應夏麗，王曉玲，陳妍月，嚴潔萍，李 莉

(1淳安縣第一人民醫(yī)院·浙江 杭州 311700；2浙江中醫(yī)藥大學·浙江 杭州 311402；3浙江省人民醫(yī)院·浙江 杭州 310014)

腦卒中已成為威脅人類健康的第三大“殺手”，具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率等特點[1-2]。腦卒中分為出血性腦卒中和缺血性腦卒中，其中缺血性腦卒中約占80%[3]。治療缺血性卒中關鍵在于及時恢復缺血區(qū)域的血液供應[4]，但血流的恢復可能會進一步加重缺血導致的神經(jīng)元損傷，即腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury, CIRI)[5]。

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸(CornusofficinalisSieb. et Zucc.)的干燥成熟果肉，為臨床常用中藥，具有補益肝腎、收澀固脫等功效[6]，是浙江產(chǎn)道地藥材。山茱萸環(huán)烯醚萜苷類是其主要活性成分，研究發(fā)現(xiàn)其能減少大鼠局灶性腦缺血腦梗死體積，對缺血再灌注造成的全腦損傷有保護作用，并可延長低壓缺氧小鼠存活時間，作用機制主要表現(xiàn)為抑制神經(jīng)元細胞凋亡和抗血小板聚集[7-10]。馬錢苷(C17H26O10)作為山茱萸環(huán)烯醚萜苷中的主體成分，目前尚未見其對CIRI的相關研究，故本課題組探討馬錢苷對CIRI小鼠的保護作用機制，為馬錢苷臨床治療腦缺血和開發(fā)相關藥物提供臨床前研究依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 健康ICR小鼠，SPF級，雄性，23～27 g，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物研究中心，動物合格證號：SYXK(浙)2013-184。

1.2 藥物 馬錢苷：上海源葉生物科技有限公司，批號：18524-94-2；HPLC大于或等于98%。依達拉奉注射液：吉林博大制藥有限公司，批號：02-1800772。

1.3 主要試劑及儀器 Caspase-3抗體：博士德生物工程有限公司，批號：ZP4127BP27；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒：瑞士Roche公司，批號：39006700。自動染色機：Autostainer XL，Leica公司，德國；RM2245石蠟切片機：Leica公司，德國；2.0 RS數(shù)字切片掃描設備：濱松公司，日本；VS120-S60W病理切片(熒光)掃描分析儀：Olympus公司，日本；EMUC7超薄切片機：美國Leica公司；H-7650 型透射電鏡：日本Hitachi公司；熒光顯微鏡：Carl Zeiss公司，中國。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 將ICR小鼠隨機分為假手術組、模型組、依達拉奉(5 mg/kg)組及馬錢苷(5、10、15 mg/kg)組，每組8只。實驗前小鼠禁食不禁水12 h，參照Longa等[11]方法造模進行改進。仰臥位固定，沿頸部正中切開約1 cm，分離頸總動脈，并于其結扎部位上方約1 mm處剪口，插入栓線(1620-A4，1622-A4，1623-A4，北京西科農(nóng)技有限公司)使小鼠左側大腦中動脈栓塞(MCAO)，缺血1 h后，緩慢抽出拴線，再灌注24 h，建立小鼠CIRI模型。其中假手術組僅分離頸總動脈及頸外動脈，不栓塞大腦中動脈。MCAO后立即腹腔注射給藥，假手術組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水。

2.2 觀察指標及測定

2.2.1 神經(jīng)功能缺損評分 參照Bederson[12]確立的5級評分法對小鼠的神經(jīng)功能缺損進行評分，1～3級定為造模成功，0、4級棄去。

2.2.2 腦梗死體積測定 再灌注24 h后，處死小鼠，取腦，-20 ℃冷凍10 min，取出，均勻切成5 片，2%TTC溶液37 ℃避光溫孵10 min，4%多聚甲醛固定，取出，拍照。用Image Pro Plus統(tǒng)計腦梗死體積。腦梗死體積(%)=(正常側大腦半球體積-梗死側非梗死區(qū)的體積)/2倍正常側大腦半球體積×100%

2.2.3 腦含水量、腦指數(shù)測定 吸干腦組織表面液體，精密(精確度1/10 000)稱取濕重，100 ℃烘干至恒重，稱取干重。腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/ 濕重×100%；腦指數(shù)=腦濕重×100/體重。

