楊通衢，韓志桐，趙衛(wèi)平，陳云照，張大鵬，張瑞劍

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；

2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；

3.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040

腦膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，主要由大腦與脊髓內(nèi)癌變的膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。近年來，膠質(zhì)瘤的發(fā)病率明顯上升，占全部顱內(nèi)惡性腫瘤發(fā)病率的81%，5年生存率低于5%，其流行病學(xué)特征呈“三高一低”，即高發(fā)病率、高致死率、高復(fù)發(fā)率以及低治愈率，進(jìn)展迅速［1-2］。腦膠質(zhì)瘤的治療方法主要為手術(shù)切除，并輔以放療或化療，但預(yù)后較差［3］，因此早期診斷在改善患者預(yù)后方面具有重要意義。目前，臨床上即使分辨率最高的影像學(xué)設(shè)備也只能檢測(cè)出5 mm以上的腫塊，病理學(xué)檢查雖可以對(duì)腫瘤組織實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的分期分級(jí)，但有其局限性［4-6］。微流控芯技術(shù)是近年來發(fā)展起來的可精確操控微升、毫升級(jí)別樣品的生物體液活檢技術(shù)，通過控制器件特征尺寸與細(xì)胞尺寸相匹配從而實(shí)現(xiàn)微量循環(huán)腫瘤細(xì)胞循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）的富集［7-8］。多項(xiàng)研究表明，由于CTC攜帶了腫瘤所有基因，可及時(shí)反映腫瘤的動(dòng)態(tài)信息，因此，可作為生物體液活檢重要標(biāo)志物［9-12］。然而，CTC在腦膠質(zhì)瘤中的研究較少。本研究通過微流控芯技術(shù)對(duì)外周血中的膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行富集可實(shí)時(shí)掌握腫瘤進(jìn)展動(dòng)態(tài)，為腫瘤的早期診斷、個(gè)體化治療以及預(yù)后提供重要的依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2016年3月—2020年3月內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科收治的96例腦膠質(zhì)瘤患者，其中男性56例，女性40例，年齡在19～71歲，平均年齡（56.25±7.96）歲，病程1～4年，平均病程（10.84±5.26）個(gè)月。診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合《腦膠質(zhì)瘤診療規(guī)范（2018年版）》［13］規(guī)定的相關(guān)癥狀及影像學(xué)特征：患者主要表現(xiàn)為頭痛、眩暈、意識(shí)喪失、視物模糊，甚至大腦功能區(qū)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)、語言以及感覺功能異常等癥狀，CT掃描顯示不同密度灶，可見增強(qiáng)的腫瘤包膜，部分患者腫瘤周邊存在水腫，磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）顯示額葉膠質(zhì)瘤28例，顳葉膠質(zhì)瘤19例，頂葉膠質(zhì)瘤9例，丘腦葉膠質(zhì)瘤4例。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡大于18周歲；肝腎功能正常；無傳染性疾?。换颊吲R床資料完整；患者知情同意并自愿參加本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并血液系統(tǒng)腫瘤患者；合并精神科疾病存在認(rèn)知功能障礙的患者；研究期間死亡的患者。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CTC的收集

采集所有患者手術(shù)前外周血4 mL于抗凝管內(nèi)，加入4 mL紅細(xì)胞裂解液緩慢吹打后室溫下靜置10 min對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行充分裂解，隨后離心取下層沉淀細(xì)胞，加入10 mL磷酸鹽緩沖生理鹽水（phosphate-buffered saline，PBS）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸。

1.2.2 CTC的富集

將收集到的細(xì)胞懸液，以2 mL/min的流速依次經(jīng)過微流控芯分選裝置和免疫磁珠純化裝置，選用4段微柱式結(jié)構(gòu)串聯(lián)而成的分選芯片，注入其中的細(xì)胞根據(jù)自身的尺寸分別被不同段的微柱捕捉。本研究中4段微柱的尺寸分別為20、15、10和5 μm，CTC在10 μm處被捕捉后形成富集液，將富集液均勻攤至載玻片上。

