鄧俊杰，謝浙裕*，何麗娜

(1.紹興市食品藥品檢驗研究院，紹興 312000；2.浙江大學第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學部，杭州 310000)

杞菊地黃丸(濃縮丸)現行標準為2020年版《中國藥典》一部,處方由枸杞、菊花、熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉8味中藥制成，具有滋腎養(yǎng)肝的功效。用于治療肝腎陰虧、眩暈耳鳴、羞明畏光、迎風流淚、視物昏花[1-2]。與傳統(tǒng)劑型相比，濃縮丸具有服用量少、方便攜帶等優(yōu)點。中成藥的功效是多種活性成分共同作用的結果，但查閱《中國藥典》和相關文獻[3-7]，僅有高效液相色譜(HPLC)法測定酒萸肉中莫諾苷、馬錢苷和牡丹皮中丹皮酚含量的報道，缺少其余6味中藥的質量控制指標，不能全面評價其整體質量。

根據2020年版《中國藥典》和相關文獻報道[8-11]，枸杞的指標成分為甜菜堿；菊花的指標成分為綠原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡?；鼘幩幔皇斓攸S的指標成分為毛蕊花糖苷；山藥的指標成分為尿囊素；茯苓的指標成分為茯苓酸；澤瀉的指標成分為23-乙酰澤瀉醇B。

本實驗使用高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜(HPLC-MS/MS)法，以多反應監(jiān)測模式進行檢測，正負離子同時掃描，具有質譜靈敏度高、準確性好、選擇性強的特點，建立了同時測定杞菊地黃丸(濃縮丸)中11種有效成分的方法。既簡化了甜菜堿的提取方式，又解決了多成分液相檢測時周期長、雜質干擾大的問題，對8味中藥的各指標成分進行了含量測定，為杞菊地黃丸(濃縮丸)的質量標準制定提供了依據[12-16]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 1260-6470型高效液相-三重四級桿串聯質譜儀(美國Agilent公司)；XPE26百萬分之一電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；ZM-200型超離心碾磨儀(德國Retsch公司)；FESCO17型微量離心機(美國Thermo Fisher公司)；HH-4A型數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)。

1.2試藥 甜菜堿(批號110894-201604，質量分數為99.2%)，綠原酸(批號110753-202018，質量分數為96.1%)，木犀草苷(批號111720-201810，質量分數為93.5%)，3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸(批號111782-201807，質量分數為94.3%)，毛蕊花糖苷(批號111530-201914，質量分數為95.2%)，莫諾苷(批號111998-201703，質量分數為97.4%)，馬錢苷(批號111640-201808，質量分數為99.0%)，丹皮酚(批號110708-201908，質量分數為99.8%)，尿囊素(批號111501-200202，質量分數為100.0%)，23-乙酰澤瀉醇B(批號111846-201705，質量分數為99.7%)，均購自中國食品藥品檢定研究院；茯苓酸(批號J2140009，質量分數為100.0%,ANPEL公司)；甲醇和乙腈均為質譜純，均購自Merck公司；甲酸(質譜純，CNW公司)；杞菊地黃丸(濃縮丸)(仲景宛西制藥股份有限公司，批號：200511、200416、190806、190417)。

2 方法與結果

2.1液相色譜-質譜條件

2.1.1色譜條件 色譜柱：Agilent Porshell EC-C18(50 mm×4.6 mm，2.7 μm)柱；流動相：乙腈-1 mL·L-1甲酸(梯度洗脫，見表1)，柱溫：30 ℃，流速：0.5 mL·min-1，進樣量：2 μL。

表1 梯度洗脫方法

2.1.2質譜條件 離子源：電噴霧離子源；干燥氣和碰撞氣：氮氣(質量分數≥99.999%)；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流速：6 L·min-1；掃描模式：正負離子同時掃描；毛細管電壓：4 000 V(+)，3 500 V(-)；為提高檢測靈敏度，采用分時間段的多反應監(jiān)測(MRM)模式，電離模式、保留時間、定量離子對、碎裂電壓和碰撞能量(CE)，見表2。

表2 11種成分的電離模式、保留時間、定量離子對、碎裂電壓和碰撞能量

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液 稱取甜菜堿20.18 mg、綠原酸10.86 mg、木犀草苷10.98 mg、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸15.28 mg、毛蕊花糖苷15.79 mg、尿囊素10.12 mg、茯苓酸10.83 mg、23-乙酰澤瀉醇B 15.65 mg，置于同一100 mL量瓶中，加入體積分數為70%的甲醇制得①號儲備液；分別稱取莫諾苷10.73 mg、馬錢苷20.07 mg、丹皮酚25.95 mg，置于同一25 mL量瓶中，加入體積分數為70%的甲醇制得②號儲備液。再精密量?、佟ⅱ谔杻湟焊? mL，置于同一20 mL量瓶中，加入體積分數為70%的甲醇制成混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液 取本品適量(批號200511)，研細，取2.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分數為70%的甲醇50 mL，密塞，稱定質量，加熱回流1 h，取出，放冷，再稱定質量，用體積分數為70%的甲醇補足減失的質量，搖勻，超高速離心，取上清液作為供試品溶液。

2.2.3陰性供試品溶液 按照處方組成及生產工藝制得缺枸杞、菊花、熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓和澤瀉的陰性供試品，按照2.2.2項下方法制得陰性供試品溶液。

