鄧俊杰,謝浙裕*,何麗娜
(1.紹興市食品藥品檢驗研究院,紹興 312000;2.浙江大學第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學部,杭州 310000)
杞菊地黃丸(濃縮丸)現行標準為2020年版《中國藥典》一部,處方由枸杞、菊花、熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉8味中藥制成,具有滋腎養(yǎng)肝的功效。用于治療肝腎陰虧、眩暈耳鳴、羞明畏光、迎風流淚、視物昏花[1-2]。與傳統(tǒng)劑型相比,濃縮丸具有服用量少、方便攜帶等優(yōu)點。中成藥的功效是多種活性成分共同作用的結果,但查閱《中國藥典》和相關文獻[3-7],僅有高效液相色譜(HPLC)法測定酒萸肉中莫諾苷、馬錢苷和牡丹皮中丹皮酚含量的報道,缺少其余6味中藥的質量控制指標,不能全面評價其整體質量。
根據2020年版《中國藥典》和相關文獻報道[8-11],枸杞的指標成分為甜菜堿;菊花的指標成分為綠原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡?;鼘幩幔皇斓攸S的指標成分為毛蕊花糖苷;山藥的指標成分為尿囊素;茯苓的指標成分為茯苓酸;澤瀉的指標成分為23-乙酰澤瀉醇B。
本實驗使用高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜(HPLC-MS/MS)法,以多反應監(jiān)測模式進行檢測,正負離子同時掃描,具有質譜靈敏度高、準確性好、選擇性強的特點,建立了同時測定杞菊地黃丸(濃縮丸)中11種有效成分的方法。既簡化了甜菜堿的提取方式,又解決了多成分液相檢測時周期長、雜質干擾大的問題,對8味中藥的各指標成分進行了含量測定,為杞菊地黃丸(濃縮丸)的質量標準制定提供了依據[12-16]。
1.1儀器 1260-6470型高效液相-三重四級桿串聯質譜儀(美國Agilent公司);XPE26百萬分之一電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);ZM-200型超離心碾磨儀(德國Retsch公司);FESCO17型微量離心機(美國Thermo Fisher公司);HH-4A型數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)。
1.2試藥 甜菜堿(批號110894-201604,質量分數為99.2%),綠原酸(批號110753-202018,質量分數為96.1%),木犀草苷(批號111720-201810,質量分數為93.5%),3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸(批號111782-201807,質量分數為94.3%),毛蕊花糖苷(批號111530-201914,質量分數為95.2%),莫諾苷(批號111998-201703,質量分數為97.4%),馬錢苷(批號111640-201808,質量分數為99.0%),丹皮酚(批號110708-201908,質量分數為99.8%),尿囊素(批號111501-200202,質量分數為100.0%),23-乙酰澤瀉醇B(批號111846-201705,質量分數為99.7%),均購自中國食品藥品檢定研究院;茯苓酸(批號J2140009,質量分數為100.0%,ANPEL公司);甲醇和乙腈均為質譜純,均購自Merck公司;甲酸(質譜純,CNW公司);杞菊地黃丸(濃縮丸)(仲景宛西制藥股份有限公司,批號:200511、200416、190806、190417)。
2.1液相色譜-質譜條件
2.1.1色譜條件 色譜柱:Agilent Porshell EC-C18(50 mm×4.6 mm,2.7 μm)柱;流動相:乙腈-1 mL·L-1甲酸(梯度洗脫,見表1),柱溫:30 ℃,流速:0.5 mL·min-1,進樣量:2 μL。
表1 梯度洗脫方法
2.1.2質譜條件 離子源:電噴霧離子源;干燥氣和碰撞氣:氮氣(質量分數≥99.999%);干燥氣溫度:300 ℃;干燥氣流速:6 L·min-1;掃描模式:正負離子同時掃描;毛細管電壓:4 000 V(+),3 500 V(-);為提高檢測靈敏度,采用分時間段的多反應監(jiān)測(MRM)模式,電離模式、保留時間、定量離子對、碎裂電壓和碰撞能量(CE),見表2。
表2 11種成分的電離模式、保留時間、定量離子對、碎裂電壓和碰撞能量
2.2溶液的制備
2.2.1對照品溶液 稱取甜菜堿20.18 mg、綠原酸10.86 mg、木犀草苷10.98 mg、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸15.28 mg、毛蕊花糖苷15.79 mg、尿囊素10.12 mg、茯苓酸10.83 mg、23-乙酰澤瀉醇B 15.65 mg,置于同一100 mL量瓶中,加入體積分數為70%的甲醇制得①號儲備液;分別稱取莫諾苷10.73 mg、馬錢苷20.07 mg、丹皮酚25.95 mg,置于同一25 mL量瓶中,加入體積分數為70%的甲醇制得②號儲備液。再精密量?、佟ⅱ谔杻湟焊? mL,置于同一20 mL量瓶中,加入體積分數為70%的甲醇制成混合對照品溶液。
2.2.2供試品溶液 取本品適量(批號200511),研細,取2.0 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入體積分數為70%的甲醇50 mL,密塞,稱定質量,加熱回流1 h,取出,放冷,再稱定質量,用體積分數為70%的甲醇補足減失的質量,搖勻,超高速離心,取上清液作為供試品溶液。
2.2.3陰性供試品溶液 按照處方組成及生產工藝制得缺枸杞、菊花、熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓和澤瀉的陰性供試品,按照2.2.2項下方法制得陰性供試品溶液。
2.3方法學驗證
2.3.1專屬性考察 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各2 μL,按照2.1項下色譜條件檢測,記錄質譜圖。結果供試品顯示出與對照品保留時間相同的質譜峰,陰性供試品溶液在此保留時間無質譜峰,其他組分對結果無干擾,表明該方法系統(tǒng)適用性良好。見圖1。