2.2.4 病理學觀察 小鼠CIRI后，麻醉小鼠，取4%多聚甲醛心臟灌注，取腦組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片。將切片依次置于純二甲苯、乙醇中脫蠟；按常規(guī)HE染色法染色；不同濃度乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察、拍照。取缺血區(qū)大腦皮層組織塊1 mm3，放入2.5%戊二醛溶液4 ℃固定，取出，超薄切片，醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液染色1 h，檸檬酸鉛溶液染色15 min，在透射電鏡下觀察缺血區(qū)線粒體與內質網(wǎng)超微結構。

2.2.5 TUNEL檢測細胞凋亡 將切片依次放入由100%乙醇至蒸餾水中梯度脫蠟；滴加20 mg/L不含DNase的蛋白酶K，37 ℃孵育20 min，PBS洗滌3次；滴加50 μLTUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌3次；加抗熒光淬滅液封片，熒光顯微鏡下觀察，拍照。綠色熒光顯色為凋亡細胞，每張切片在缺血皮層區(qū)隨機取5處，計算各組缺血皮層區(qū)單位面積內細胞凋亡數(shù)。

2.2.6 免疫組織化學染色法檢測缺血區(qū)caspase-3蛋白表達 照SABC試劑盒方法進行caspase-3免疫組織化學染色，制片，顯微鏡觀察。胞漿著色呈棕黃色為陽性細胞，每張切片在缺血皮層區(qū)隨機取5處，采用Image J軟件統(tǒng)計分析所捕獲的圖像中染成黃色或棕黃色物質的陽性面積和統(tǒng)計場總面積，以陽性面積/統(tǒng)計場總面積比值作為caspase-3蛋白陽性表達百分率。

3 結果

3.1 馬錢苷對CIRI小鼠神經(jīng)功能評分、腦梗死體積、腦含水量及腦指數(shù)的影響 結果見表1。

表1 各組小鼠神經(jīng)功能評分、腦梗死體積、腦含水量及腦指數(shù)的比較

3.2 馬錢苷對CIRI小鼠大腦病理組織學的影響 假手術組小鼠大腦神經(jīng)細胞形態(tài)正常，結構完整，核膜、核仁邊界清楚，CA1區(qū)錐體神經(jīng)元排列整齊緊密，邊界清晰未見異常。模型組小鼠大腦皮層結構疏松呈空隙狀，神經(jīng)元胞體變形、胞核固縮、溶解或消失，CA1區(qū)神經(jīng)元排列疏松無規(guī)律。與模型組相比，馬錢苷各劑量組及依達拉奉組CIRI小鼠缺血區(qū)神經(jīng)元細胞病理結構均得到不同程度改善，其中馬錢苷15 mg/kg組和依達拉奉組CIRI小鼠神經(jīng)細胞結構趨于完整，病理情況得到明顯改善。結果見圖1、圖2。

圖1 各組小鼠大腦皮層病理形態(tài)學變化(HE, ×400)

圖2 各組小鼠大腦海馬CA1區(qū)病理形態(tài)學變化(HE, ×400)

3.3 馬錢苷對CIRI小鼠缺血區(qū)皮層神經(jīng)細胞超微結構的影響 假手術組小鼠腦缺血區(qū)神經(jīng)元細胞線粒體結構完整，呈圓形和卵圓形，外膜光滑，內嵴清晰，內腔無擴張，基質密度均勻；粗面內質網(wǎng)形態(tài)完整，呈扁平囊狀，排列整齊。模型組小鼠神經(jīng)細胞線粒體擴張，外膜破壞、溶解，嵴排列紊亂或消失，胞質內水腫明顯，粗面內質網(wǎng)核糖體脫離。與模型組相比，馬錢苷各劑量組及依達拉奉組小鼠神經(jīng)元細胞線粒體嵴排列紊亂程度、空泡現(xiàn)象及線粒體、內質網(wǎng)腫大程度得到不同程度的改善，其中馬錢苷15 mg/kg組和依達拉奉組小鼠神經(jīng)元細胞線粒體結構趨于完整，粗面內質網(wǎng)核糖體脫離情況得到明顯改善。見圖3。

注：→，表示線粒體；△，表示內質網(wǎng)圖3 各組小鼠缺血區(qū)神經(jīng)元細胞的超微結構變化(×30 000)

3.4 馬錢苷對CIRI小鼠大腦皮層神經(jīng)細胞凋亡的影響 假手術組小鼠大腦皮層神經(jīng)細胞偶有凋亡。與假手術組相比，模型組小鼠大腦皮層可見大量細胞凋亡，細胞凋亡數(shù)量極顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，馬錢苷各劑量組和依達拉奉組神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)量均不同程度減少，其中馬錢苷10、15 mg/kg組和依達拉奉組神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量極顯著性減少(P<0.01)。結果見圖4，圖5。

