馮金鑫，張瑞琴

(1.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，太原 030001)

銅綠假單胞菌(PA)對多種抗菌藥物表現(xiàn)為固有或獲得性耐藥，在呼吸科和ICU感染率較高，免疫力低下患者易被感染[1]。近年來，由于臨床診療手段的提高以及抗生素的不合理使用，使多重耐藥PA的分離率增加[2]。研究表明，PA的耐藥機(jī)制包括產(chǎn)生抗生素滅活酶或修飾酶[3]、外膜的滲透性降低及通道蛋白缺失[4]、形成生物膜及主動(dòng)外排系統(tǒng)[5]等。主動(dòng)外排泵在PA的耐藥機(jī)制中起重要作用，在所報(bào)道的外排泵中，MexAB-OprM的作用尤為明顯，其具有廣泛的底物特異性，會(huì)造成PA對多種類型的抗生素天然耐藥[6]。本課題組采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-PCR)法檢測臨床分離多重耐藥PA外排泵表達(dá)情況,探討多重耐藥與外排泵之間的關(guān)系，同時(shí)檢測調(diào)控基因mexR、nalC和nalD，觀察基因突變與表達(dá)之間的關(guān)系，以期為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 Cytation酶標(biāo)儀(美國 Biotek公司)；DYY-7C型電泳儀(北京市六一儀器廠)；熒光定量PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)。

1.2試藥 哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(濟(jì)南百博生物技術(shù)股份有限公司)；外排泵抑制劑苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰(Sigma公司)；抗菌藥物頭孢他啶、頭孢哌酮舒巴坦、氨曲南、亞胺培南、阿米卡星和環(huán)丙沙星，均購自中國食品藥品檢定研究院；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、柱式細(xì)菌總RNA抽提純化試劑盒，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3菌株來源 收集2018年7月～2019年7月山西省太原市3所綜合性醫(yī)院分離的多重耐藥PA 31株。菌株均經(jīng)過基質(zhì)輔助的激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)鑒定。質(zhì)控菌株為ATCC27853，購自中華人民共和國衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。對照株野生型銅綠假單胞菌(PAO1)，購自南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子微生物學(xué)與微生物工程實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1抗菌藥物敏感性試驗(yàn)與最小抑菌濃度(MIC) 根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)指南(CLSI2020)[7]，利用肉湯稀釋法進(jìn)行頭孢他啶、頭孢哌酮舒巴坦、亞胺培南、環(huán)丙沙星、阿米卡星和氨曲南的敏感性試驗(yàn)。對3種或3種以上的抗菌藥物同時(shí)耐藥定義為多重耐藥。耐藥指數(shù)用耐藥的抗生素種類數(shù)與送檢的抗生素種類數(shù)的比值表示。將PA ATCC27853作為抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的質(zhì)控菌株。

2.2主動(dòng)外排泵的表型篩選試驗(yàn) 根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)指南(CLSI2020)，加外排泵抑制劑苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺(PAβN，最終質(zhì)量濃度為50 mg·L-1),再次利用肉湯稀釋法測定每株菌對頭孢他啶、頭孢哌酮舒巴坦、亞胺培南、環(huán)丙沙星、阿米卡星和氨曲南的MIC。如果加上外排泵抑制劑后，MIC值降低，表明外排泵表型篩選為陽性[8]。

2.3膜融合蛋白基因mexA的mRNA表達(dá)水平測定 將PA接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，嚴(yán)格按照柱式細(xì)菌總RNA抽提純化試劑盒說明書提取PA總RNA。用紫外分光光度計(jì)測定D260/280(RNA濃度)、D260/230(RNA濃度)，根據(jù)測定值計(jì)算mRNA濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件設(shè)置為25 ℃ 5 min、55 ℃ 15 min、85 ℃ 5 min，處理后，放置于冰上[9]。熒光定量PCR儀檢測mexA的mRNA表達(dá)水平，引物序列根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，見表1，由上海生工科技公司合成[10]。每株細(xì)菌的目的基因及內(nèi)參基因均做3個(gè)復(fù)孔，取平均每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct)值，實(shí)驗(yàn)菌株目的基因mexA表達(dá)量是相對于PA ATCC27853目的基因mexA的表達(dá)量計(jì)算得出的(定義ATCC27853的目的基因mexA的表達(dá)量為1)，將mexA基因的表達(dá)量較對照株表達(dá)量≥2倍定義為高表達(dá)菌株[11]。反應(yīng)條件設(shè)置為95 ℃ 3 min 預(yù)變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，95 ℃ 15 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，采用2-△△Ct進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算，△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組。