1.2.3 CTC的鑒定

將上述取得的含CTC載玻片用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，5 min后PBS洗滌，采用0.5%Triton X-100通透細(xì)胞15 min，洗滌后用1%BSA進(jìn)行封閉60 min，加入CD133、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、CD45一抗后4 ℃溫育過夜，次日取出PBS洗滌后加入相應(yīng)的熒光二抗37 ℃避光溫育60 min（此后均避光），洗滌后加入DAPI細(xì)胞核染色液染色10 min，洗滌后加入20 μL水溶性封片液封片，并置于熒光顯微鏡下觀察。

1.3 觀察指標(biāo)

采用免疫熒光法觀察并鑒定微流控芯技術(shù)富集的CTC細(xì)胞特點(diǎn)（CTC為CD133+CD45-；白細(xì)胞為CD133-CD45+）。

術(shù)后隨訪3年，單因素分析腦膠質(zhì)瘤患者外周血CTC的檢測(cè)與腦膠質(zhì)瘤臨床特征的關(guān)系，臨床指標(biāo)包括年齡、性別、KPS評(píng)分、NSE、血清膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、腫瘤分期、組織學(xué)類型以及是否存在囊性病變等，并對(duì)篩選出的相關(guān)性指標(biāo)進(jìn)行多因素logistic回歸分析，制作預(yù)測(cè)的受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線和腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后生存率曲線。腦膠質(zhì)瘤分期主要為4級(jí)：Ⅰ級(jí)為毛細(xì)胞型星型細(xì)胞瘤，占5%；Ⅱ級(jí)為星型膠質(zhì)瘤或少突膠質(zhì)瘤細(xì)胞，占30%～40%；Ⅲ期為間變性膠質(zhì)瘤，占腦膠質(zhì)瘤的15%～25%；Ⅳ級(jí)為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，占膠質(zhì)瘤細(xì)胞的1/3。參照《腦膠質(zhì)瘤的分類和病理診斷》判定是否存在囊性病變，結(jié)合影像學(xué)如CT或MRI檢查確定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并以x±s形式描述，計(jì)數(shù)資料采用χ2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并以頻數(shù)或頻率n（%）表示。以腦膠質(zhì)瘤患者CTC檢測(cè)情況為因變量，以危險(xiǎn)因子為自變量，擬合多元logistic回歸方程，分析各危險(xiǎn)因素對(duì)CTC檢測(cè)情況的綜合影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤患者CTC檢測(cè)情況

經(jīng)微流控芯技術(shù)對(duì)CTC進(jìn)行富集，采用免疫熒光染色對(duì)CTC進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，本研究中96例腦膠質(zhì)瘤患者中41例外周血均檢測(cè)出CTC，檢測(cè)陽性率為42.71%，外周血檢測(cè)出的CTC數(shù)目為（4～103）/mL，平均數(shù)目為（66.27±6.36）/mL?；颊咄庵苎狢TC和白細(xì)胞在免疫熒光顯微鏡下熒光特點(diǎn)見圖1。

圖1 腦膠質(zhì)瘤患者外周血CTC與白細(xì)胞鑒定Fig.1 Identification of CTCs and leukocytes in the peripheral blood of patients with glioma

2.2 腦膠質(zhì)瘤患者外周血CTC的數(shù)量與腦膠質(zhì)瘤臨床特征的單因素分析結(jié)果

外周血CTC的數(shù)量與腦膠質(zhì)瘤臨床病理學(xué)特征單因素分析結(jié)果顯示，外周血CTC的數(shù)量與患者的腫瘤分期、總生存期（overall survival，OS）、是否存在囊性病變及NSE的表達(dá)情況密切相關(guān)（P<0.05），與年齡、性別、KPS評(píng)分及GFAP等臨床特征無相關(guān)性（表1）。

