李 娜，陳鳳鳴，王 雷

（第四軍醫(yī)大學西京皮膚醫(yī)院，陜西 西安 710032）

病理檢查是診斷深部真菌病的重要手段，快速準確檢出真菌對明確臨床診斷有著重要意義[1，2]。目前，真菌染色在我國臨床各類疾病診斷中應用十分廣泛，如真菌感染的皮膚病、各內科疾病的組織細胞染色以及重要臟器感染的診斷等[3-5]。多數(shù)真菌在常規(guī)蘇木素-伊紅染色切片上不容易辨認，而PAS 染色是臨床中應用最為廣泛的特殊染色方法[6]。由于組織內都含有糖原，而研究發(fā)現(xiàn)，糖原的存在可導致一些深部真菌感染在進行PAS 染色時因背景著色而影響觀察[7]。為此，本研究擬改進PAS 染色方法，以降低染色背景。

1 材料與方法

1.1 試劑 10%鉻酸，堿性品紅，鹽酸，偏重亞硫酸鈉，活性炭，改良Gill 蘇木素染液，0.2%亮綠，1%鹽酸酒精，無水乙醇，二甲苯，中性樹膠。

1.2 染液配制 10%鉻酸氧化液：10 g 三氧化鉻加入90 ml 蒸餾水中，搖勻使其完全溶解，保存于4 ℃冰箱。0.5%高碘酸氧化液：0.5 g 高碘酸加入100 ml 蒸餾水中，搖勻使其完全溶解，保存于4 ℃冰箱。0.2%亮綠：0.2 g 亮綠加入100 ml 蒸餾水中，搖勻使其完全溶解，加入0.2 ml 冰醋酸，保存于4 ℃冰箱。Schiff液：0.5 g 堿性品紅溶于100 ml 煮沸的蒸餾水中，煮沸5 min，溶液冷卻至50 ℃，加1 當量鹽酸10 ml，待溫度冷卻至25 ℃時，加0.8 g 偏重亞硫酸鈉，搖蕩2 min，置于暗處18～24 h，加3 g 活性炭靜置1～2 h 過濾，溶液呈無色或淺草黃色可用。4 ℃避光密閉保存。

1.3 染色步驟 組織經(jīng)福爾馬林固定，切片厚4 μm，脫蠟至水。采用不同濃度的鉻酸溶液或高碘酸溶液氧化反應10 min，蒸餾水洗滌3 次。用Schiff 液滴染15～60 min，傾去Schiff 試劑，流水沖洗。用亮綠染色液復染1 min，或者用改良Gill 蘇木素染液復染2～3 min，流水沖洗，返藍后常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.4 方法

1.4.1 比較亮綠與蘇木素襯染 取2 張連續(xù)切片的深部真菌病染色切片按上述染色步驟進行染色，分別以亮綠與蘇木素襯染，比較菌絲及孢子與周圍組織對比是否分明，背景是否清晰。

1.4.2 比較不同濃度鉻酸溶液氧化后的染色 取3 張連續(xù)切片的深部真菌病染色切片，分為A、B、C 三組，按上述染色步驟進行染色，A 組鉻酸溶液濃度5%，B 組鉻酸溶液濃度10%，C 組鉻酸溶液濃度20%，各氧化10 min，比較三組染色結果的陽性強度，陽性區(qū)域比周圍組織對比是否分明，背景是否清晰。

1.4.3 比較Schiff 溶液染色不同時間對結果的影響取3 張連續(xù)切片的深部真菌病染色切片，分為A、B、C 三組，以10%鉻酸溶液，按上述染色步驟進行染色，A 組Schiff 溶液時間15 min，B 組Schiff 溶液時間30 min，C 組Schiff 溶液時間60 min，比較三組染色結果的陽性強度，陽性區(qū)域比周圍組織對比是否分明，背景是否清晰。

