黃 靈，鄒有瑞，馬 悅，李琢琦，高鑫義，阿布拉古，馬 輝

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；

2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科，寧夏 銀川 750004；

腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤［1］，生長(zhǎng)速度快，浸潤(rùn)能力強(qiáng)［2］。膽堿激酶α（choline kinase alpha，CHKα）在多種腫瘤中高表達(dá)［3-6］，但是CHKα在膠質(zhì)瘤中的作用，特別是對(duì)患者生存的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)染色的方法觀察不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中CHKα蛋白的表達(dá)情況，并采用生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)臨床數(shù)據(jù)分析對(duì)臨床病例結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，初步探索CHKα在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中表達(dá)的臨床病理學(xué)意義及其預(yù)后判斷價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

回顧并分析寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科2017年1月—2019年12月收治的120例膠質(zhì)瘤患者的臨床病理學(xué)資料。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將腫瘤分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)。120例患者中，男性61例（50.8%），女性59例（49.2%），年齡4～77歲，中位年齡（47.75±17.29）歲。本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①接受根治性外科手術(shù)切除治療；② 術(shù)后病理學(xué)確診；③術(shù)前未接受任何放化療；④ 無(wú)內(nèi)臟器官器質(zhì)性病變及功能異常；⑤ 血、尿、糞、肝、腎、心功能檢查無(wú)異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①?gòu)?fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤；②合并其他惡性腫瘤；③術(shù)前有接受化療和（或）放療病史；④ 接受分子靶向藥物治療病史。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中CHKα蛋白的水平

將手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤組織經(jīng)3.7%甲醛溶液進(jìn)行常規(guī)固定、脫水，包埋并切成4 μm的切片行H-E染色。根據(jù)免疫組織化學(xué)法實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行脫蠟、常規(guī)抗原修復(fù)后，使用封閉液封閉2 h，加入CHKα抗體（兔抗人CHKα，英國(guó)Abcam公司，稀釋比為1∶200）溫育2 h，使用PBS洗凈后加入相應(yīng)種屬二抗（工作液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。加入DAB顯色液及蘇木精常規(guī)復(fù)染后，進(jìn)行封片、干燥，觀察CHKα蛋白的表達(dá)情況。本次實(shí)驗(yàn)采用EnVision二步法進(jìn)行染色。CHKα以細(xì)胞質(zhì)棕黃色為陽(yáng)性。

1.3 免疫組織化學(xué)判讀標(biāo)準(zhǔn)

所有病理組織切片由2位病理科醫(yī)師雙盲閱片。使用Capture 2.1顯微鏡圖片采集軟件選擇染色均勻且不相鄰的3個(gè)高倍視野（×400）進(jìn)行拍照，按照陽(yáng)色細(xì)胞所占百分比及顯色強(qiáng)度作為判別依據(jù)，CHKα蛋白以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性顯色。計(jì)數(shù)在該視野下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的占比取平均值。

1.4 隨訪

對(duì)所選患者進(jìn)行術(shù)后電話隨訪。隨訪內(nèi)容包括患者的睡眠、飲食、是否轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、是否有新的并發(fā)癥等?；颊呱鏁r(shí)間為入院經(jīng)手術(shù)后病理學(xué)檢查確診時(shí)間，終點(diǎn)時(shí)間為隨訪時(shí)死亡或終止觀察的時(shí)間，若患者因膠質(zhì)瘤導(dǎo)致相關(guān)死亡，則隨訪終止。

1.5 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及方法

使用在線數(shù)據(jù)分析CHKα在不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，利用UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/）分析已公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)中CHKα在高低分化的腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，下載相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用χ2檢驗(yàn)分析CHKα在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)差異與預(yù)后的關(guān)系，總的生存時(shí)間為終點(diǎn)時(shí)間與起始時(shí)間之差，采用單因素分析影響膠質(zhì)瘤預(yù)后相關(guān)的危險(xiǎn)因素，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并進(jìn)行生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理學(xué)特征