圖1 11種成分的提取離子流圖
2.3.2線性關系考察 精密量取2.2.1項下制備的①、②號對照品儲備液各2 mL,分別置于同一5、10、20、50、100 mL量瓶中,加體積分數為70%的甲醇稀釋至刻度,制得系列混合對照品溶液。按照2.1項下色譜條件測定,以質量濃度為橫坐標(x),峰面積為縱坐標(y),繪制標準曲線,計算得線性回歸方程,結果11種成分在各自質量濃度范圍內均呈良好線性關系。見表3。
2.3.3定量限 精密度量取2.2.1項下制備的混合對照品溶液,逐級稀釋,按照2.1項下色譜條件測定,以信噪比為10∶1對應的質量濃度為定量限下限,結果見表3。
表3 11種成分的回歸方程、線性范圍、檢測限和定量限
2.3.4精密度實驗 精密量取2.2.1項下制備的混合對照品溶液,按照2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次,結果甜菜堿、綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?;鼘幩?、毛蕊花糖苷、莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚、尿囊素、茯苓酸和23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD值分別為0.5%、0.7%、0.4%、0.9%、1.6%、0.8%、1.2%、0.9%、1.0%、1.4%、1.7%,表明儀器精密度良好。
2.3.5重復性實驗 取6份同一樣品粉末,按照2.2.2項下方法制備供試品溶液,按照2.1項下色譜條件測定,結果甜菜堿、綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?;鼘幩?、毛蕊花糖苷、莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚、尿囊素、茯苓酸和23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD值分別為0.7%、0.3%、0.5%、1.1%、1.7%、0.9%、1.9%、0.7%、1.5%、2.1%、1.3 %,表明該方法重復性良好。
2.3.6穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液,分別在0、4、8、12、24、48 h,按照2.1項下色譜條件測定,結果甜菜堿、綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?;鼘幩帷⒚锘ㄌ擒?、莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚、尿囊素、茯苓酸和23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD值分別為0.8%、0.7%、0.6%、1.4%、1.9%、0.7%、1.5%、1.2%、1.0%、1.7%、1.5%,表明穩(wěn)定性良好。
2.3.7加樣回收率實驗 精密稱取9份同一樣品粉末(批號200511),每份1.0 g,分別置于具塞錐形瓶中,3份為1組,分別加入相當于1.0 g樣品中各組分含量為80%、100%、120%的對照品,按照2.2.2項下方法制備供試品溶液,按照2.1項下色譜條件測定得甜菜堿、綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?;鼘幩?、毛蕊花糖苷、莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚、尿囊素、茯苓酸和23-乙酰澤瀉醇B的平均回收率分別為97.66%、97.32%、97.88%、97.67%、98.35%、97.52%、98.34%、98.41%、98.03%、97.81%、98.19%,RSD值分別為0.5%、1.2%、0.8%、0.5%、0.5%、0.9%、0.3%、0.5%、0.4%、0.6%、1.0%,表明該方法準確、可靠。
2.4樣品測定 精密稱定4批樣品粉末各2.0 g,按照2.2.2項下方法制備供試品溶液,精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各2 μL,按照2.1項下色譜條件測定,計算各成分含量,結果見表4。
表4 樣品含量測定結果 (n=4)
3.1檢測器的選擇 HPLC法同時檢測11種成分,存在前處理復雜、基線分離難、最大吸收波長不同等問題,而質譜法具有靈敏度高、準確性好、選擇性強、線性范圍寬的特點。此外,以多反應監(jiān)測模式進行含量測定,同時掃描正負離子對,相較于紫外檢測器,檢驗的時間更短,結果更準確。
3.2監(jiān)測離子對的選擇 質譜多反應監(jiān)測模式以特征離子為目標,選擇合適的母離子和子離子是檢測的關鍵。本實驗先以全掃描模式確定母離子,再優(yōu)化碎裂能量和碰撞能量,確定信號響應最強的子離子,最終為11種成分各確定1對定量離子。
3.3流動相的選擇 分別比較了乙腈-水、乙腈-1 mL·L-1甲酸、甲醇-水、甲醇-1 mL·L-1甲酸作為流動相的檢測結果,發(fā)現乙腈和甲醇均能達到較好的分離效果,并且乙腈較甲醇具有更強的洗脫能力和更低的洗脫壓力。少量甲酸的加入既改善了峰形,又提高了響應,因此,最終選用乙腈-1 mL·L-1甲酸作為流動相。
3.4提取溶劑的選擇 由于有效成分多為酚酸和皂苷類化合物,二者在水和甲醇中溶解度高,比較甲醇、體積分數為70%的甲醇、體積分數為50%的甲醇的提取效果,發(fā)現體積分數為70%的甲醇的提取效果最好,干擾較少,最終選用體積分數為70%的甲醇作為提取溶劑。
3.5提取方法的選擇 比較超聲和回流2種提取方法,結果顯示,在相同提取時間下,回流提取液的含量高于超聲提取液,最終選用回流提取法。
3.6提取時間的選擇 比較回流提取30、60、90 min的結果,發(fā)現提取60 min時,各成分含量基本一致,最終選用提取時間為60 min。
根據上述實驗結果,本方法具有前處理簡便、分析時間短、結果準確、檢測成分多等特點,可為杞菊地黃丸的質量控制提供參考。