蔣新龍 王 海 張玲丹

(浙江樹人大學生物與環(huán)境工程學院，杭州 310015)

綠原酸是含有羧基和鄰二苯酚羥基的苯丙素類有機酸[1]，是植物在有氧呼吸時經(jīng)桂皮酸途徑產(chǎn)生的苯丙素類化合物，有廣泛的生物活性，在人體中具有顯著的抗氧化、抗病毒、抗衰老、抗腫瘤、抑菌消炎、預防糖尿病、預防心血管疾病、防曬以及改善認知等功能[2-6]，是食品、藥品、化妝品等工業(yè)的重要原料。當前生產(chǎn)綠原酸主要以杜仲﹑金銀花等為原材料，生產(chǎn)成本較高。若以低廉的農(nóng)產(chǎn)品廢棄物為原料提取其中的綠原酸，不僅能有效降低生產(chǎn)成本，還能充分利用資源，減少環(huán)境污染。甘薯皮是甘薯食品生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，可用于制飼料，但大多仍作為廢棄物被丟掉。忻曉庭等[7]采用超聲波輔助提取了甘薯皮中的多酚類物質(zhì)。但迄今鮮有甘薯皮綠原酸提取的相關(guān)報道。目前，綠原酸的提取方法主要有浸提法[8]、索氏提取法[9]、超聲波法[10]、微波法[11]、酶解法[12]、液膜法[13]、超臨界流體萃取法[14]、半仿生提取法[15]等方法?，F(xiàn)有方法不同程度具有步驟繁瑣、操作費時、安全系數(shù)小、生產(chǎn)成本高、不適于大規(guī)模應用等局限性。相對而言，超聲-微波法協(xié)同利用微波場的熱效應和超聲波的空化作用，具有工藝簡單、操作方便、能耗低、效率高等優(yōu)點[16,17]。因為綠原酸具由咖啡酸與奎尼酸組成的縮酚酸多酚結(jié)構(gòu)[2]，其穩(wěn)定性易受存儲溫度、氧氣、pH、光照、金屬離子等諸多因素的影響，使其應用受到限制。改善甘薯皮綠原酸在深度利用過程中的穩(wěn)定性以及延長保質(zhì)期是本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)問題。本實驗借助超聲-微波法從甘薯皮中提取綠原酸，并對其微膠囊化，探索其穩(wěn)定性，為實際生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

甘薯皮(甘薯品種為寧紫4號紅心紅薯)，于65 ℃烘箱烘干，粉碎過40目篩，備用。綠原酸標準品；DPPH·；海藻酸鈉(98.0%)及所用其他試劑均為分析純；所用水為蒸餾水。

CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取/反應儀，UV-1600型紫外可見光譜儀，AB204-N型分析天平， gZX-91400MBE 電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 綠原酸含量的測定

采用紫外分光光度法測定綠原酸含量[18]。以20 μg/mL的綠原酸為標準溶液制作標準曲線。將綠原酸標準溶液用75%乙醇配制成2.0、5.0、7.5、10.0、12.5 μg/mL系列溶液，在329 nm波長下測定其吸光度A。以吸光度A為縱軸、綠原酸質(zhì)量濃度C(μg/mL)作橫軸繪制標準曲線，得到吸光度A與綠原酸質(zhì)量濃度C(μg/mL) 之間的回歸方程為：A=0.053 1C+0.013 02，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，線性范圍 0～12.5 μg/mL。吸取粗提液適量，同法測其吸光值，根據(jù)回歸方程計算綠原酸得率。

式中：n為稀釋倍數(shù)；C為回歸方程計算所得值；V為粗提液總體積。

1.2.2 綠原酸提取實驗

甘薯皮+提取劑→超聲-微波協(xié)同提取→抽濾→粗提液→減壓濃縮→干燥→產(chǎn)品1，置干燥器保存?zhèn)溆谩?/p>

超聲-微波協(xié)同提取綠原酸：準確稱取1.000 0 g甘薯皮粉置于專用三角瓶中，按照不同液料比加入一定濃度乙醇溶液，混合均勻，置于CW-2000 超聲-微波萃取反應儀中。在超聲波開啟狀態(tài)下(超聲波功率和頻率分別為50 W，40 kHz)，調(diào)節(jié)微波功率及提取時間。設(shè)置50%乙醇溶液、液料比80∶1 mL/g、微波功率100 W，提取時間25 min的條件下，采用控制變量法進行單因素實驗。分別設(shè)置乙醇體積分數(shù)梯度30%、40%、50%、60%、70%；液料比梯度40∶1、60∶1、80∶1、100∶1、120∶1 mL/g；提取時間梯度為15、20、25、30、35 min；微波功率梯度為50、100、150、200、250 W，考量乙醇濃度、液料比、微波功率、提取時間四因素對綠原酸得率的影響。在單因素實驗基礎(chǔ)上，利用正交實驗 L9(34)對提取條件進行優(yōu)化。

