張冰冰，魯科達(dá)，張培培，葉黎青，馬紅珍

(1浙江中醫(yī)藥大學(xué)·浙江 杭州 310053；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院·浙江 杭州 310006；3浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院·浙江 杭州 310009)

心血管事件是導(dǎo)致慢性腎臟病患者死亡的主要原因，其中動脈粥樣硬化是心血管事件發(fā)生的重要原因之一。慢性腎臟病患者的動脈粥樣硬化較正常人發(fā)病率高、表現(xiàn)更嚴(yán)重，可能與慢性腎衰竭患者氧化應(yīng)激、營養(yǎng)不良、微炎癥等多重非傳統(tǒng)因素有關(guān)[1]，初步研究證實(shí)這些因素往往也可激活泛素-蛋白酶體通路，也有研究證實(shí)慢性腎衰竭大鼠主動脈泛素-蛋白酶體信號通路顯著活化[2]。消瘀泄?jié)犸嬍枪P者臨床上用于治療慢性腎衰竭的基本方，臨床和動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有改善腎功能的作用[3-5]。前期動物實(shí)驗(yàn)也表明該方具有抗慢性腎衰竭動脈粥樣硬化作用[6]。本研究擬觀察消瘀泄?jié)犸媽β阅I衰竭大鼠主動脈基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、主動脈泛素-蛋白酶體通路相關(guān)組分Ubc、Ube2b、PsmA1表達(dá)的影響，探討消瘀泄?jié)犸嬁孤阅I衰竭動脈粥樣硬化的機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(160±20)g，購于中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號碼：SCXK(滬)2017-0005。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號碼：SYXK(浙)2018-0012。所有大鼠均在全封閉SPF狀態(tài)下隔離飼養(yǎng)。

1.2 主要藥品和試劑 消瘀泄?jié)犸嬘缮S芪30 g、制大黃10 g、川牛膝12 g、桃仁12 g、地龍12 g、車前草20 g組成，所含中藥均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供，濃縮成濃度為0.96 g·mL-1的藥液，4 ℃保存?zhèn)溆?；阿托伐他汀鈣(立普妥)：由輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：J6348，規(guī)格：20 mg/片。高脂飼料(2%膽固醇、10%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶、87.8%基礎(chǔ)飼料)：由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心加工配制。MMP-9、Ubc、Ube2b、PsmA1免疫組化檢測試劑盒：博奧森公司提供公司，批號：131200w、131210w、140323 w、131230w。

1.3 主要儀器和設(shè)備 AU640全自動生化分析儀：Olympus，Japan；LEICA彩色病理圖像分析系統(tǒng),LEICA公司，Germany；生物安全柜：海爾集團(tuán)；熒光定量PCR儀：Bio-Rad iQ5，American；微量核酸測定儀：上海在途生物科技有限公司。

2 方法

2.1 動物造模及分組給藥 40只大鼠普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10只作為正常對照組，參照本課題組改良的慢性腎衰竭營養(yǎng)不良動物模型[7]采用二步法5/6腎切除制作CRF模型，第二次術(shù)后予高脂飲食喂養(yǎng)，制作CRF動脈粥樣硬化模型。造模10周后成模大鼠隨機(jī)分為模型組、立普妥組、消瘀泄?jié)犸嫿M，每組10只。正常組和模型組予0.9%氯化鈉溶液10 mL/(kg·d)灌胃，立普妥組予立普妥2 mg/(kg·d)灌胃，消瘀泄?jié)犸嫿M予消瘀泄?jié)犸?.6 g/(kg·d)灌胃。各組均連續(xù)灌胃8周。

2.2 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.2.1 各組大鼠一般情況 觀察各組大鼠精神狀態(tài)、進(jìn)食、大小便及體質(zhì)量的變化，同時(shí)觀察記錄死亡情況。

2.2.2 腎功能指標(biāo)檢測 末次給藥后24 h,禁食不禁水，各組大鼠用3%戊巴比妥(30mg/kg)麻醉后腹主動脈取血2 mL，3 000 r/min離心15 min后-20 ℃保存，采用全自動生化分析儀檢測SCr、BUN水平。

2.2.3 免疫組化檢測主動脈Ubc、Ube2b、PsmA1蛋白表達(dá) 大鼠處死后，取部分主動脈組織用4%多聚甲醛溶液常規(guī)固定，脫水、石蠟包埋，按二部法進(jìn)行操作，采用ABC染色法，棕黃色為陽性染色區(qū)，每張切片400倍光鏡下隨機(jī)采集5個(gè)不重疊視野，棕黃色為陽性染色區(qū)，測量陽性染色面積；以德國Leica彩色病理圖像分析系統(tǒng)對陽性反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析，計(jì)算出總光密度=∑陽性染色面積(Area)×該部位的平均光密度(Density)，以陽性染色面積和總光密度為參數(shù)進(jìn)行分析。

2.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測Ubc、Ube2b、PsmA1mRNA表達(dá) 大鼠處死后，每組大鼠根據(jù)體質(zhì)量按隨機(jī)數(shù)字表法取6只進(jìn)行檢測。取部分主動脈組織用-70℃冰箱保存。實(shí)時(shí)熒光定量PCR各步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。PCR引物系列參照文獻(xiàn)。見表1