表1 腦膠質(zhì)瘤患者外周血CTC與腦膠質(zhì)瘤臨床特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between CTCs in peripheral blood of patients with glioma and clinical features of glioma n (%)

2.3 Logistic回歸分析結(jié)果

在單因素回歸分析基礎(chǔ)上，對(duì)腫瘤分期、組織學(xué)類型、是否存在囊性病變以及NSE的表達(dá)情況進(jìn)行二元logistic回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤分期（OR=4.914，95% CI：1.535～15.734）、組織學(xué)類型（OR=0.187，95% CI：0.061～0.575）以及NSE的表達(dá)情況（OR=8.390，95% CI：2.922～24.089）與CTC陽性密切相關(guān)，CTC陽性發(fā)生的最終概率預(yù)測(cè)模型為P=1／［1+e（1.384-1.592腫瘤分期+1.676OS+2.127NSE）］（表2）。

表2 多因素回歸分析結(jié)果Tab.2 Multivariate regression analysis results

2.4 ROC曲線評(píng)估腦膠質(zhì)瘤預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)性

將腫瘤分期、組織學(xué)類型以及NSE作為檢驗(yàn)變量，作ROC曲線分析。得出腫瘤分期、組織學(xué)類型以及NSE的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.645、0.687、0.720，預(yù)測(cè)概率AUC為0.814，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表3、圖2）。

圖2 腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤分期、組織學(xué)類型以及NSE預(yù)后評(píng)估的ROC曲線Fig.2 ROC curves of tumor stage,histological type and prognostic value of NSE in patients with glioma

表3 腫瘤類型、腫瘤分期、組織學(xué)類型以及NSE的AUCTab.3 AUC of tumor type,tumor stage,histological type and NSE

2.5 腦膠質(zhì)瘤患者外周血CTC與預(yù)后的關(guān)系

本研究中96例患者隨訪結(jié)果顯示，自隨訪開始，CTC陽性組患者的生存率均明顯高于CTC陰性組患者，經(jīng)log-rank檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中CTC陽性組患者生存中位數(shù)為699 d，陰性組患者生存中位數(shù)為1 131 d（圖3）。

圖3 患者生存率曲線Fig.3 Survival curves of patients

3 討 論

目前已知的液體活檢技術(shù)主要包括CTC、循環(huán)腫瘤DNA和細(xì)胞外囊泡，細(xì)胞外囊泡包括凋亡小體、微泡和外泌體［14］。研究表明，循環(huán)腫瘤DNA在人體內(nèi)含量豐富，在腦膠質(zhì)瘤患者的血漿中可以監(jiān)測(cè)到循環(huán)腫瘤DNA，且與腫瘤組織樣本的基因圖譜具有同等追蹤突變以及突變模式的能力［15-16］。另有研究證實(shí)，雖然循環(huán)腫瘤DNA具有高度特異性，利于檢測(cè)，但是由于其半衰期較短，在人體內(nèi)1～2 h即可降解［17］。CTC的檢測(cè)難點(diǎn)在于其數(shù)量極少，通常臨床研究的樣本包含了大量的細(xì)胞信息，其中CTC僅占據(jù)其中的1/109，因此對(duì)于CTC的分選要求較高。微流控芯技術(shù)利用不同細(xì)胞在大小、形狀上的差異，設(shè)計(jì)出可控的微結(jié)構(gòu)進(jìn)行過濾，分離出所需的CTC，從而達(dá)到分選富集的目的。微流控芯技術(shù)通過富集并檢測(cè)血液中的CTC可直接反映腫瘤的類型和大小，進(jìn)而輔助判斷患者存活時(shí)間。該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)在肺癌腦轉(zhuǎn)移患者中進(jìn)行了科學(xué)研究和臨床探索，具有精準(zhǔn)、微創(chuàng)、簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤的早期診斷與預(yù)測(cè)方面具有較強(qiáng)的價(jià)值［18］。然而由于CTC在人體外周血中數(shù)量極少，在109數(shù)量級(jí)細(xì)胞內(nèi)才可能發(fā)現(xiàn)少數(shù)的CTC，此外，人體存在血腦屏障的作用，CTC在膠質(zhì)瘤方面的研究目前較少［19-20］。

