亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        3所綜合性醫(yī)院分離的多重耐藥銅綠假單胞菌外排泵MexAB-OprM的表達(dá)分析

        2021-11-18 09:19:22馮金鑫張瑞琴
        西北藥學(xué)雜志 2021年5期
        關(guān)鍵詞:環(huán)丙沙星米卡外排

        馮金鑫,張瑞琴

        (1.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,太原 030001;2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部,太原 030001)

        銅綠假單胞菌(PA)對多種抗菌藥物表現(xiàn)為固有或獲得性耐藥,在呼吸科和ICU感染率較高,免疫力低下患者易被感染[1]。近年來,由于臨床診療手段的提高以及抗生素的不合理使用,使多重耐藥PA的分離率增加[2]。研究表明,PA的耐藥機(jī)制包括產(chǎn)生抗生素滅活酶或修飾酶[3]、外膜的滲透性降低及通道蛋白缺失[4]、形成生物膜及主動外排系統(tǒng)[5]等。主動外排泵在PA的耐藥機(jī)制中起重要作用,在所報道的外排泵中,MexAB-OprM的作用尤為明顯,其具有廣泛的底物特異性,會造成PA對多種類型的抗生素天然耐藥[6]。本課題組采用實(shí)時熒光定量PCR (RT-PCR)法檢測臨床分離多重耐藥PA外排泵表達(dá)情況,探討多重耐藥與外排泵之間的關(guān)系,同時檢測調(diào)控基因mexR、nalC和nalD,觀察基因突變與表達(dá)之間的關(guān)系,以期為臨床治療提供理論依據(jù)。

        1 儀器與材料

        1.1儀器 Cytation酶標(biāo)儀(美國 Biotek公司);DYY-7C型電泳儀(北京市六一儀器廠);熒光定量PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)。

        1.2試藥 哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(濟(jì)南百博生物技術(shù)股份有限公司);外排泵抑制劑苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰(Sigma公司);抗菌藥物頭孢他啶、頭孢哌酮舒巴坦、氨曲南、亞胺培南、阿米卡星和環(huán)丙沙星,均購自中國食品藥品檢定研究院;Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、柱式細(xì)菌總RNA抽提純化試劑盒,均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

        1.3菌株來源 收集2018年7月~2019年7月山西省太原市3所綜合性醫(yī)院分離的多重耐藥PA 31株。菌株均經(jīng)過基質(zhì)輔助的激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)鑒定。質(zhì)控菌株為ATCC27853,購自中華人民共和國衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。對照株野生型銅綠假單胞菌(PAO1),購自南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子微生物學(xué)與微生物工程實(shí)驗(yàn)室。

        2 方法

        2.1抗菌藥物敏感性試驗(yàn)與最小抑菌濃度(MIC) 根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會指南(CLSI2020)[7],利用肉湯稀釋法進(jìn)行頭孢他啶、頭孢哌酮舒巴坦、亞胺培南、環(huán)丙沙星、阿米卡星和氨曲南的敏感性試驗(yàn)。對3種或3種以上的抗菌藥物同時耐藥定義為多重耐藥。耐藥指數(shù)用耐藥的抗生素種類數(shù)與送檢的抗生素種類數(shù)的比值表示。將PA ATCC27853作為抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的質(zhì)控菌株。

        2.2主動外排泵的表型篩選試驗(yàn) 根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會指南(CLSI2020),加外排泵抑制劑苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺(PAβN,最終質(zhì)量濃度為50 mg·L-1),再次利用肉湯稀釋法測定每株菌對頭孢他啶、頭孢哌酮舒巴坦、亞胺培南、環(huán)丙沙星、阿米卡星和氨曲南的MIC。如果加上外排泵抑制劑后,MIC值降低,表明外排泵表型篩選為陽性[8]。

