA 聚合酶II（Pol II）相互作用，可作為Pol II 轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控因子順式調(diào)控其親本基因轉(zhuǎn)錄[10]。EIcirc RNA 在細胞核內(nèi)與U1 snRNP 相互作用，并促進親本基因轉(zhuǎn)錄[44]。隨著circ RNA 研究的不斷深入，更多的生物學(xué)功能被逐漸闡釋。

2 circ RNA 成環(huán)的影響因素

2.1 剪接體成分 剪接體是參與RNA 剪接的大分子復(fù)合物，由5 種小的細胞核RNA（small nuclear RNA，snRNA）和170 多個蛋白動態(tài)組裝而成[45]。剪接體的組成及活性對circ RNA 合成有重要影響，有研究表明，抑制核心剪接體（如SF3b/SF3a 復(fù)合體）活性可促進pre-mRNA 反向剪接，剪接體成分缺失可導(dǎo)致circ RNA表達水平上升，但影響的大小主要取決于減少的成分和circ RNA 的種類[46-47]。例如，剪接體中snRNP-U1-70K或snRNP-U1-C 缺失可使PlexA 和pasilla（ps）circ RNA 水平增加10 倍，但對Laccase2、Uex、minibrain（mnb）和CG42663 circ RNA 表達影響較小。

2.2 Pol II 的轉(zhuǎn)錄伸長率 Circ RNA 的形成依賴于剪接機制，Pol II 轉(zhuǎn)錄伸長率（Pol II Transcription Elongation Rates，Pol II TER）可影響剪接體組裝和特異性序列的剪接調(diào)控位點。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Pol II 分別攜帶能減速或加速轉(zhuǎn)錄的突變體R749H 或E1126G 轉(zhuǎn)染入細胞時，circ RNA 成環(huán)效率與Pol II TER 呈正相關(guān)，即Pol II TER 升高時，circ RNA 成環(huán)效率較高，反之則低[48]。此外，Liang 等[46]研究發(fā)現(xiàn)，抑制Pol II 的轉(zhuǎn)錄終止會促進circ RNA 形成，表明Pol II TER 升高會促進circ RNA 合成。

2.3 剪接因子 剪接因子是一種參與RNA 前體剪接過程的蛋白質(zhì)因子，對circ RNA 形成起重要作用，剪接因子可與側(cè)翼內(nèi)含子結(jié)合，加速circ RNA 反向剪接。有研究表明，可變剪切因子Quaking（QKI）在上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化過程中可促進circ RNA 合成[18]。Yu 等[49]研究發(fā)現(xiàn)，剪接因子ESRP1 在人類胚胎干細胞中促進circ BIRC6 合成。同時，在乳腺癌中，剪接因子ESRP1促進circ ANKS1B 合成[50]。此外，剪接因子ESRP1 通過與側(cè)翼內(nèi)含子結(jié)合促進circ UHRF1 環(huán)化，形成反饋循環(huán)，加速口腔鱗狀細胞癌發(fā)生[51]?？梢姡艚右蜃釉赾irc RNA 形成過程中扮演著重要角色。

2.4 轉(zhuǎn)錄速率 有研究發(fā)現(xiàn)，在RNA 合成過程中，轉(zhuǎn)錄速率會影響RNA 的折疊方式，正常轉(zhuǎn)錄過程中，RNA多采用順序折疊，按照轉(zhuǎn)錄順序進行堿基配對；若轉(zhuǎn)錄速率加快，則發(fā)生更多非順序折疊，遠端互補序列之間進行的堿基配對增加[52]。而在套索驅(qū)動環(huán)化過程中，pre-mRNA 在轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生非順序折疊，這提示circ RNA 形成可能與轉(zhuǎn)錄速度有關(guān)。

3 circ RNA 在動物腸道屏障功能作用上的研究進展

隨著研究的不斷深入，人們揭示了一部分circ RNA 的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)其可能參與人類癌癥等疾病的調(diào)控過程。與人相比，circ RNA 在動物方面的研究較少，本節(jié)對目前動物研究中，與動物腸道屏障相關(guān)的circ RNA 研究進展進行總結(jié)。

3.1 circ RNA 與腸道機械屏障 circ RNA 參與腸道損傷過程，在腸道疾病發(fā)展中起重要作用[53]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，circ Pan3 可促進腸干細胞自我更新[54]。在克羅恩病中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)患者結(jié)腸黏膜組織中存在著218 個差異表達的circ RNA[55]。Yuan 等[56]在潰瘍性結(jié)腸炎癌變模型AOM/DSS 小鼠結(jié)腸組織中發(fā)現(xiàn)有234 個circ RNA 差異表達，提示circ RNA 可能在腸道炎癥中發(fā)揮重要作用。Wang 等[57]研究表明，circ-SOD2 可能通過與封閉蛋白8（CLDN-8）結(jié)合或吸附相關(guān)miRNA 的方式影響?zhàn)つて琳瞎δ?，介?dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生。Ma等[58]研究發(fā)現(xiàn)，ssc-circ-009380 能在傳染性腸胃炎病毒（TGEV）感染期間吸附miR-22，激活NF-κB 通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。此外，Liu 等[59]在敗血癥大鼠腸黏膜組織中發(fā)現(xiàn)circ-0001105 表達顯著下調(diào)，而上調(diào)circ-0001105 表達后發(fā)現(xiàn)，腸黏膜通透性、腸道炎癥反應(yīng)及氧化損傷程度均顯著降低。綜上所述，circ RNA 可通過miRNA“海綿”作用或與目標蛋白質(zhì)結(jié)合，調(diào)控腸道黏膜通透性或介導(dǎo)腸道炎癥發(fā)生。

