張淑玫，陳佳娜，程 賽，周藝吉，辛志明，陳玲凡，張 旗*

(1.福建醫(yī)科大學藥學院天然藥物學系，福州 350122；2.福建省新藥安全評價中心，福州 350122)

在抗擊新型冠狀病毒肺炎疫情中，中醫(yī)藥發(fā)揮了良好的作用。劉清泉等[1-2]研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方制劑能顯著縮短其病程，減輕患者的臨床癥狀，減少普通型病例向重型及危重型的轉(zhuǎn)化，降低病死率。各地衛(wèi)生主管部門以中醫(yī)專家共識性的病因病機分析為依據(jù)，制定了一批中醫(yī)診療方案，向3個階段不同證型新型冠狀病毒肺炎推薦了指導(dǎo)性處方。全國地級市及以上衛(wèi)生管理部門發(fā)布了308 種中藥處方。治療期主要證型為內(nèi)閉外脫、疫毒閉肺、寒濕郁肺及邪熱壅肺，共涉及 187 味藥材。清營湯是治療新型冠狀病毒肺炎的常用復(fù)方之一，服用后低熱消失，納食改善，精神轉(zhuǎn)好，可明顯改善肺部炎癥[3]。

清營湯出自吳鞠通的《溫病條辨》，為溫病學的經(jīng)典方劑[4]。該方由水牛角、玄參、地黃、麥冬、金銀花、淡竹葉、黃連、連翹及丹參9味中藥組成，治療熱在營分證[5]，可清營透氣，用于治療邪熱初入營分、身熱、時有譫語、心煩不得入眠、或斑疹隱隱、舌絳而干、脈象細數(shù)的病癥，臨床主治急性肺炎、病毒性腦炎、乙型腦炎、流行性腦脊髓膜炎、急性胰腺炎、過敏性紫癜、膿毒癥、敗血癥、腸傷寒或其他熱性病證屬熱入營衛(wèi)者[6-7]。藥理研究表明，清營湯具有解熱、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用，在一定程度上可改善血液流變、心肌損害[7]。

清營湯臨床應(yīng)用廣泛，但其復(fù)方藥效物質(zhì)尚未闡明。因此本研究將建立清營湯提取物的超高效液相色譜法(UPLC)特征圖譜，并通過超高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-ESI-MSn)總離子流圖，根據(jù)質(zhì)譜裂解信息以及文獻對比結(jié)果，分析清營湯提取物的化學成分。

1 儀器與試藥

1.1儀器 DZTE 型電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；BUCHI 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(瑞士步琦有限公司)；5810R型離心機(德國 Effendorf 公司)；AR124CN型電子天平(奧豪斯儀器有限公司)；Waters ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀(美國 Waters 公司)；0.22 μm微孔過濾膜(有機系，津騰公司)；靜電場軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)； Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(150 mm×3 mm，1.8 μm，美國Agilent公司)。

1.2試藥 甲酸和乙酸為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司；甲醇(色譜純)，賽默飛世爾科技中國有限公司；乙腈(色譜純)，德國默克公司；無水乙醇(分析純)，北京化工廠；蒸餾水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司；清營湯處方藥材，購自北京同仁堂藥店。

2 方法與結(jié)果

2.1特征圖譜的建立

2.1.1清營湯提取物的制備 清營湯處方組成：水牛角30 g，生地黃15 g，玄參9 g，竹葉心3 g，麥冬9 g，丹參6 g，黃連5 g，金銀花9 g，連翹6 g。藥材加10倍量體積分數(shù)為70%的乙醇回流提取3次，每次1 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮，定容至250 mL，得到質(zhì)量濃度為1.1 g·mL-1的清營湯提取液。

2.1.2色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(150 mm×3 mm，1.8 μm)；流動相：1 mL·L-1甲酸-甲醇；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：254 nm。流動相A為 1 mL·L-1甲酸，流動相B為甲醇，洗脫梯度：0 min，3%B；5 min，6%B；7 min，7%B；20 min，15%B；60 min，17%B；63 min，23%B；80 min，24%B；90 min，30%B；105 min，34%B；125 min，34%B；135 min，40%B。

2.1.3方法學考察

2.1.3.1精密度實驗 取清營湯藥材，按照2.1.1項下方法制備供試品溶液，按照2.1.2項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。通過對記錄的色譜圖進行數(shù)據(jù)處理，計算得其相對保留時間RSD值小于3%，16個共有峰面積的RSD值≤3%，表明儀器精密度良好。

