于 洋，房曉歡，李俊杰,2*，王志剛,2*

（1.河北農業(yè)大學動物科技學院，河北保定 071000；2.河北省牛羊胚胎技術創(chuàng)新中心，河北保定 071000）

精子凍干保存（Freeze-Drying，FD）是指利用真空冷凍干燥，使精子處于失水干燥狀態(tài)保存于室溫或低溫環(huán)境的一種技術，雖然凍干保存處理后的精子失去活力，但仍具有受精能力，這對于拯救瀕危物種具有重要意義[1-2]，甚至某些物種已經用凍干保存精子建立起精子庫。生物體未經干燥而保存在室溫中是不穩(wěn)定的，會受到微生物的降解甚至發(fā)生變性，而無水生物除了能抵抗干燥的不利環(huán)境外，還可承受冷凍、高溫、有機溶劑和電離輻射的影響。凍干保存精子可在室溫下儲存[3]，且小鼠凍干保存后的精子核可耐受-196～150℃極端溫度以及空間站上強烈的陽光輻射[4-5]。因此，凍干保存精子對于外界環(huán)境有很強的耐受性。此外，與超低溫保存相比，精子凍干保存不需要經常補充液氮，并且室溫儲存成本低廉，便于運輸，但其加工時間長、能耗高和投資成本高等缺點，尤其是凍干保存精子會因快速冷凍和強力干燥而破壞精子膜，使其失去活力，尚不能應用于人工授精和試管嬰兒，但其DNA 可被完整保留，因此可利用胞漿內單精子顯微注射（ICSI）技術將精子注射到卵母細胞中以獲得后代。但凍干保存精子的DNA極易斷裂，這成為制約該技術發(fā)展的重要瓶頸之一[6]。本文通過對精子凍干保存技術的原理、程序等進行綜述，以期為精子的長期保存提供依據。

1 精子凍干保存技術的發(fā)展

通過凍干保存技術將細胞保存于干燥狀態(tài)具有廣闊的應用前景。最初凍干保存保存的樣品主要是細菌、病毒和其他微生物，1998 年Wakayama 等[7]首次報道利用小鼠凍干保存精子進行ICSI 并獲得后代。表1 總結了一些哺乳動物的FD 精子的研究結果。

表1 不同哺乳動物的凍干精子研究結果

2 凍干保存技術原理

凍干保存技術包括冷凍和干燥兩個過程，即先將混合好的精液和凍干保存保存液冷凍，然后進行升華（初次干燥）和解吸（二次干燥），最終將溶劑減少到無法支持生物生長或產生化學反應。冷凍主要是分離溶劑和溶質，溶劑會形成冰晶，而溶質將被限制在冰晶間的空隙內。干燥過程可通過冰的升華來實現[23]，其目的是將水充分去除，以便使樣品不發(fā)生化學或生物反應而長期保存。在初次干燥過程中，冷凍干燥機的壓力降低，溫度升高，從而使樣品中的冰晶升華，隨著升華進行，樣品中的冰-氣界面逐漸消退，當所有的冰晶從樣品中升華后，初次干燥完成。但此時樣品表面仍會吸附一定的水分，可通過二次干燥提高樣品溫度和降低水蒸氣分壓來完成剩余水的最終解吸。

3 凍干保存精子的制作工藝

凍干保存精子的制作工藝主要包括精子樣品制備、凍干保存試劑處理、冷凍干燥、樣品貯存[24]。

3.1 精子凍干保存保存的關鍵試劑 凍干保存試劑一般為均勻穩(wěn)定的鹽溶液，具有適宜的滲透壓和pH，易于干燥，可提供穩(wěn)定的再水化環(huán)境。目前，最簡單的穩(wěn)定維持精子生育能力的方法是向凍干保存溶液中加入10 mmol/L Tris 和1 mmol/L EDTA，并且所需溶液pH 為8.0[25]。精子凍干保存的關鍵試劑主要有胎牛血清、核酸內切酶抑制劑、海藻糖、迷迭香酸等。

胎牛血清含有細胞生長所必需的豐富營養(yǎng)成分，是細胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基。在小鼠[7]、馬[21]和牛[17,26]等動物上均證實，凍干保存溶液中添加胎牛血清（FCS）有助于提高凍干保存精子成功率，且濃度以10%為宜。

核酸內切酶抑制劑可抑制DNA 降解，對于凍干保存精子DNA 完整性具有重要作用。2001 年，Kusakabe等[27]研發(fā)了一種含EGTA（可抑制內切酶活性）的凍干保存精子試劑，隨后Kaneko 等[9]用同樣具有內切酶活性的EDTA（乙二胺四乙酸）取代 EGTA，并證實添加少量 EDTA 有利于保持小鼠精子染色體完整性和受精能力。兔[28]和豬[29]的凍干保存精子研究證實，EDTA的效果優(yōu)于EGTA。但對馬[30]和狗[31]的凍干保存精子DNA 完整性的檢測結果均發(fā)現，EGTA 相比于EDTA更能有效防止DNA 損傷?？梢姡怂醿惹忻敢种苿┑男Ч蛭锓N而異，需根據實際情況加以選擇。

