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        固本化瘀法對2型糖尿病大鼠足細胞損傷及信號通路的影響

        2021-11-18 09:18:58軍,李
        西北藥學(xué)雜志 2021年5期
        關(guān)鍵詞:化瘀腎臟腎病

        陸 軍,李 紅

        (1.山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科,太原 030013;2.山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腎病二科,太原 030013)

        糖尿病腎病是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥,也是終末期腎臟病常見的病因之一[1],發(fā)病機制復(fù)雜且缺乏有效的防治手段。足細胞損傷是貫穿糖尿病腎病的病理環(huán)節(jié),高糖及糖基化終末產(chǎn)物刺激、炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)激活等可造成腎病蛋白(nephrin)、足細胞蛋白(podocin)和CD2相關(guān)蛋白(CD2AP)等足細胞標(biāo)志分子表達下調(diào),進而造成足細胞損傷、腎小球濾過膜通透性增加并產(chǎn)生蛋白尿[2-4]。中醫(yī)認為糖尿病腎病屬于“消渴”、“尿濁”、“虛勞”范疇,病機總屬本虛標(biāo)實,本虛指脾腎虧虛,標(biāo)實指痰濕血瘀,根據(jù)病機主張給予固本化瘀方進行治療。相關(guān)細胞實驗發(fā)現(xiàn),固本化瘀法含藥血清對高糖引起的足細胞損傷具有保護作用[5];另有多囊卵巢綜合征及胰島素抵抗相關(guān)的研究證實,固本化瘀法能夠促進大鼠體內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (PI3K/Akt)通路激活[6]?;诖?,本研究將以2型糖尿病大鼠作為實驗對象,觀察固本化瘀法對大鼠足細胞損傷及PI3K/Akt通路的影響,旨在探究固本化瘀法在糖尿病腎病防治中的作用及機制。

        1 儀器與材料

        1.1儀器 全自動生化分析儀(GE公司);正置顯微鏡(Nikon公司);熒光定量PCR儀(Bio-rad公司);凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司)。

        1.2試藥 HE染色試劑盒(上海碧云天公司);RNA提取、cDNA第一鏈合成、熒光定量PCR試劑盒,均購自北京天根生化公司;p-PI3K和p-Akt一抗,均購自Abcam公司。固本化瘀方的藥材包括鹿角膠、龜甲膠、枸杞、黨參、淫羊 董、巴戟天、川斷、當(dāng)歸、丹參、莪術(shù)、三棱、蒼術(shù)、香附、膽 南星、茯苓、陳皮和半夏,由本院藥劑科采購,按每毫升生藥含量25、15、5 g制備濃煎藥汁,待使用時進行稀釋。

        1.3動物 成年雄性SD大鼠,湖南嘉泰實驗動物有限公司,體質(zhì)量為180~200 g,動物實驗許可證號:SCXK(湘) 2019-0003。

        2 方法

        2.1分組、造模及給藥 將SD大鼠隨機分為對照組、模型組及固本化瘀方低、中和高劑量組,每組各10只。對照組用普通飼料喂養(yǎng),其余各組用高脂高糖飼料喂養(yǎng);6周后禁食不禁水過夜,對照組一次性腹腔注射等體積溶媒,其余各組以65 mg·kg-1一次性腹腔注射10 g·L-1鏈脲佐菌素,1周后經(jīng)尾靜脈檢測空腹血糖(FBG)≥11.1 nmol·L-1認為造模成功。造模成功后,固本化瘀方低、中、高劑量組分別給予含有22.1、44.2、88.4 g·kg-1生藥的固本化瘀方藥液灌胃,對照組及模型組給予等體積蒸餾水灌胃,灌胃劑量為0.01 mL·g-1,每日1次,連續(xù)4周。

        2.2生化指標(biāo)檢測 末次給藥后將大鼠放入代謝籠、收集24 h尿液,采用生化分析儀檢測尿微量白蛋白(mAlb)及尿肌酐(Ucr),計算尿mAlb/Ucr;斷頭處死大鼠,立即收集血液樣本5~6 mL,離心分離血清后采用生化分析儀檢測FBG、血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)。

        2.3腎臟病理改變檢測 處死大鼠后解剖腎臟組織適量,用體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定后制作4 μm病理切片,采用HE染色試劑盒進行染色后在顯微鏡下觀察腎臟病理改變。

        2.4足細胞標(biāo)志分子mRNA表達檢測 處死大鼠后解剖腎臟組織適量,采用RNA提取試劑盒分離提取組織中的總RNA,采用cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄實驗、合成cDNA,采用熒光定量PCR試劑盒進行PCR實驗,對目的基因nephrin、podocin、CD2AP及內(nèi)參基因β-actin進行擴增,反應(yīng)體系為cDNA 2 μL、預(yù)混液 10 μL、10 μmol·L-1上游引物及下游引物各0.4 μL、去離子水補足至20.0 μL。完成PCR反應(yīng)后生成反應(yīng)的循環(huán)曲線、得到循環(huán)閾值(Ct),以β-actin為內(nèi)參,計算nephrin、podocin、CD2AP的mRNA表達水平。

        2.5p-PI3K、p-Akt蛋白表達檢測 處死大鼠后解剖腎臟組織適量,采用組織裂解液進行勻漿,提取組織蛋白,采用BCA法檢測蛋白濃度,取30 μg蛋白樣本進行電泳以分離不同相對分子質(zhì)量的蛋白,電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF),用體積分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶在室溫封閉PVDF膜1 h,用1∶1 000稀釋的p-PI3K、p-Akt一抗或1∶5 000稀釋的β-actin一抗在4 ℃孵育PVDF膜過夜,次日用1∶2 000稀釋的二抗在室溫孵育PVDF膜1 h,最后在凝膠成像儀中顯影得到p-PI3K、p-Akt及β-actin的條帶及吸光值,以β-actin的吸光值為內(nèi)參、計算p-PI3K及p-Akt的表達水平。