由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面主要表達(dá)特異性的CD133分子，且CD133也是腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵指標(biāo)，CD133陽性的膠質(zhì)瘤細(xì)胞可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腦內(nèi)腫瘤血管的形成［21-22］。本研究通過微流控芯技術(shù)檢測(cè)并利用免疫熒光法進(jìn)行鑒定，得出96例腦膠質(zhì)瘤患者中CTC陽性檢出率為42.71%，平均數(shù)目為（66.27±6.36）/mL，表明微流控芯技術(shù)可有效地富集腦膠質(zhì)瘤患者的外周血CTC，但稍低于其他腫瘤的檢出率［20］，可能與人體存在血腦屏障有關(guān)，這也是腦膠質(zhì)瘤外周血檢測(cè)CTC面臨的突出問題，同時(shí)推測(cè)可能也與本研究收集的樣本量較小有關(guān)。多因素回歸分析及ROC曲線分析［23］結(jié)果顯示，外周血CTC的檢測(cè)與患者的腫瘤分期、OS、NSE的表達(dá)密切相關(guān)（P<0.05），提示神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)NSE異?？赡軈⑴c了腦膠質(zhì)瘤患者外周血CTC釋放過程。NSE是神經(jīng)元或神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的一種特異性蛋白質(zhì)，當(dāng)神經(jīng)元或血腦屏障受損時(shí)，大量的NSE釋放入血，產(chǎn)生腦部癥狀，且腦部癥狀嚴(yán)重程度與NSE濃度呈正比，NSE現(xiàn)主要作為神經(jīng)母細(xì)胞瘤與肺癌腦轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志物［24-25］。本研究中NSE作為腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的一項(xiàng)重要指標(biāo)，可能通過影響腦膠質(zhì)瘤的臨床分期，進(jìn)而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞釋放入血的水平。

基于以上臨床特征的多因素回歸分析結(jié)果，對(duì)患者的預(yù)后進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，兩組患者2和3年生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)CTC可能與腦膠質(zhì)瘤患者病程尤其是腫瘤惡化程度相關(guān)，患者確診時(shí)間越久，腫瘤的惡化程度就越嚴(yán)重，釋放入血的CTC可聚集成灶，進(jìn)而發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此，腦膠質(zhì)瘤患者外周血CTC可作為遠(yuǎn)期預(yù)后的一項(xiàng)重要指標(biāo)，臨床醫(yī)師可根據(jù)患者外周血CTC水平采取相應(yīng)的干預(yù)措施，改善腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中GFAP檢出結(jié)果對(duì)其外周血CTC數(shù)量影響相對(duì)有限，不同GFAP檢出情況患者外周血CTC數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。原因在于中間絲蛋白GFAP雖然特異表達(dá)于正常膠質(zhì)細(xì)胞、腫瘤性星形矯治細(xì)胞、室管膜細(xì)胞中，但主要作用是維持星形細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)功能，繼而影響細(xì)胞分化。GFAP與腦腫瘤分化密切相關(guān)，病情輕微的患者［世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）分級(jí)Ⅱ～Ⅳ級(jí)］中樞神經(jīng)系統(tǒng)低氧損傷程度較輕，GFAP檢出結(jié)果本身就無顯著差異，亦不會(huì)顯著影響外周血CTC數(shù)量。

綜上所述，本研究建立的微流控芯技術(shù)可定量檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤患者外周血CTC，其水平與腫瘤分期、OS、NSE的表達(dá)密切相關(guān)，且直接影響腦膠質(zhì)瘤患者遠(yuǎn)期生存率。因此，外周血CTC可作為腦膠質(zhì)瘤患者診斷、預(yù)后尤其是轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。