注：與假手術組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01圖4 各組小鼠腦缺血區(qū)細胞凋亡計數(shù)比較(動物數(shù)：8 只)

圖5 各組小鼠腦缺血區(qū)細胞凋亡TUNEL法測結果(×400)

3.5 馬錢苷對CIRI小鼠腦缺血區(qū)皮層 caspase-3 蛋白表達水平的影響 缺血區(qū)Caspase-3蛋白陽性細胞呈棕黃色，為胞質著色。與假手術組相比，模型組Caspase-3蛋白表達極顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，馬錢苷10 mg/kg組Caspase-3蛋白表達明顯減少(P<0.05)；馬錢苷15 mg/kg組和依達拉奉組能極顯著減少Caspase-3蛋白表達(P<0.01)。結果見圖6、圖7。

注：與假手術組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01圖6 各組小鼠缺血區(qū)caspase-3陽性細胞面積比較(動物數(shù)：8 只)

圖7 各組小鼠腦缺血區(qū)皮層caspase-3蛋白表達免疫組化測定(×400)

4 討論

CIRI常表現(xiàn)為大范圍的腦水腫、梗死或者出血，引起神經(jīng)元損傷，使患者留下嚴重后遺癥。再灌注損傷也是發(fā)生急性腦缺血早期恢復血供后不可避免且不可逆的病理損傷[13]。Jeonga E.J等[14]研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸環(huán)烯醚萜苷對谷氨酸鹽誘導損傷的海馬細胞具有促神經(jīng)元形成和血管生成作用，提高受損神經(jīng)的功能。Yao R.[15]研究發(fā)現(xiàn)山茱萸環(huán)烯醚萜苷灌胃能降低CIRI大鼠神經(jīng)功能評分，增加梗死區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)量。馬錢苷作為山茱萸環(huán)烯醚萜苷的主要成分之一，探究其對CIRI的保護作用具有重大意義。本實驗采用改良Longa線栓法制備CIRI小鼠模型，通過測定CIRI小鼠神經(jīng)功能評分、腦梗死體積、腦含水量、腦指數(shù)等指標，觀察CIRI小鼠大腦皮層和海馬區(qū)的病理結構，提示馬錢苷對CIRI小鼠具有良好的保護作用。

CIRI的發(fā)病機制十分復雜，主要涉及細胞凋亡、炎性反應、氧化應激、興奮性毒性等[16]，其中細胞凋亡是研究重點之一。半胱氨酸蛋白酶(Caspases)的激活是細胞凋亡的生化標志[17]，其中Caspase-3蛋白被認為是細胞凋亡的執(zhí)行蛋白。Caspase-3 蛋白激活后損壞 DNA 鏈、破壞細胞完整性，最終形成凋亡小體，從而導致細胞凋亡[18]。作為細胞凋亡的兩條重要途徑，線粒體途徑和內質網(wǎng)應激(ERS)之間緊密聯(lián)系。內質網(wǎng)作為細胞內蛋白質合成、加工、修飾的重要場所，為線粒體提供重要蛋白保障。另外內質網(wǎng)作為細胞內的Ca2+庫，為線粒體輸送充足的Ca2+來使線粒體功能正常發(fā)揮[19]。線粒體通路中，由于氧自由基、鈣離子超載等使線粒體滲透性轉運孔道開放，細胞色素 C(Cyt C) 釋放，活化Caspase，激活Caspase-3，導致細胞凋亡。ERS主要導致內質網(wǎng)腔內鈣穩(wěn)態(tài)失衡，出現(xiàn)鈣剝奪或鈣超載等，繼而激活細胞凋亡執(zhí)行分子Caspase-3，導致細胞凋亡，故可將ERS引起的細胞凋亡視作是細胞線粒體凋亡的補充途徑[20]。

本實驗在急性腦缺血后立即給予馬錢苷治療，其中10 mg/kg、15 mg/kg能有效減輕小鼠CIRI程度，減少神經(jīng)細胞的凋亡，改善內質網(wǎng)與線粒體的病理形態(tài)，下調Caspase-3蛋白表達；表明馬錢苷能改善CIRI小鼠神經(jīng)元病理損傷，具有神經(jīng)保護作用，其作用機制可能與保護神經(jīng)細胞，維持線粒體和內質網(wǎng)結構穩(wěn)態(tài)，進而下調Caspase-3蛋白相關。本實驗為進一步研究馬錢苷對CIRI小鼠神經(jīng)保護作用提供實驗依據(jù)，對開發(fā)馬錢苷成為抗腦卒中臨床藥物奠定一定理論基礎。