海藻糖是凍干保存精子研究中應用最廣的一類非還原性雙糖，其突出優(yōu)點是具有較高的玻璃化轉變溫度和穩(wěn)定性，能夠在極端環(huán)境下保持穩(wěn)定并保護精子細胞膜和蛋白質。Oldenhof 等[32]對馬凍干保存精子研究發(fā)現，海藻糖在凍干保存過程中會被吸收，極大地減少精子儲存過程中的DNA 降解。研究表明，小鼠凍干保存溶液中添加海藻糖可顯著提高ICSI 后2-細胞胚胎發(fā)育至囊胚的比例[33]。

迷迭香酸是天然抗氧化劑，具有抗增殖、抗自由基和抗氧化作用。在綿羊、豬、狗精子的凍干保存溶液中加入迷迭香酸均可降低精子DNA 的損傷程度，且迷迭香酸處理的凍干保存精子的囊胚發(fā)育率與常規(guī)冷凍保存精子無顯著差異[29,31,34]。

此外，凍干保存精子保存液的酸堿度對精子的凍干保存也起關鍵作用。Kaneko 等[35]報道微堿性（pH=8.0）溶液有助于保持小鼠精子染色體完整和受精能力。隨后，小鼠[8,35]、牛[18]、豬[36]、兔[15]等不同物種的多項實驗均證實凍干保存精子保存液最適pH 為8.0。

3.2 精液處理方法 用于凍干保存的精液樣品可以是新鮮或冷凍精液，其處理程序通常包括離心、洗滌等，但不同物種間存在一定差異。小鼠、豬、馬、兔、犬等動物通常采用新鮮精液進行凍干保存處理。其中，小鼠、豬和馬精液采集后通常添加稀釋液，經離心去除上清后再加入凍干保存溶液離心，以充分洗滌精子，之后將精子懸液轉移至離心管中，經預冷處理后移入冷凍干燥系統(tǒng)[20-21,32,36-37]。而兔和犬的精液采集后通常直接轉入FD 溶液中，孵育10 min 后進行冷凍干燥處理[15-16]。牛的冷凍精液質量較高且實現了商業(yè)化，因此對牛精子的FD 處理既可采用冷凍-解凍精液[17-18]也可利用新鮮精液[26]。

3.3 精子凍干保存壓力和時間 凍干保存包括冷凍、初次干燥和二次干燥3 個階段。真空狀態(tài)下更有利于冰的升華，因此凍干保存過程要在真空中進行。真空壓力和干燥時間的相互作用會影響精子干燥程度，進而對凍干保存精子產生較大影響[24]。不同物種精子凍干保存過程所需的壓力和時間如表2 所示。Kawase 等[10]研究表明，真空壓力對于小鼠精子的初次干燥至關重要，當真空壓力為0.37 mbar 時，囊胚發(fā)育率顯著高于0.04 和1.03 mbar。Kwon 等[20]研究發(fā)現，將豬精子凍干保存處理時間從4 h 延長至24 h，會大大降低凍干保存精子的胚胎發(fā)育能力。

表2 不同物種的精子FD 壓力與時間一覽表

3.4 凍干保存精子的貯存溫度和時間 有研究表明，小鼠凍干保存精子分別在4℃和25℃中存儲3 個月，均不影響其受精后胚胎的發(fā)育能力[7]。同樣，兔FD 精子分別在4℃與25℃中保存8 個月也不影響其DNA 完整性[28]。但Kwon 等[20]研究發(fā)現，豬凍干保存精子儲存于25℃中與儲存在4℃相比，ICSI 后胚胎發(fā)育率顯著降低，且無法發(fā)育至囊胚。同樣，儲存在4℃的狗凍干保存精子DNA 損傷率也顯著低于22℃[31]?？梢?，低溫更有利于凍干保存精子貯存，且4℃保存更經濟，更有利于長期儲存和運輸，是保存凍干保存精子的理想溫度。

4 存在的問題與研究方向

迄今為止，除嚙齒類動物外，利用凍干保存精子尚未達到令人滿意的效果。諸多因素影響了凍干保存精子在家畜中的應用，尤其是冷凍過程因冰晶形成、滲透脫水和機械力的作用，可能導致精子發(fā)生不可逆的結構變化。在今后研究中，可針對不同物種的特性，深入研究如何改善緩沖液組成以制備理想的凍干保存精子保存液。此外，應對凍干保存過程中的壓力、溫度和時間的改進，將有助于凍干保存精子的長期保存。另外，進一步改善ICSI 技術，提高注入凍干保存精子后卵母細胞的發(fā)育能力，最大限度地減少技術本身對卵母細胞的損傷，提高其后續(xù)的激活能力，也有利于凍干保存精子的應用。