        3 結(jié)果

        3.1各組大鼠生化指標(biāo)比較 與對照組比較,模型組大鼠FBG、Scr、BUN和尿mAlb/Ucr均顯著升高(P<0.05);固本化瘀方低、中和高劑量組大鼠FBG與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),Scr、BUN和尿mAlb/Ucr均顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見表1。

        表1 各組大鼠生化指標(biāo)比較

        3.2各組大鼠腎臟病理改變比較 對照組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰,腎小球形態(tài)正常;模型組大鼠腎臟內(nèi)腎小球萎縮,洗膜及基底膜增厚,少量炎癥細胞浸潤;與模型組比較,低、中和高劑量組大鼠腎臟的病理改變明顯減輕。見圖1。

        圖1 各組大鼠腎臟病理改變的比較 (HE染色)

        3.3各組大鼠腎臟中足細胞標(biāo)志分子mRNA表達水平比較 與對照組比較,模型組大鼠腎臟組織中nephrin、podocin和CD2AP的mRNA表達水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,固本化瘀方低、中和高劑量組大鼠腎臟組織中nephrin、podocin和CD2AP的mRNA表達水平顯著增加(P<0.05)。結(jié)果見表2。

        表2 各組大鼠腎臟中nephrin、podocin和CD2AP的比較

        3.4各組大鼠腎臟中PI3K/Akt通路比較 與對照組比較,模型組大鼠腎臟組織p-PI3K、p-Akt的表達水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,固本化瘀方低、中和高劑量組大鼠腎臟組織中p-PI3K、p-Akt的表達水平顯著增加(P<0.05),結(jié)果見圖2和表3。

        圖2 各組大鼠腎臟中p-PI3K、p-Akt的電泳圖

        表3 各組大鼠腎臟中 p-PI3K、p-Akt的比較

        4 討論

        足細胞是位于腎小球基底膜外側(cè)的一種高度分化的終末細胞,參與腎小球濾過膜的構(gòu)成,足細胞損傷貫穿糖尿病腎病的病程始終,減輕足細胞損傷也成為近年來防治糖尿病腎病的重要靶點[7-8]。足細胞中nephrin、podocin和CD2AP等分子參與構(gòu)成足細胞裂隙膜,上述分子表達降低被視作足細胞損傷的標(biāo)志[9-12]。本研究采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)及鏈脲佐菌素腹腔注射的方式建立2型糖尿病模型,造模后檢測到Scr、BUN和尿mAlb/Ucr水平升高,腎臟出現(xiàn)了典型的糖尿病腎病病理改變且nephrin、podocin和CD2AP的表達降低,表明2型糖尿病大鼠出現(xiàn)了腎功能損害及足細胞損傷。

        根據(jù)中醫(yī)理論,糖尿病腎病的發(fā)病與陰陽兩虛、氣滯血瘀有關(guān),固本化瘀法能夠通過益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、健脾固腎等發(fā)揮治療糖尿病腎病的作用[13-14]。本研究在2型糖尿病大鼠造模后給予不同劑量固本化瘀方治療,治療后Scr、BUN、尿mAlb/Ucr水平均明顯降低且腎臟病理改變明顯減輕,表明固本化瘀方能夠減輕2型糖尿病大鼠的腎臟損害。固本化瘀方相關(guān)的細胞實驗證實,該方的含藥血清能夠減輕高糖引起的足細胞損傷,本研究觀察固本化瘀方減輕2型糖尿病模型大鼠足細胞損傷的作用,結(jié)果顯示,不同劑量固本化瘀方干預(yù)后,腎臟組織中nephrin、podocin和CD2AP的表達增加,與既往文獻在離體細胞中的實驗結(jié)果[5]吻合,表明固本化瘀方能減輕2型糖尿病大鼠的足細胞損傷。

        足細胞損傷的發(fā)病機制復(fù)雜,且與PI3K/Akt通路和TGF-β/Smad通路的異常激活或抑制密切相關(guān)[15-17]。PI3K/Akt通路以磷酸化的形式發(fā)生激活,激活后具有促進細胞存活及增殖、抑制細胞凋亡的作用。相關(guān)的動物實驗及細胞實驗研究表明,糖尿病大鼠的腎臟組織中以及高糖處理的腎小球內(nèi)皮細胞及足細胞中p-PI3K和p-Akt的表達水平降低[18-20]。本研究觀察到2型糖尿病大鼠腎臟中p-PI3K、p-Akt的表達水平降低,與既往文獻報道一致。固本化瘀方具有激活PI3K/Akt通路的作用,本研究在使用不同劑量固本化瘀方干預(yù)后觀察到腎臟組織中p-PI3K和p-Akt的表達水平增加,表明固本化瘀方能夠促進2型糖尿病大鼠腎臟組織中PI3K/Akt通路的激活,這也可能是固本化瘀方減輕腎臟病理改變及足細胞損傷的分子機制。

        綜上所述,2型糖尿病大鼠存在足細胞損傷的情況,由于激活PI3K/Akt通路是固本化瘀法減輕足細胞損傷的可能分子機制,固本化瘀方干預(yù)能夠減輕2型糖尿病大鼠足細胞損傷,本研究為今后防治糖尿病腎病、減輕足細胞損傷提供了實驗依據(jù)。

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