1.2.3 綠原酸微膠囊制備實驗

為了降低微膠囊產(chǎn)品工業(yè)化生產(chǎn)成本，參考王余夢[19]方法，采用粗提產(chǎn)品制備微膠囊。

制備工藝：芯材(產(chǎn)品1綠原酸+水，綠原酸濃度固定，實驗預試5%較好)；壁材(海藻酸鈉+水)；固化劑(CaCl2+水)→芯材和壁材混合均勻→向固化劑中滴入芯材和壁材混合液固化→抽濾→干燥→微膠囊(產(chǎn)品2)，置干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

采用銳孔法[20]，以海藻酸鈉為壁材，綠原酸為芯材，包埋率為指標，固定條件為針頭孔徑 0.60 mm、下滴高度 8 cm[20,21]，設(shè)置海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)4%、氯化鈣3%、壁芯體積比為2∶1、固化時間25 min的條件下，采用控制變量法進行單因素實驗。分別設(shè)置氯化鈣梯度1%、2%、3%、4%、5%；海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)2%、3%、4%、5%、6%；壁芯體積比梯度1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1；固化時間梯度為10、15、20、25、30 min，考量氯化鈣濃度、包埋提取時間、壁芯體積比、海藻酸納質(zhì)量分數(shù)四因素對包埋率的影響。在單因素實驗基礎(chǔ)上，選取四因素中的三個因素為自變量，利用正交實驗 L9(33)對制備條件進行優(yōu)化。綠原酸包埋率B按公式計算。

式中：A為最初綠原酸原液的吸光度；V為最初綠原酸原液的體積/mL；A1為綠原酸濾液的吸光度；V1為綠原酸濾液的體積/mL。

1.2.4 綠原酸微膠囊穩(wěn)定性實驗

參考陳鋼[22]和江濱[23]方法，將產(chǎn)品1和產(chǎn)品2分別放置于不同溫度(50、60、70、80、90 ℃)的恒溫箱里加熱6 h，計算保存率，考察對微膠囊化前后綠原酸穩(wěn)定性的影響。

1.3 統(tǒng)計方法及分析軟件

均重復測定3次并取平均值，利用Origin8軟件作圖；應用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，并用Duncan多重比較(SSR法)檢驗各處理平均數(shù)之間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯皮綠原酸提取

2.1.1 單因子實驗

由圖1可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加綠原酸得率不斷升高，當乙醇體積分數(shù)達到 50%時達到最大，超過50%時隨乙醇體積分數(shù)的升高綠原酸得率降低。這與綠原酸極性有關(guān)，由于綠原酸含有羥基和鄰二酚基的有機酸[1]，極性相比較大，因此不易被高濃度乙醇溶液提取，所以選 50%為最佳的乙醇體積分數(shù)。隨著液料比的增加，甘薯皮綠原酸得率不斷提高，當液料比達到 80∶1 mL/g時，乙醇溶劑的增加使得細胞內(nèi)外綠原酸濃度差增大，有利于甘薯皮綠原酸的溶出，綠原酸得率都達到最大值。當液料比高于80∶1 mL/g時，液體中間部分的受熱可能較難受到微波輻射，導致傳熱速率下降及綠原酸得率下降。故初步選取最佳液料比為80∶1 mL/g。微波功率100 W 時甘薯皮綠原酸得率最高。微波功率越大，微波對細胞膜的破壞作用越明顯，分子擴散速度也越大，甘薯皮綠原酸滲出就越多。但微波功率超過100 W后，超聲-微波協(xié)同瞬間熱效應過于明顯，使得局部溫度過高導致綠原酸成分破壞，故甘薯皮綠原酸得率反而減小。隨著提取時間增長，溫度升高，分子運動加快，有利于甘薯皮活性成分的溶出。但提取時間達到25 min 后，綠原酸得率反而減小，主要原因是提取體系溫度上升，會破壞其中的活性成分結(jié)構(gòu)。

圖1 提取單因素實驗結(jié)果

2.1.2 正交實驗

在單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的正交實驗方法，對綠原酸提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，實驗設(shè)計和結(jié)果見表1，方差分析結(jié)果見表2。

表1 正交實驗設(shè)計及結(jié)果

表2 方差分析表

表1極差R表明極差影響綠原酸得率的因素主次依次排列為A>D>B>C。由表2方差分析可看出，對綠原酸得率的影響主次依次排列為A>D>B>C，方差分析和極差分析在綠原酸得率影響主次排列上完全一致。表2還可以看出，對綠原酸得率的影響液料比(A)和微波功率(D)顯著，其他則不顯著。直觀分析，實驗最優(yōu)水平組合為A2B3C1D2；依據(jù)每個因素K1、K2、K3實驗的最優(yōu)水平組合為A2B2C2D2。Duncan法分析結(jié)果，乙醇體積分數(shù)40%和50%二水平之間差異顯著，而提取時間20、25 min二水平之間差異不顯著。綜合分析提取成本和得率，確定最佳工藝條件A2B2C1D2，即液料比80:1 mL/g，乙醇體積分數(shù)50%，提取時間20 min，微波功率為100 W。根據(jù)最佳工藝條件A2B2C1D2進行驗證實驗，甘薯皮綠原酸得率分別為14.44%、14.43%、14.45%，平均為14.44%，與預測值無顯著差異。