1.4.4 確立最終的改良條件 將濃度10%的鉻酸氧化10 min，Schiff 溶液染色30 min。采用多種真菌感染病理切片進行驗證染色方法是否可靠。取體癬、膿癬、以及深部真菌病各一張切片，以濃度10%的鉻酸，Schiff 溶液30 min 進行染色，亮綠襯染，觀察皮膚組織內的菌絲及孢子與周圍組織對比是否明顯，背景是否清晰。

2 結果

2.1 亮綠與蘇木素襯染比較 以常規(guī)PAS 染色比較亮綠與改良Gill 蘇木素染液襯染，發(fā)現(xiàn)蘇木素襯染背景為淡粉色，菌絲及孢子為紫紅色，與周圍組織不易區(qū)分。而亮綠襯染背景為綠色，菌絲及孢子為紫紅色與周圍組織對比明顯，易于辨認，見圖1。

圖1 蘇木素與亮綠襯染的PAS 染色對比

2.2 不同濃度的鉻酸溶液氧化后染色效果比較 濃度為5%的鉻酸溶液組皮膚組織背景干凈清晰，但其中的菌絲及孢子著色偏淺，與周圍組織不易區(qū)分；濃度為10%的鉻酸溶液組皮膚組織內的真菌著色呈紫紅色，顏色鮮艷，周圍的纖維結締組織及炎細胞為綠色能明顯區(qū)分，背景干凈清晰；濃度20%的鉻酸溶液背景干凈清晰，但其中的真菌不著色，未見明顯的菌絲及孢子，見圖2。

圖2 PAS-鉻酸染色不同濃度鉻酸溶液染色對比

2.3 Schiff 溶液染色不同時間的結果比較 Schiff 溶液15 min 組皮膚組織背景清晰，纖維結締組織及炎細胞為綠色，但菌絲及孢子著色偏淺；Schiff 溶液30 min 組皮膚組織背景清晰，纖維結締組織及炎細胞為綠色，菌絲及孢子為紫紅色；Schiff 溶液60 min組皮膚組織的背景較清晰，為綠色背景中夾雜著粉色，菌絲及孢子為紫紅色，見圖3。

圖3 PAS-鉻酸染色Schiff 溶液不同染色時間對比

2.4 驗證試驗 采用濃度10%的鉻酸，Schiff 溶液30 min，并以亮綠襯染染體癬、膿癬、以及深部真菌病，可在組織內見到染色對比度良好的真菌，證明該染色方法質量可靠。PAS-鉻酸染色結果顯示體癬位于角質層為紫紅色，其中的菌絲呈淡紫色對比明顯，易于辨認；膿癬位于毛囊內的孢子為淡紫色，而其中的角質物質為紫紅色，對比較明顯，易于辨認；深部真菌病位于真皮的菌絲及孢子呈紫紅色，周圍纖維結締組織及炎細胞為綠色，對比明顯，易于辨認，見圖4。

圖4 體癬、膿癬及深部真菌病PAS-鉻酸染色圖

3 討論

既往傳統(tǒng)的PAS-過碘酸染色采用的是蘇木素襯染[8，9]，該方法利用過碘酸作用將兩個相鄰碳的羥基氧化為醛基，而Schiff 試劑可與醛基發(fā)生染色反應。目前，大量的實際真菌染色實驗報道對PAS-過碘酸具體染色效果進行了分析。如Margo CE 等[10]的研究報道了對傳染性結晶性角膜病變患者利用PAS-過碘酸染色進行角膜組織液染色的研究，發(fā)現(xiàn)在部分患者的組織液樣本染色中能夠觀察到真菌，但在感染不強的患者中并不能獲得明顯的染色效果；Zaaroura H 等[11]對195例手足癬患者進行了組織活檢染色，發(fā)現(xiàn)PAS-過碘酸染色呈陽性的患者僅有6例，且根據(jù)組織染色結果的反應模式認為這些患者不容易被歸類為具體的疾病類型；而Adriana GP 等[12]針對PAS-過碘酸染色進行了系統(tǒng)性的效果分析，納入了皮膚、眼部以及其他真菌感染患者的組織樣本進行染色，發(fā)現(xiàn)雖然PAS-相鄰背景呈淡紅色，但從真菌與周圍組織的對比效果來看，有相當一部分患者的樣本染色效果并不明顯，導致真菌感染情況不易辨認。上述研究結果顯示，PAS-過碘酸染色方法在真菌染色的效果上并不十分理想。