        2.3膜融合蛋白基因mexA的mRNA表達(dá)水平測定 將PA接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基,過夜培養(yǎng),嚴(yán)格按照柱式細(xì)菌總RNA抽提純化試劑盒說明書提取PA總RNA。用紫外分光光度計測定D260/280(RNA濃度)、D260/230(RNA濃度),根據(jù)測定值計算mRNA濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,反應(yīng)條件設(shè)置為25 ℃ 5 min、55 ℃ 15 min、85 ℃ 5 min,處理后,放置于冰上[9]。熒光定量PCR儀檢測mexA的mRNA表達(dá)水平,引物序列根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計,見表1,由上海生工科技公司合成[10]。每株細(xì)菌的目的基因及內(nèi)參基因均做3個復(fù)孔,取平均每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct)值,實(shí)驗(yàn)菌株目的基因mexA表達(dá)量是相對于PA ATCC27853目的基因mexA的表達(dá)量計算得出的(定義ATCC27853的目的基因mexA的表達(dá)量為1),將mexA基因的表達(dá)量較對照株表達(dá)量≥2倍定義為高表達(dá)菌株[11]。反應(yīng)條件設(shè)置為95 ℃ 3 min 預(yù)變性,95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,95 ℃ 15 s,共進(jìn)行40個循環(huán),采用2-△△Ct進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的計算,△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組。

        2.4PCR擴(kuò)增調(diào)控基因mexR、nalC和nalD及測序 將外排泵表型為高表達(dá)的7株P(guān)A接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基,過夜培養(yǎng),嚴(yán)格按照Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取PA總DNA。反應(yīng)體系為25 μL 2×San Taq PCR Mix,5 μL DNA模板,2 μL上下游引物,15 μL Sterilized dd H2O,引物序列見表1。反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃ 5 min,變性94 ℃ 40 s,退火50 ℃ 60 s,72 ℃延升 60 s,進(jìn)行30個循環(huán),最后72 ℃延升10 min[12]。PCR產(chǎn)物送上海生工科技公司純化并測序,將測序結(jié)果與Genbank中PAO1序列進(jìn)行比較。

        表1 擴(kuò)增產(chǎn)物mexA、mexR、nalC和nalD的引物序列

        2.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,計數(shù)資料以率表示,多重耐藥指數(shù)與外排泵表達(dá)量相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        3 結(jié)果

        3.1菌株臨床信息 31株多重耐藥的PA來自3所綜合性教學(xué)醫(yī)院,其中26株(83.9%)來源于男性,5株來源于女性。送檢標(biāo)本中,11株(35.5%)來源于痰液,4株(12.9%)來源于尿液,9株(29.0%)來源于分泌物,2株(6.5%)來源于導(dǎo)管尖端,5株(16.1%)來源于血液。送檢標(biāo)本中,來自燒傷科12株(38.7%),重癥醫(yī)學(xué)科9株(29.0%),神經(jīng)外科3株(9.7%),心血管內(nèi)科7株(22.6%)。

        3.2抗生素敏感性試驗(yàn) 臨床收集的 31株P(guān)A均屬于多重耐藥菌,分離出的PA對環(huán)丙沙星完全耐藥(100%),對氨基糖苷類阿米卡星的耐藥率較低(64.5%),見表2。

        表2 菌株對抗生素敏感性試驗(yàn)結(jié)果

        3.3主動外排泵的表型篩選 加入外排泵抑制劑PAβN時,耐環(huán)丙沙星、頭孢他啶、氨曲南、頭孢哌酮舒巴坦、亞胺培南、阿米卡星的PA外排泵表型篩選陽性率分別為96.8%、44.8%、41.4%、41.4%、40.0%、10.0%。見表3。

