張美智子，郭佳雯，周麗麗，程 玉

承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000

2018年，全球新發(fā)胃癌病例約1 000 000例，發(fā)病率位居第五，死亡病例約783 000例，死亡率位居第三［1］。在中國(guó)，胃癌發(fā)病率和死亡率均高居第二位［2］。胃癌發(fā)病十分隱匿，確診時(shí)大多已到中晚期。通過(guò)了解胃癌的潛在發(fā)病機(jī)制和病因，將有助于發(fā)現(xiàn)胃癌晚期治療和診斷的生物標(biāo)志物。DDX19A（DEAD-box helicase 19A）作為RNA解旋酶DDX蛋白超家族的成員之一，被鑒定為一種新的細(xì)胞質(zhì)RNA傳感器，在病毒感染過(guò)程中可以激活NLRP3炎癥小體［3］。新近有文獻(xiàn)［4］報(bào)道，DDX19A通過(guò)誘導(dǎo)NOX1介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生促進(jìn)宮頸鱗狀細(xì)胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）轉(zhuǎn)移。然而目前尚未明確DDX19A在胃癌中的表達(dá)及作用。本研究結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索資料，采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)DDX19A在胃癌組織中的表達(dá)，分析其表達(dá)與胃癌臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集2011—2015年承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科存檔的胃癌組織（經(jīng)4%的甲醛溶液固定后用石蠟包埋）標(biāo)本109例，癌旁胃黏膜標(biāo)本30例，所有患者臨床病理學(xué)資料完整。109例胃癌標(biāo)本中男性83例，女性26例；年齡≤58歲（中位年齡）者56例，＞58歲者53例；腫瘤直徑≤5.0 cm者59例，＞5.0 cm者50例；高-中分化52例，低分化57例；侵及漿膜層78例，未侵及漿膜者31例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期57例，Ⅲ期52例。109例胃癌標(biāo)本中有69例具有完整的預(yù)后信息，隨訪時(shí)間為2～71個(gè)月，平均隨訪時(shí)間43.5個(gè)月。另收集16對(duì)新鮮胃癌與癌旁配對(duì)組織，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。本研究經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入患者均知情同意。

1.2 主要試劑

BCA蛋白定量試劑盒、RIAP蛋白裂解試劑盒和蛋白酶抑制劑（PMSF）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，免疫組織化學(xué)S-P試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人DDX19A多克隆抗體、β-actin鼠抗人單克隆內(nèi)參抗體購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 數(shù)據(jù)庫(kù)

UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu）是基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和MET500隊(duì)列數(shù)據(jù)的交互式網(wǎng)絡(luò)資源，可以用來(lái)分析腫瘤與正常組織相關(guān)基因的表達(dá)及其與相關(guān)臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系［5］。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)源自高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）、歐洲基因組-表型組檔案數(shù)據(jù)庫(kù)（European Genomephenome Archive，EGA）和TCGA的基因芯片和RNA-Seq數(shù)據(jù)，能評(píng)估54 000個(gè)基因?qū)?1種癌癥類(lèi)型生存率的影響［6］。

1.3.2 Western blot

取適量于-80 ℃冰箱凍存的胃癌及配對(duì)正常胃黏膜組織，加入RIAP裂解液和蛋白酶抑制劑（100∶1配比）后充分研磨。BCA試劑盒蛋白定量后，按比例加入loading buffer緩沖液煮沸10 min使蛋白變性。每孔60 μg總蛋白上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE膠電泳后，75 V電壓1.5 h將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗DDX19A（1∶2 000）和內(nèi)參一抗β-actin（1∶10 000）4 ℃搖床溫育過(guò)夜。TBST洗膜10 min×3次后，二抗（1∶5 000）常溫溫育1 h，洗膜后ECL顯影。Image J軟件計(jì)算灰度值。

1.3.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)及判讀

石蠟包埋組織4 μm厚連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇至水，檸檬酸高壓修復(fù)2.5 min。按S-P免疫組織化學(xué)試劑說(shuō)明書(shū)依次滴加A、B液，之后DDX19A（1∶50）一抗4 ℃溫育過(guò)夜。次日，滴加C、D液，DAB顯色，蘇木精染色。同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照。每張切片由2位高年資病理科醫(yī)師分別獨(dú)立閱片。參照文獻(xiàn)［7］判讀標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)細(xì)胞染色深淺計(jì)分：不著色記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分；依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜1%記0分，1%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，76%～100%記4分；將兩項(xiàng)得分相乘：≤4分記為低表達(dá)組，＞4分記為高表達(dá)組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用SPSS 20.0軟件，采用Graph Prism 7.0軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。計(jì)數(shù)資料組間差異的比較及與臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用表示，組間差異采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UALCAN及Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析

利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)，轉(zhuǎn)錄水平分析DDX19A在415例胃癌組織及34例正常胃組織中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)DDX19A在胃癌組織中顯著高表達(dá)（P＜0.001，圖1A）。進(jìn)一步分析胃癌中DDX19A的表達(dá)與臨床分期的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)胃癌的臨床病理學(xué)分期越高，DDX19A的表達(dá)也越高（圖1B）。檢索Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，DDX19A基因高表達(dá)組胃癌患者總生存期（overall survival，OS）、無(wú)病生存期（diseasefree survival，DFS）均明顯短于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1C、D）。

圖1 數(shù)據(jù)庫(kù)分析DDX19A在胃癌中的表達(dá)水平及臨床意義Fig.1 The expression and clinical significance of DDX19A in gastric cancer were analyzed by database