2.4PCR擴(kuò)增調(diào)控基因mexR、nalC和nalD及測序 將外排泵表型為高表達(dá)的7株P(guān)A接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，嚴(yán)格按照Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取PA總DNA。反應(yīng)體系為25 μL 2×San Taq PCR Mix，5 μL DNA模板，2 μL上下游引物，15 μL Sterilized dd H2O，引物序列見表1。反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃ 5 min,變性94 ℃ 40 s，退火50 ℃ 60 s，72 ℃延升 60 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延升10 min[12]。PCR產(chǎn)物送上海生工科技公司純化并測序，將測序結(jié)果與Genbank中PAO1序列進(jìn)行比較。

表1 擴(kuò)增產(chǎn)物mexA、mexR、nalC和nalD的引物序列

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料以率表示，多重耐藥指數(shù)與外排泵表達(dá)量相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1菌株臨床信息 31株多重耐藥的PA來自3所綜合性教學(xué)醫(yī)院，其中26株(83.9%)來源于男性，5株來源于女性。送檢標(biāo)本中，11株(35.5%)來源于痰液，4株(12.9%)來源于尿液，9株(29.0%)來源于分泌物，2株(6.5%)來源于導(dǎo)管尖端，5株(16.1%)來源于血液。送檢標(biāo)本中，來自燒傷科12株(38.7%)，重癥醫(yī)學(xué)科9株(29.0%)，神經(jīng)外科3株(9.7%)，心血管內(nèi)科7株(22.6%)。

3.2抗生素敏感性試驗(yàn) 臨床收集的 31株P(guān)A均屬于多重耐藥菌，分離出的PA對環(huán)丙沙星完全耐藥(100%)，對氨基糖苷類阿米卡星的耐藥率較低(64.5%)，見表2。

表2 菌株對抗生素敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3.3主動(dòng)外排泵的表型篩選 加入外排泵抑制劑PAβN時(shí)，耐環(huán)丙沙星、頭孢他啶、氨曲南、頭孢哌酮舒巴坦、亞胺培南、阿米卡星的PA外排泵表型篩選陽性率分別為96.8%、44.8%、41.4%、41.4%、40.0%、10.0%。見表3。

表3 加外排泵抑制劑PAβ N菌株MIC變化情況

3.4多重耐藥、外排泵表達(dá)和調(diào)控基因mexR、nalC、nalD突變分析 7株P(guān)A多重耐藥指數(shù)范圍為0.83～1.00(0.94±0.08)，其中4株屬于完全耐藥。以PAO1為對照菌，mexB相對表達(dá)量范圍為1.56～10.03(2.29±0.60)，4株屬于外排泵的高表達(dá)。多重耐藥指數(shù)與外排泵表達(dá)量之間相關(guān)系數(shù)為0.225，且P<0.05,表明多重耐藥與外排泵表達(dá)量之間具有相關(guān)性，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序并與Genbank中公布的序列比對，有7株P(guān)A發(fā)生基因突變，其中mexR突變有2株，nalC突變有7株，nalD突變有3株。見表4。

表4 耐藥指數(shù)、外排泵表達(dá)量和調(diào)控基因mexR、nalC和nalD突變分析

4 討論

PA是醫(yī)院常見的條件致病菌，易在潮濕環(huán)境中生長，氧氣濕化瓶、淋浴頭等常會(huì)被PA污染，是造成院內(nèi)感染暴發(fā)的主要原因。由于臨床經(jīng)驗(yàn)性用藥以及抗菌藥物的不合理使用，PA極易發(fā)生由敏感菌向耐藥菌的迅速轉(zhuǎn)變。因此，從細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制進(jìn)行分析，對指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用抗菌藥物具有十分重要的意義[13]。