        表3 加外排泵抑制劑PAβ N菌株MIC變化情況

        3.4多重耐藥、外排泵表達(dá)和調(diào)控基因mexR、nalC、nalD突變分析 7株P(guān)A多重耐藥指數(shù)范圍為0.83~1.00(0.94±0.08),其中4株屬于完全耐藥。以PAO1為對照菌,mexB相對表達(dá)量范圍為1.56~10.03(2.29±0.60),4株屬于外排泵的高表達(dá)。多重耐藥指數(shù)與外排泵表達(dá)量之間相關(guān)系數(shù)為0.225,且P<0.05,表明多重耐藥與外排泵表達(dá)量之間具有相關(guān)性,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序并與Genbank中公布的序列比對,有7株P(guān)A發(fā)生基因突變,其中mexR突變有2株,nalC突變有7株,nalD突變有3株。見表4。

        表4 耐藥指數(shù)、外排泵表達(dá)量和調(diào)控基因mexR、nalC和nalD突變分析

        4 討論

        PA是醫(yī)院常見的條件致病菌,易在潮濕環(huán)境中生長,氧氣濕化瓶、淋浴頭等常會被PA污染,是造成院內(nèi)感染暴發(fā)的主要原因。由于臨床經(jīng)驗(yàn)性用藥以及抗菌藥物的不合理使用,PA極易發(fā)生由敏感菌向耐藥菌的迅速轉(zhuǎn)變。因此,從細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制進(jìn)行分析,對指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用抗菌藥物具有十分重要的意義[13]。

        本研究對來自3所綜合性教學(xué)醫(yī)院分離的31株多重耐藥的PA進(jìn)行外排泵MexAB-OprM基因分析。標(biāo)本主要來源于燒傷科和重癥醫(yī)學(xué)科,這2個科室的患者有其自身的特點(diǎn):重癥醫(yī)學(xué)科患者病情危重,侵入性治療較多,且自身免疫力低下,抗生素應(yīng)用較多,因而成為多重耐藥PA的主要人群[14];燒傷科患者大多由于皮膚黏膜大量損傷而失去屏障,易導(dǎo)致環(huán)境或皮膚表面的條件致病菌入血,住院時間長,普遍使用廣譜抗菌藥物,極易感染多重耐藥菌,而多重耐藥PA給臨床治療帶來極大困難[15]。

        多重耐藥PA的耐藥機(jī)制極為復(fù)雜,細(xì)胞膜通透性降低、鈍化酶產(chǎn)生、外排泵產(chǎn)生、通過染色體變異及質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得耐藥基因、生物膜的產(chǎn)生等[16]。本文針對外排泵的耐藥機(jī)制進(jìn)行研究,聯(lián)合外排泵抑制劑PAβN進(jìn)行外排泵的表型篩選試驗(yàn),結(jié)果顯示,耐環(huán)丙沙星PA外排泵表型篩選陽性率最高(96.8%),提示環(huán)丙沙星的耐藥機(jī)制以產(chǎn)外排泵為主,與Goli H R等[17]研究結(jié)果相似。研究表明,氨基糖苷類藥物的耐藥機(jī)制主要取決于氨基糖苷類藥物修飾酶,它主要通過共價修飾的方式使氨基糖苷類藥物與核糖體的結(jié)合減少,從而導(dǎo)致耐藥。本研究發(fā)現(xiàn),耐阿米卡星PA外排泵表型篩選陽性率最低(10.0%),進(jìn)一步證實(shí)外排泵產(chǎn)生在氨基糖苷類的耐藥機(jī)制中發(fā)揮的作用較小[18]。