3.2 circ RNA 與腸道生物屏障 腸道內(nèi)微生物菌群構(gòu)成機體腸道的微生物屏障。正常情況下，腸道微生態(tài)處于平衡狀態(tài)，抵抗病原菌的黏附、定植和入侵，而腸道微生物穩(wěn)態(tài)打破會造成各種疾病發(fā)生，影響機體健康。此外，腸道菌群可通過調(diào)控circ RNA 表達，來影響機體某些功能。有研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群改變可抑制小鼠體內(nèi)mmu-circ-0000730 表達，提高mmu-miR-466i-3p 及mmu-miR-466f-3p 表 達[60]。Zhang 等[61]研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3 KO 小鼠腸道中擬桿菌門（Bacteroidetes）相對豐度與circ HIPK2 水平呈負相關(guān)，而厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度與circ HIPK2 水平呈正相關(guān)，進一步試驗發(fā)現(xiàn)，糞便微生物移植抑制NLRP3 KO 小鼠體內(nèi)circ HIPK2 表達，從而調(diào)節(jié)大腦星形膠質(zhì)細胞功能障礙。此外，機體circ RNA 的表達也可影響腸道菌群的組成。Chen 等[62]研究表明，腸道微生物組成可影響某些circ RNA 在大腦中的表達，反向試驗證明，某些circ RNA 在大腦中過表達也可影響腸道菌群組成及其后代遺傳，與對照組相比，circ NF1-419 在大腦中過表達會導(dǎo)致SAMP8 小鼠腸道菌群中擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）和藍藻菌門（Cyanobacteria）相對豐度增加，使擬桿菌屬（Bacteroides）及乳桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度發(fā)生改變。這些研究強調(diào)腸道菌群組成可影響動物機體內(nèi)某些circ RNA 表達，進而影響機體某些生物學(xué)功能。上述研究證明了circ RNA 和腸道微生物之間的關(guān)聯(lián)，同時為以后的相關(guān)研究提供參考。

3.3 circ RNA 與腸道免疫化學(xué)屏障 腸道免疫屏障由腸黏膜淋巴組織和腸道內(nèi)漿細胞分泌型抗體（S-IgA）構(gòu)成，它們通過細胞免疫和體液免疫作用防止致病性抗原對肌體的傷害。circ RNA 與腸道免疫屏障有著緊密聯(lián)系，Liu 等[59]在敗血癥大鼠腸道中發(fā)現(xiàn)上調(diào)circ-0001105的表達可降低腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1（IL-1）和白細胞介素6（IL-6）的生成。固有淋巴細胞3（ILC3）是腸內(nèi)免疫、炎癥和組織穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子，而circ Kcnt2 表達下調(diào)會導(dǎo)致小鼠腸道內(nèi)ILC3激活和結(jié)腸炎的發(fā)生[63]。此外，Liu 等[64]在敗血癥大鼠腸道中發(fā)現(xiàn)，沉默circ DNMT3B 可顯著提高白細胞介素10（IL-10）和IL-6 的水平，circ DNMT3B 被鑒定為miR-20b-5p 的靶基因，而在加入miR-20b-5p 抑制劑后IL-10、IL-6 的水平顯著下調(diào)。綜上所述，circ RNA 可通過影響腸道免疫因子的水平，進而影響腸道免疫屏障。

4 展 望

目前，人們對circ RNA 的研究還處在初始階段，在其形成、調(diào)控和功能等方面還有許多未解之謎。隨著新的研究手段的應(yīng)用，目前已經(jīng)證明，生物體細胞中擁有很多不同種類的circ RNA，盡管絕大多數(shù)circ RNA的調(diào)控機制和功能尚不清楚，但人們已經(jīng)開始探索它們的功能和作用機制。在動物腸道健康方面，目前有關(guān)circ RNA 的研究還比較少，鑒于circ RNA 在調(diào)控基因表達及蛋白合成中的重要作用，深入開展有關(guān)動物腸道健康相關(guān)circ RNA 的篩選與功能研究，可以更好地配合國家無抗養(yǎng)殖策略，提供保護畜禽腸道健康新靶點，同時，也為揭示動物腸道損傷及其發(fā)生機制提供新思路。