本研究對來自3所綜合性教學(xué)醫(yī)院分離的31株多重耐藥的PA進(jìn)行外排泵MexAB-OprM基因分析。標(biāo)本主要來源于燒傷科和重癥醫(yī)學(xué)科，這2個(gè)科室的患者有其自身的特點(diǎn)：重癥醫(yī)學(xué)科患者病情危重，侵入性治療較多，且自身免疫力低下，抗生素應(yīng)用較多，因而成為多重耐藥PA的主要人群[14]；燒傷科患者大多由于皮膚黏膜大量損傷而失去屏障，易導(dǎo)致環(huán)境或皮膚表面的條件致病菌入血，住院時(shí)間長，普遍使用廣譜抗菌藥物，極易感染多重耐藥菌，而多重耐藥PA給臨床治療帶來極大困難[15]。

多重耐藥PA的耐藥機(jī)制極為復(fù)雜，細(xì)胞膜通透性降低、鈍化酶產(chǎn)生、外排泵產(chǎn)生、通過染色體變異及質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得耐藥基因、生物膜的產(chǎn)生等[16]。本文針對外排泵的耐藥機(jī)制進(jìn)行研究，聯(lián)合外排泵抑制劑PAβN進(jìn)行外排泵的表型篩選試驗(yàn)，結(jié)果顯示，耐環(huán)丙沙星PA外排泵表型篩選陽性率最高(96.8%)，提示環(huán)丙沙星的耐藥機(jī)制以產(chǎn)外排泵為主，與Goli H R等[17]研究結(jié)果相似。研究表明，氨基糖苷類藥物的耐藥機(jī)制主要取決于氨基糖苷類藥物修飾酶，它主要通過共價(jià)修飾的方式使氨基糖苷類藥物與核糖體的結(jié)合減少，從而導(dǎo)致耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)，耐阿米卡星PA外排泵表型篩選陽性率最低(10.0%)，進(jìn)一步證實(shí)外排泵產(chǎn)生在氨基糖苷類的耐藥機(jī)制中發(fā)揮的作用較小[18]。

耐藥指數(shù)表示菌株的耐藥程度，0表示待測菌株對所測的抗生素全部敏感，1表示完全耐藥。本研究對選擇的7株耐藥指數(shù)高且平均值為0.94的PA進(jìn)行膜融合蛋白基因mexA的mRNA表達(dá)量分析，結(jié)果顯示，其外排泵MexAB-OprM相對表達(dá)量均較高，且多重耐藥指數(shù)和外排泵表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)為0.225，表明多重耐藥與外排泵表達(dá)量之間具有相關(guān)性。為了進(jìn)一步研究MexAB-OprM高表達(dá)機(jī)制，對7株P(guān)A的mexR、nalC和nalD基因產(chǎn)物進(jìn)行測序，2株發(fā)生mexR突變，7株發(fā)生nalC突變，3株發(fā)生nalD突變，且出現(xiàn)氨基酸的替換。結(jié)果顯示，Pa12 mexR基因在377位由T突變成A,導(dǎo)致纈氨酸突變?yōu)楣劝彼幔cZiha-Zarifi I等[19]的研究結(jié)果一致；Pa12和Pa16在nalC基因212位由G突變?yōu)锳，導(dǎo)致甘氨酸突變?yōu)楣劝彼幔?25位A突變?yōu)镃，導(dǎo)致絲氨酸突變?yōu)榫彼?，這種類型的突變與Pan Y P等[20]的研究結(jié)果一致；Pa6、Pa15、Pa23和Pa24在147位由G突變?yōu)锳，導(dǎo)致天冬氨酸突變?yōu)樘於０?。氨基酸的替換會(huì)影響阻遏蛋白mexR、nalC和nalD的結(jié)構(gòu)，使其不能與操縱子結(jié)合，從而導(dǎo)致主動(dòng)外排泵的高表達(dá)，導(dǎo)致對多種抗菌藥物耐藥。

外排泵MexAB-OprM在多重耐藥PA中起著重要作用，外排泵調(diào)控基因突變可導(dǎo)致MexAB-OprM表達(dá)增強(qiáng)，從而形成獲得性耐藥。因此，對本地區(qū)3所綜合醫(yī)院多重耐藥PA進(jìn)行監(jiān)測，了解耐藥菌株的特點(diǎn)，為臨床醫(yī)生合理選用抗菌藥物提供科學(xué)依據(jù)。