2.1.3.2重復(fù)性實驗 取清營湯處方藥材，按照2.1.1項下方法平行制備供試品溶液，按照2.1.2項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。通過對記錄的色譜圖進行數(shù)據(jù)處理，計算得其相對保留時間的RSD值小于3%，16個共有峰面積的RSD值≤3%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.1.3.3穩(wěn)定性實驗 取清營湯處方藥材，按照2.1.1項下方法平行制備供試品溶液，按照2.1.2項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、36、48 h進樣，記錄色譜圖。通過對記錄的色譜圖進行數(shù)據(jù)處理，計算得其相對保留時間RSD值均小于3%，16個共有峰面積的RSD值≤3%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4指紋圖譜的建立 按照2.1.2項下色譜條件測定，選擇體積分數(shù)為70%的乙醇回流提取所得的樣品溶液，并將其平行制備10份后平行進樣，結(jié)果見圖1。通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)計算相似度，結(jié)果見表1。10個批次的樣品相似度均大于0.900，說明不同批次的樣品無顯著差異。

圖1 對照品(R)和10批清營湯提取物的特征圖譜

表1 10批清營湯提取物的相似度評價結(jié)果

2.2利用UPLC-MS-MSn解析清營湯提取物的化學成分 質(zhì)譜條件為電噴霧(ESI)離子源，采用正、負離子模式檢測，毛細管溫度為350 ℃，氮氣流速為30 arb，輔助氣流速為10 arb，噴霧電壓為3 kV，毛細管電壓為35 V，管透鏡電壓為110 V，樣品先進行全掃描，分辨率設(shè)為30 000，掃描范圍m/z為100～1 500，二級和三級質(zhì)譜采用動態(tài)數(shù)據(jù)依賴性掃描，選取上一級豐度前10強的峰進行碰撞誘導(dǎo)解離 (CID) 碎片掃描，以離子阱進行檢測。

根據(jù)UPLC-MS-MSn中總離子流圖中峰的保留時間以及離子碎片，并結(jié)合參考文獻，共解析出61個化合物[8-20]，包括黃酮類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、生物堿類、有機酸類和三萜皂苷類等化合物。見表2和圖2。

圖2 清營湯提取物的總離子流圖

3 討論

本研究通過考察清營湯在不同檢測波長、不同質(zhì)量濃度、不同提取溶劑、不同流動相條件下的色譜圖，得到清營湯提取物UPLC的最佳洗脫條件，建立清營湯的最佳色譜圖。同時運用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)得到UPLC-ESI-MSn總離子流圖，并根據(jù)其質(zhì)譜的裂解碎片信息及文獻信息推斷出清營湯的主要化學成分，其主要含有地黃苷(地黃苷A、地黃苷D、地黃苷C、地黃苦苷、洋地黃葉苷 C、焦地黃苷A1/A2等)、綠原酸(異綠原酸C、異綠原酸B、新綠原酸、隱綠原酸等)和連翹酯苷E等類別，共61個化合物。其中通過查詢文獻得知，連翹酯苷E、二氫梓醇、腺苷、單蜜力特苷、蜜力特苷、8-表番木鱉酸、毛蕊花糖苷、連翹酯苷和地黃苷類等來源于麻杏石甘湯中的地黃；6-O-甲基梓醇、哈巴俄苷、ningpogoside A、cistanoside F、6-O-methylaucubin和cistanoside D等來源于玄參；連翹酯苷A、蘆丁和槲皮素來源于連翹；木蘭花堿、非防己堿、表小檗堿、藥根堿、黃連堿、巴馬亭和小檗堿等來源于黃連；馬錢子苷、檸檬酸、奎寧酸、馬錢子酸和綠原酸類來源于金銀花；methylophiopogonanone A、lirigramoside A、ophiopojaponin A、(+)-pinoresinol-β-D-glucoside和(+)-epipinoresinol-4′-O-glucoside等來源于麥冬；其余各成分歸屬于其余藥材。本研究闡明了清營湯的基本化學成分，為開發(fā)治療新型冠狀病毒肺炎藥物提供了理論依據(jù)，為進一步指導(dǎo)清營湯的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。