        耐藥指數(shù)表示菌株的耐藥程度,0表示待測菌株對所測的抗生素全部敏感,1表示完全耐藥。本研究對選擇的7株耐藥指數(shù)高且平均值為0.94的PA進(jìn)行膜融合蛋白基因mexA的mRNA表達(dá)量分析,結(jié)果顯示,其外排泵MexAB-OprM相對表達(dá)量均較高,且多重耐藥指數(shù)和外排泵表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)為0.225,表明多重耐藥與外排泵表達(dá)量之間具有相關(guān)性。為了進(jìn)一步研究MexAB-OprM高表達(dá)機(jī)制,對7株P(guān)A的mexR、nalC和nalD基因產(chǎn)物進(jìn)行測序,2株發(fā)生mexR突變,7株發(fā)生nalC突變,3株發(fā)生nalD突變,且出現(xiàn)氨基酸的替換。結(jié)果顯示,Pa12 mexR基因在377位由T突變成A,導(dǎo)致纈氨酸突變?yōu)楣劝彼?,與Ziha-Zarifi I等[19]的研究結(jié)果一致;Pa12和Pa16在nalC基因212位由G突變?yōu)锳,導(dǎo)致甘氨酸突變?yōu)楣劝彼?,?25位A突變?yōu)镃,導(dǎo)致絲氨酸突變?yōu)榫彼?,這種類型的突變與Pan Y P等[20]的研究結(jié)果一致;Pa6、Pa15、Pa23和Pa24在147位由G突變?yōu)锳,導(dǎo)致天冬氨酸突變?yōu)樘於0?。氨基酸的替換會影響阻遏蛋白mexR、nalC和nalD的結(jié)構(gòu),使其不能與操縱子結(jié)合,從而導(dǎo)致主動外排泵的高表達(dá),導(dǎo)致對多種抗菌藥物耐藥。

        外排泵MexAB-OprM在多重耐藥PA中起著重要作用,外排泵調(diào)控基因突變可導(dǎo)致MexAB-OprM表達(dá)增強(qiáng),從而形成獲得性耐藥。因此,對本地區(qū)3所綜合醫(yī)院多重耐藥PA進(jìn)行監(jiān)測,了解耐藥菌株的特點(diǎn),為臨床醫(yī)生合理選用抗菌藥物提供科學(xué)依據(jù)。

        猜你喜歡
        環(huán)丙沙星米卡外排
        新型Z型TiO2/Ag/Ag3PO4光催化劑的設(shè)計及其降解環(huán)丙沙星性能研究
        米卡芬凈對光滑假絲酵母菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)活性的影響
        原始表現(xiàn)主義的畫像——沃爾特·米卡作品欣賞
        膠東國際機(jī)場1、4號外排渠開挖支護(hù)方案研究
        外排體促進(jìn)骨再生的研究進(jìn)展
        三排式吻合器中的雙吻合釘推進(jìn)器對
        腸桿菌科細(xì)菌環(huán)丙沙星耐藥株與敏感株耐藥性分析
        環(huán)丙沙星在鹽堿土中吸附特性的研究
        Co2+催化超聲/H2O2降解環(huán)丙沙星
        配偶米卡
        激情内射人妻1区2区3区| caoporon国产超碰公开| 熟妇人妻丰满少妇一区| 亚洲一二三区免费视频| 天堂中文最新版在线中文| 亚洲综合无码一区二区| 亚洲国产精品综合福利专区 | 国产午夜精品一区二区三区视频| 久久99热精品免费观看麻豆| 亚洲一区二区三区高清在线观看| 亚洲小说图区综合在线| 波多野结衣有码| av网站可以直接看的| 一区二区三区国产在线视频| 国产精品无码一区二区在线看 | 国产91精品在线观看| 欧美国产综合欧美视频| 久久亚洲sm情趣捆绑调教| 国产美女亚洲精品一区| 亚洲最大一区二区在线观看| 精品丰满人妻无套内射| 亚洲人成网站在线播放观看| 五月停停开心中文字幕| 亚洲大尺度无码无码专区| 国产呦系列呦交| 欧洲国产成人精品91铁牛tv| 久久精品国产亚洲av久五月天| 97久久精品人妻人人搡人人玩| 99久久综合狠狠综合久久| 亚洲日本人妻中文字幕| 蜜桃一区二区三区视频| 一本一道波多野结衣av中文| 亚洲AV综合A∨一区二区| 亚洲偷自拍国综合第一页国模| 亚洲人精品午夜射精日韩| 欧美极品少妇性运交| 在线观看视频日本一区二区三区| 丝袜美腿亚洲第一免费| 国产成人av片在线观看| 99精品欧美一区二区三区美图| 一区二区精品天堂亚洲av|