高、低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者吸煙與不吸煙例數(shù)分別為18例（15.0%）和102例（85.0%）。高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者死亡54例，存活2例；低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者死亡6例，存活48例。高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者發(fā)病年齡為（58.17±12.14）歲。低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者發(fā)病年齡為（38.07±16.21）歲。膠質(zhì)瘤主要位于幕上，分別為額葉46例（38.3%）、顳葉36例（30.0%）、頂葉14例（11.7%）、枕葉10例（8.3%）、其他14例（11.7%），腫瘤直徑（45.78±15.63）mm，平均直徑45.78 mm。根據(jù)2016年WHO修訂版膠質(zhì)瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ/Ⅱ級(jí)58例（48.3%），Ⅲ/Ⅳ級(jí)62例（51.7%），具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 影響120例膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的單因素分析Tab.1 Analysis of single factor affecting the prognosis of 120 glioma patients［n (%)］

2.2 免疫組織化學(xué)CHKα蛋白檢測(cè)結(jié)果

本次免疫組織化學(xué)染色共檢測(cè)膠質(zhì)瘤標(biāo)本109例（90.8%）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHKα蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在Ⅰ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中CHKα的表達(dá)率分別為9.77%、7.81%、95.03%和92.90%。CHKα蛋白在高、低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。根據(jù)2016年WHO修訂版的膠質(zhì)瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)，病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，CHKα蛋白平均表達(dá)率在毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤為9.80%，彌漫性星形細(xì)胞瘤為7.80%，間變型星形細(xì)胞瘤為95.15%，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤為93.10%（表2）。經(jīng)計(jì)數(shù)表達(dá)CHKα蛋白膠質(zhì)瘤細(xì)胞在總體細(xì)胞中的占比后可知，CHKα蛋白在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)明顯高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞（P＜0.05，表2，圖1）。

表2 CHKα表達(dá)量與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab.2 Relationship between CHKα expression and clinicopathological features

圖1 病理學(xué)診斷結(jié)果Fig.1 The pathological diagnosis

2.3 隨訪情況

截至2021年6月30日，在120例患者中，失訪10例，隨訪率為91.67%，死亡60例。

2.4 預(yù)后及Kaplan-Meier生存曲線分析

高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者主要并發(fā)癥為原位腫瘤復(fù)發(fā)、癲癇及顱內(nèi)囊性實(shí)變。低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者并發(fā)癥主要為原位腫瘤復(fù)發(fā)及癲癇。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)因CHKα表達(dá)量、腫瘤直徑、患者年齡、膠質(zhì)瘤級(jí)別的不同而異（P＜0.01，表1）。單因素分析結(jié)果顯示，不同的病理學(xué)分級(jí)、年齡、腫瘤直徑的膠質(zhì)瘤患者術(shù)后總生存期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。性別、腫瘤位置、吸煙對(duì)膠質(zhì)瘤患者術(shù)后總生存期的影響不大，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

我們進(jìn)一步根據(jù)CHKα蛋白的表達(dá)情況及患者的生存時(shí)間，繪制Kaplan-Meier生存曲線。CHKα低表達(dá)患者總生存期較CHKα高表達(dá)患者長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009，圖2）。

圖2 CHKα表達(dá)量不同的膠質(zhì)瘤患者的生存曲線Fig.2 The survival curves of glioma patients with different CHKα expressions

2.5 生物信息學(xué)分析結(jié)果

應(yīng)用UALCAN在線工具對(duì)癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中CHKα表達(dá)水平進(jìn)行比較，下載TCGA部分轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)并進(jìn)行生存分析。結(jié)果顯示，CHKα在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)顯著升高，CHKα表達(dá)差異與腦膠質(zhì)瘤患者生存率呈正相關(guān)（P＜0.001，圖3）。

圖3 TCGA 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果Fig.3 Analysis of TCGA transcriptome sequencing data