表1 PCR引物序列

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況觀察 正常對照組大鼠體質(zhì)量增長明顯，精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，皮毛有光澤，進(jìn)食及二便正常。模型組在5/6腎切除后死亡1只，體質(zhì)量較正常對照組增長減緩，精神狀態(tài)及反應(yīng)速度較正常對照組欠缺；造模各組在給予高脂飲食后，體質(zhì)量增長明顯，皮毛光澤，飲食亢進(jìn)。在給藥期間立普妥組無死亡，模型對照組和中藥組各有1只大鼠死亡。

3.2 各組大鼠血SCr、BUN水平比較 見表2。

表2 各組大鼠血SCr、BUN水平比較

3.3 各組大鼠主動脈MMP-9、Ubc、Ube2b、PsmA1蛋白表達(dá)的免疫組化檢測結(jié)果 見表3，圖1。胞漿內(nèi)的棕黃色顆粒沉淀為陽性表達(dá)。

表3 各組大鼠主動脈MMP-9、Ubc、 Ube2b、PsmA1蛋白表達(dá)總光密度比較

圖1 各組大鼠主動脈MMP-9、Ubc、Ube2b、PsmA1表達(dá)的免疫組化檢測結(jié)果(×400)

3.4 各組大鼠主動脈UPP各組分mRNA表達(dá)的比較 見表4。

表4 各組大鼠主動脈UbC、Ube2b、PsmA1 mRNA相對表達(dá)量的比較

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為慢性腎衰竭以正氣虧虛為本，濕濁、血瘀等病理產(chǎn)物為標(biāo)，屬中醫(yī)“溺毒”“虛癆”“關(guān)格”等范疇,病機(jī)總屬本虛標(biāo)實(shí)。其中瘀濁是慢性腎衰的主要病理環(huán)節(jié), 而瘀濁蘊(yùn)毒是慢性腎衰進(jìn)展的重要病機(jī)。慢性腎衰竭本虛表實(shí)的基本病機(jī)狀態(tài)，也促進(jìn)了動脈粥樣硬化的形成。在先前的研究中筆者發(fā)現(xiàn)消瘀泄?jié)犸嬙谘泳徛阅I衰竭的同時(shí)可以改善脂代謝紊亂，消瘀泄?jié)犸嫿M大鼠主動脈動脈粥樣硬化病理改變較模型對照組輕[6]。本實(shí)驗(yàn)主要從對主動脈泛素-蛋白酶體通路的影響，探討消瘀泄?jié)犸嬁孤阅I衰竭動脈粥樣硬化的作用機(jī)制。

粥樣硬化性動脈與正常動脈結(jié)構(gòu)顯著的區(qū)別在于動脈硬化(AS)的形成中涉及廣泛的細(xì)胞外基質(zhì)的重建。在動脈粥樣硬化形成過程中基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)起著重要作用[8]。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示消瘀泄?jié)犸嫿M大鼠主動脈組織的MMP-9表達(dá)水平較模型對照組顯著減少，阿托伐他汀組主動脈組織的MMP-9表達(dá)水平也較模型對照組顯著減少；表明消瘀泄?jié)犸嫺⑼蟹ニ⊥瑯涌梢酝ㄟ^抑制MMP-9的表達(dá)穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊，減輕細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，延緩粥樣硬化進(jìn)展。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞中主要的蛋白分解機(jī)制的一部分，參與細(xì)胞內(nèi)蛋白的降解；這些系統(tǒng)也與細(xì)胞事件有關(guān)，包括免疫細(xì)胞和細(xì)胞周期中的抗原呈遞[9-10]。目標(biāo)分子的多泛素化引發(fā)蛋白酶體降解，是由泛素激活酶E1、泛素交聯(lián)酶E2和泛蛋白連接酶E3驅(qū)動的[11]。在泛素化過程中，泛素化靶蛋白被蛋白酶體復(fù)合物識別并被蛋白水解為肽。在這個(gè)過程中，由調(diào)控粒子19S和核心粒子20S組成的26S蛋白酶體在蛋白酶體系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用[12]。與自噬系統(tǒng)相似，功能失調(diào)的蛋白酶體可引起退行性疾病，如阿爾茨海默病、帕金森病和動脈粥樣硬化[13-14]。研究表明泛素蛋白酶體的活化在尿毒癥加速動脈粥樣硬化中起到重要的作用，泛素蛋白酶體抑制劑能起到較好的防治作用[15]。在體外研究中發(fā)現(xiàn)，用尿毒癥患者血清培養(yǎng)的主動脈平滑肌細(xì)胞中泛素-蛋白酶體途徑相關(guān)組分表達(dá)增強(qiáng)[16]。

本研究免疫組化法以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示：相比正常組，模型組主動脈Ubc、Ube2b、PsmA1蛋白以及mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05或P<0.01)，表明泛素-蛋白酶體通路活性上調(diào)；中藥消瘀泄?jié)犸婾PP相關(guān)組分蛋白及mRNA表達(dá)與模型組比較有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。由此認(rèn)為下調(diào)主動脈UPP相關(guān)組分的表達(dá)，是消瘀泄?jié)犸嬛委熉阅I衰竭動脈粥樣硬化的重要機(jī)制之一。