從染色原理上來看，PAS-過碘酸染色具體的原理是將高碘酸作為氧化劑，氧化糖類及有關物質中的1，2-乙二醇基，使之變?yōu)槎┡cSchiff 試劑結合生成一種品紅色化合物，于多糖存在的部位形成新的紫紅色復合物[13-15]。因此，PAS 染色能廣泛顯示糖原、膠原、基底膜帶，真菌孢子及菌絲較難分辨[16-18]。但由于該方法在真菌染色過程中暴露出的不穩(wěn)定性缺點，利用該方法無法為部分患者提供準確的染色診斷效果[19，20]，而本研究通過將改良Gill蘇木素染液換為亮綠染液，背景為綠色，菌絲及孢子呈紫紅色，使染色效果更易于辨認[21-23]。

本研究主要將過碘酸換成了鉻酸，主要原因如下：①鉻酸作為氧化劑時在多糖中產(chǎn)生醛類物質，在濃度最高的區(qū)域完全轉化需要更長地時間，使這些多糖與Schiff 試劑反應，這就意味著樣本組織內的真菌將會獲得更長時間的染色反應；②由于真菌的細胞壁富含1，2-乙二醇基團，采用鉻酸來替代過碘酸可使真菌在組織切片上比大多數(shù)其他活性成分著色更強烈。通過實驗結果可以觀察到，鉻酸使真菌和背景之間的對比往往比PAS-過碘酸染色的重復部分更明顯。以往國內外也報道了關于PAS-過碘酸染色的改進方法，如Chawla M 等[24]將PAS 染色和熒光成像分析結合應用，可觀察到絨氈層和小孢子的具體發(fā)展進程，但這種改進方法并未對染色過程本身進行改進，實際上并未獲得更好的染色效果。楊偉平等[25]利用50 ℃攤烤片機預處理與組織冷凍切片相結合的方法進行真菌染色，結果發(fā)現(xiàn)該方法明顯縮短了時間，且真菌薄膜染色對比度更加鮮艷，這種改進方法避免了環(huán)境溫度對過碘酸產(chǎn)生的長時間影響，使染色能在3 min 內達到較好效果。本研究將傳統(tǒng)PAS 染色中的過碘酸換成了鉻酸溶液，且研究了不同濃度的鉻酸溶液及Schiff 溶液不同的染色時間對PAS-鉻酸染色的影響，結果表明以10%濃度的鉻酸溶液及Schiff 溶液30 min 染色效果為最佳，此時皮膚組織中的真菌著色呈紫紅色，顏色鮮艷，與周圍的纖維結締組織及炎細胞能明顯區(qū)分，背景干凈清晰。在未考慮溫度因素的影響，利用鉻酸使Schiff 試劑與醛基之間獲得了更長的反應時間，也收獲了類似的染色效果。

另外，本研究采用改良PAS-鉻酸染色，并以亮綠襯染，對皮膚科常見真菌感染性疾病體癬、膿癬，以及其他深部真菌病進行驗證后發(fā)現(xiàn)該染色方法的皮膚組織中的真菌著色呈紫紅色，背景呈綠色，與周圍的纖維結締組織及炎細胞能明顯區(qū)分，質量可靠，對比度較高，可用于臨床檢測。

綜上所述，改良的PAS-鉻酸染色方法比經(jīng)典的PAS 染色方法背景更干凈，染色對比度較高。