2.2 綠原酸微膠囊制備

2.2.1 單因子實驗

圖2 微膠囊單因素實驗結(jié)果

由圖2可知，甘薯皮在海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)4%，氯化鈣質(zhì)量分數(shù)3%，壁芯體積比2∶1，固化時間25 min時微膠囊包埋率最高。對于海藻酸鈉體積分數(shù)，包埋率上升較快的在2%～3%范圍，3%～4%時上升較緩，而4%～6%時包埋率下降。綜合微膠囊的包埋率、成型效果和成球難易初步確定海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)為4%。隨著氯化鈣質(zhì)量分數(shù)的增加，微膠囊包埋率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當氯化鈣質(zhì)量分數(shù)為3.0%時, 微膠囊的包埋率最高。氯化鈣質(zhì)量分數(shù)過低，包埋不充分；氯化鈣體積分數(shù)過高，外層在內(nèi)層固化前形成致密的皮層，阻礙凝固劑向內(nèi)層的繼續(xù)擴散和內(nèi)層的充分固化。壁芯體積比2∶1時微膠囊包埋率最高。當壁芯體積比低于2∶1時, 包埋率增加；當壁芯體積比高于2∶1時，包埋率緩慢降低。這可能是因為海藻酸鈣包埋能力有一定限度[24]。所以壁芯體積比選擇2∶1為佳。固化時間太短，氯化鈣與海藻酸鈉交聯(lián)不充分，形成的甘薯皮綠原酸微膠囊膜薄流出，導致包埋率較低；當固化時間超過25 min，包埋率下降?？赡芤驗槁然}通過海藻酸鈉膠囊由外向內(nèi)置換Na+形成海藻酸鈣需要時間，同時隨著固化時間的延長，甘薯皮綠原酸在微膠囊中會由內(nèi)向外擴散, 導致包埋率較低。所以微膠囊固化時間選擇25 min為好。

2.2.2 正交實驗

在單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，Duncan法分析固化時間25 min與其他2個水平差異顯著，所以正交實驗以固化時間為固定值，選取海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度和壁芯體積比3個因素為自變量，以包埋率為評價指標，利用正交實驗L9(33)對提取條件進行優(yōu)化。正交實驗設(shè)計的因子與水平、實驗設(shè)計和結(jié)果、方差分析結(jié)果分別見表3～表5。

表3 正交實驗的因子與水平

表4 正交實驗設(shè)計及結(jié)果

表5 方差分析表

由表4極差R可看出影響綠原酸包埋率的因素主次依次排列為：壁芯體積比(C)>氯化鈣質(zhì)量分數(shù)(B)>海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)(A)。由表5可以看出，對綠原酸包埋率的影響主次依次排列為：壁芯體積比(C)>氯化鈣質(zhì)量分數(shù)(B)>海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)(A)，方差分析和極差分析在綠原酸包埋率影響主次排列上完全一致。表5還可看出，對綠原酸包埋率的影響壁芯體積比(C)和氯化鈣質(zhì)量分數(shù)(B)顯著，海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)(A)則不顯著。直觀分析，實驗的最優(yōu)水平組合為A1B2C2；根據(jù)每個因素K1、K2、K3實驗的最優(yōu)水平組合為A2B2C2。Duncan法分析海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)3%與4%二水平差異顯著，所以綠原酸微膠囊化包埋最佳工藝條件為A2B2C2，即海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)4%，氯化鈣質(zhì)量分數(shù)3%，壁芯體積比為2∶1。根據(jù)最佳工藝條件進行驗證實驗，實驗結(jié)果與預測值無顯著差異。

2.3 綠原酸微膠囊穩(wěn)定性

圖3實驗結(jié)果表明，綠原酸微膠囊化前后產(chǎn)品在不同溫度(50、60、70、80、90 ℃)加熱 6 h，綠原酸微膠囊的穩(wěn)定性明顯比綠原酸好，說明微膠囊包埋可以在一定程度上提高綠原酸的熱穩(wěn)定性。綠原酸微膠囊化之后也可更好地應用到食品、醫(yī)療、化妝品、飼料等領(lǐng)域，基本不用再考慮加工應用時如需要較長提取時間加熱會使綠原酸分解的問題，可大大提高綠原酸的利用率。

圖3 綠原酸微膠囊穩(wěn)定性比較

3 結(jié)論

實驗用超聲-微波協(xié)同提取甘薯皮綠原酸，最佳提取條件：乙醇體積分數(shù)50%、液料比80∶1 mL/g、微波功率為100 W、提取時間25 min，該條件下，得率可達14.44%；微膠囊制備最佳工藝為：海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)4%、氯化鈣質(zhì)量分數(shù)3%、壁芯體積比 2∶1 (mL/mL，芯材質(zhì)量分數(shù)5%)、針頭孔徑 0.60 mm、下滴高度 8 cm，此條件下包埋率可達 85.05%。綠原酸微膠囊化可以提高綠原酸的熱穩(wěn)定性。本研究為甘薯皮的進一步資源化開發(fā)利用提供了借鑒。