2.2 Western blot法檢測(cè)新鮮配對(duì)標(biāo)本中DDX19A的表達(dá)

16對(duì)胃癌及癌旁配對(duì)標(biāo)本中有12對(duì)（75%）的DDX19A蛋白表達(dá)水平明顯升高（圖2A）。經(jīng)過(guò)灰度值計(jì)算，DDX19A蛋白在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為3.57±0.66，明顯高于癌旁胃黏膜（1.58±0.61），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2B）。

圖2 胃癌及癌旁胃黏膜中DDX19A的蛋白水平Fig.2 Level of DDX19A protein in gastric cancer and adjacent gastric mucosa

2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)胃癌石蠟標(biāo)本中DDX19A的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示DDX19A陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。109例胃癌標(biāo)本中，DDX19A高表達(dá)75例，陽(yáng)性率為68.8%，其在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁胃黏膜（10/30，33.3%）（P＜0.01，表1）。如表2所示，DDX19A高表達(dá)與胃癌分化程度、浸潤(rùn)深度、TNM分期有關(guān)（P＜0.05）；而與患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P＞0.05）。結(jié)合隨訪資料，采用Kaplan-Meier法分析69例患者生存狀態(tài)，log-rank檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DDX19A高表達(dá)的胃癌患者總生存期較短（P＜0.05，圖3）。

表1 癌旁胃黏膜及胃癌組織中DDX19A表達(dá)差異Tab.1 Difference of DDX19A expression in adjacent gastric mucosa and gastric cancer tissues(n)

表2 胃癌組織中DDX19A高表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性Tab.2 Correlation between high expression of DDX19A and clinicopathological features in gastric cancer(n)

圖3 DDX19A蛋白在胃癌及癌旁胃黏膜的表達(dá)及預(yù)后價(jià)值Fig.3 Expression of DDX19A protein and its prognostic value in gastric cancer and adjacent gastric mucosa

3 討 論

DEAD-box RNA解旋酶幾乎存在于所有真核生物以及大多數(shù)細(xì)菌和一些古細(xì)菌中，該家族屬于RNA解旋酶中的第二超家族，也是真核生物RNA解旋酶中最大的一類(lèi)［8］。該家族蛋白以保守的氨基酸序列（Asp-Glu-Ala-Asp/His）命名，能夠以ATP酶依賴(lài)的方式釋放和重組具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA分子。它們能重塑發(fā)夾結(jié)構(gòu)和RNA蛋白復(fù)合體等復(fù)雜的RNA結(jié)構(gòu)，幾乎在所有的mRNA處理和翻譯步驟中扮演著關(guān)鍵的角色［9］。DDX19A是一種重要的DEAD-box RNA解旋酶，其在進(jìn)化上高度保守的氨基酸序列預(yù)示著其存在強(qiáng)大的生物學(xué)功能。DDX19A定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)，在其蛋白質(zhì)的N-末端識(shí)別出一個(gè)核輸出信號(hào)和一個(gè)核輸入信號(hào)，使它們能夠在隔層之間穿梭。本研究中免疫組織化學(xué)結(jié)果也證實(shí)DDX19A在組織中表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，預(yù)示著其可能具有信號(hào)傳輸功能。DDX19A的活性中心由兩個(gè)高度保守的類(lèi)RecA結(jié)構(gòu)域組成，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域由一個(gè)鉸鏈區(qū)連接，其N(xiāo)末端延伸對(duì)其自身調(diào)節(jié)非常重要，決定了酶的特異性［10］。

癌細(xì)胞嚴(yán)重依賴(lài)RNA解旋酶來(lái)滿足不斷增加的一般蛋白質(zhì)合成需求，而且也需要翻譯特定的致癌因子mRNA來(lái)提高存活率［9］。鑒于DEADbox RNA解旋酶對(duì)RNA的強(qiáng)大調(diào)控作用，越來(lái)越多的研究［11-15］證實(shí)該家族成員在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色。

最近，有文獻(xiàn)［4］報(bào)道，DDX19A在CSCC組織中高表達(dá)，DDX19A高表達(dá)與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和患者不良臨床預(yù)后呈正相關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)DDX19A可促進(jìn)CSCC細(xì)胞的遷移和侵襲。然而，到目前為止，DDX19A在胃癌中的作用尚不清楚。因此，我們分析了DDX19A在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義，采用Western blot及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)DDX19A在胃癌組織及癌旁胃黏膜的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃癌中DDX19A的表達(dá)顯著高于癌旁對(duì)照組，此結(jié)果與UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)論相符。DDX19A高表達(dá)與胃癌臨床病理學(xué)特征相關(guān)，患者臨床表現(xiàn)越差，即分化越低、浸潤(rùn)越深、分期越高，DDX19A的表達(dá)水平越高，并且DDX19A高表達(dá)的患者OS較短。這與Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果DDX19A高表達(dá)患者OS及DFS較短一致。以上結(jié)果提示DDX19A極有可能作為一個(gè)新的原癌基因，參與調(diào)控胃癌的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，促進(jìn)胃癌的惡性進(jìn)展。

當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)不可避免地也存在不足之處：①樣本量過(guò)少，存在選擇偏倚的可能性，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。② 未進(jìn)行體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及深入的作用機(jī)制研究。未來(lái)有必要深入探究DDX19A對(duì)胃癌細(xì)胞惡性表型的影響及其作用機(jī)制，為胃癌的診斷和治療提供新的線索。