2.3方法學驗證

2.3.1專屬性考察 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各2 μL，按照2.1項下色譜條件檢測，記錄質譜圖。結果供試品顯示出與對照品保留時間相同的質譜峰，陰性供試品溶液在此保留時間無質譜峰，其他組分對結果無干擾，表明該方法系統(tǒng)適用性良好。見圖1。

圖1 11種成分的提取離子流圖

2.3.2線性關系考察 精密量取2.2.1項下制備的①、②號對照品儲備液各2 mL，分別置于同一5、10、20、50、100 mL量瓶中，加體積分數為70%的甲醇稀釋至刻度，制得系列混合對照品溶液。按照2.1項下色譜條件測定，以質量濃度為橫坐標(x)，峰面積為縱坐標(y)，繪制標準曲線，計算得線性回歸方程，結果11種成分在各自質量濃度范圍內均呈良好線性關系。見表3。

2.3.3定量限 精密度量取2.2.1項下制備的混合對照品溶液，逐級稀釋，按照2.1項下色譜條件測定，以信噪比為10∶1對應的質量濃度為定量限下限，結果見表3。

表3 11種成分的回歸方程、線性范圍、檢測限和定量限

2.3.4精密度實驗 精密量取2.2.1項下制備的混合對照品溶液，按照2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，結果甜菜堿、綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、毛蕊花糖苷、莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚、尿囊素、茯苓酸和23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD值分別為0.5%、0.7%、0.4%、0.9%、1.6%、0.8%、1.2%、0.9%、1.0%、1.4%、1.7%，表明儀器精密度良好。

2.3.5重復性實驗 取6份同一樣品粉末，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件測定，結果甜菜堿、綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、毛蕊花糖苷、莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚、尿囊素、茯苓酸和23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD值分別為0.7%、0.3%、0.5%、1.1%、1.7%、0.9%、1.9%、0.7%、1.5%、2.1%、1.3 %，表明該方法重復性良好。

2.3.6穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液，分別在0、4、8、12、24、48 h，按照2.1項下色譜條件測定，結果甜菜堿、綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩帷⒚锘ㄌ擒?、莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚、尿囊素、茯苓酸和23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD值分別為0.8%、0.7%、0.6%、1.4%、1.9%、0.7%、1.5%、1.2%、1.0%、1.7%、1.5%，表明穩(wěn)定性良好。

2.3.7加樣回收率實驗 精密稱取9份同一樣品粉末(批號200511)，每份1.0 g，分別置于具塞錐形瓶中，3份為1組，分別加入相當于1.0 g樣品中各組分含量為80%、100%、120%的對照品，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件測定得甜菜堿、綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、毛蕊花糖苷、莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚、尿囊素、茯苓酸和23-乙酰澤瀉醇B的平均回收率分別為97.66%、97.32%、97.88%、97.67%、98.35%、97.52%、98.34%、98.41%、98.03%、97.81%、98.19%，RSD值分別為0.5%、1.2%、0.8%、0.5%、0.5%、0.9%、0.3%、0.5%、0.4%、0.6%、1.0%，表明該方法準確、可靠。

2.4樣品測定 精密稱定4批樣品粉末各2.0 g，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各2 μL，按照2.1項下色譜條件測定，計算各成分含量，結果見表4。

表4 樣品含量測定結果 (n=4)

3 討論

3.1檢測器的選擇 HPLC法同時檢測11種成分，存在前處理復雜、基線分離難、最大吸收波長不同等問題，而質譜法具有靈敏度高、準確性好、選擇性強、線性范圍寬的特點。此外，以多反應監(jiān)測模式進行含量測定，同時掃描正負離子對，相較于紫外檢測器，檢驗的時間更短，結果更準確。

3.2監(jiān)測離子對的選擇 質譜多反應監(jiān)測模式以特征離子為目標，選擇合適的母離子和子離子是檢測的關鍵。本實驗先以全掃描模式確定母離子，再優(yōu)化碎裂能量和碰撞能量，確定信號響應最強的子離子，最終為11種成分各確定1對定量離子。

3.3流動相的選擇 分別比較了乙腈-水、乙腈-1 mL·L-1甲酸、甲醇-水、甲醇-1 mL·L-1甲酸作為流動相的檢測結果，發(fā)現乙腈和甲醇均能達到較好的分離效果，并且乙腈較甲醇具有更強的洗脫能力和更低的洗脫壓力。少量甲酸的加入既改善了峰形，又提高了響應，因此，最終選用乙腈-1 mL·L-1甲酸作為流動相。

3.4提取溶劑的選擇 由于有效成分多為酚酸和皂苷類化合物，二者在水和甲醇中溶解度高，比較甲醇、體積分數為70%的甲醇、體積分數為50%的甲醇的提取效果，發(fā)現體積分數為70%的甲醇的提取效果最好，干擾較少，最終選用體積分數為70%的甲醇作為提取溶劑。

3.5提取方法的選擇 比較超聲和回流2種提取方法，結果顯示，在相同提取時間下，回流提取液的含量高于超聲提取液，最終選用回流提取法。

3.6提取時間的選擇 比較回流提取30、60、90 min的結果，發(fā)現提取60 min時，各成分含量基本一致，最終選用提取時間為60 min。

根據上述實驗結果，本方法具有前處理簡便、分析時間短、結果準確、檢測成分多等特點，可為杞菊地黃丸的質量控制提供參考。