3 討 論

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性腦腫瘤，發(fā)病因素與遺傳和環(huán)境密切相關(guān)，約占顱內(nèi)惡性腫瘤的80%［7］，其惡性程度與病理學(xué)分級(jí)密切相關(guān)，病理學(xué)分級(jí)越高，惡性程度就越高［8］。因腫瘤的生長(zhǎng)方式主要是浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，因此具有侵襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差的特點(diǎn)［9-11］，這給膠質(zhì)瘤患者的治療帶來(lái)了極大的困難［12-13］。本研究觀察了CHKα蛋白在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中的表達(dá)水平。本課題組采用免疫組織化學(xué)染色檢查，結(jié)果顯示，在彌漫性星形細(xì)胞瘤與少突膠質(zhì)瘤及同級(jí)別之間的各亞型的膠質(zhì)瘤CHKα的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，在各級(jí)別膠質(zhì)瘤中我們只選取了一種類型的膠質(zhì)瘤作為本次研究對(duì)象。本研究結(jié)果顯示，CHKα蛋白在高級(jí)別患者膠質(zhì)瘤中相對(duì)表達(dá)量明顯高于低級(jí)別的膠質(zhì)瘤組織。本研究進(jìn)一步分析了CHKα蛋白表達(dá)水平與性別、年齡、WHO分級(jí)、腫瘤直徑等臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，CHKα蛋白的表達(dá)與腫瘤直徑、年齡、膠質(zhì)瘤級(jí)別密切相關(guān)，腫瘤直徑≥6.0 mm、WHO為Ⅲ或Ⅳ級(jí)、年齡＞65歲膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中CHKα蛋白表達(dá)率明顯要高于腫瘤大?。?.0 cm、WHOⅠ或Ⅱ級(jí)、年齡＜65歲腦膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織中CHKα蛋白的表達(dá)量。

TCGA為目前全球腫瘤數(shù)據(jù)收集最全面、最規(guī)范的數(shù)據(jù)庫(kù)［14-15］。本研究依托患者病歷數(shù)據(jù)庫(kù)并結(jié)合相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示高表達(dá)CHKα蛋白的患者總體生存期更短，提示CHKα為腦膠質(zhì)瘤的不良預(yù)后因子，與本研究結(jié)果一致。

有研究［16］報(bào)道，CHKα蛋白的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移等過(guò)程密切相關(guān)。Hu等［17］的研究結(jié)果顯示，CHKα過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)消化系統(tǒng)腫瘤的轉(zhuǎn)移及增加不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)。Ramírez de Molina等［18］的研究發(fā)現(xiàn)，CHKα高表達(dá)可增加肺癌患者的復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)。CHKα蛋白的高表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響及機(jī)制仍然不清。有研究［19］報(bào)道，CHKα能夠催化磷脂酰膽堿的生成，同時(shí)在二磷酸胞嘧啶膽堿的合成途徑中參與磷脂酰膽堿和其他膜磷脂的合成。單因素分析發(fā)現(xiàn)，CHKα蛋白過(guò)表達(dá)多發(fā)生于高級(jí)別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，而在星形細(xì)胞瘤（Ⅰ級(jí)）、毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤（Ⅰ級(jí)）卻不常見(jiàn)。生存分析結(jié)果還提示，CHKα高表達(dá)的患者生存率明顯低于CHKα低表達(dá)的患者（P＜0.05），這可能與膠質(zhì)瘤內(nèi)部腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性有關(guān)［20］，其腫瘤細(xì)胞外部形態(tài)與患者預(yù)后可能存在相關(guān)關(guān)系［21］。高級(jí)別膠質(zhì)瘤包括WHO Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤［22］，其治療的方式通常是術(shù)中全切聯(lián)合術(shù)后放化療［23-25］。盡管臨床上對(duì)于高級(jí)別膠質(zhì)瘤的治療方案有多種，但患者的治療效果仍然不理想，術(shù)后復(fù)發(fā)率仍較高［26-27］。預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)時(shí)間（time to occurrence，TTR）對(duì)治療高級(jí)別膠質(zhì)瘤具有重要的指導(dǎo)意義。然而，許多患者發(fā)現(xiàn)有癥狀或確診時(shí)基本已處于中晚期或腫瘤已經(jīng)向周圍浸潤(rùn)性生長(zhǎng)而手術(shù)難以達(dá)到徹底切除。因此，早期檢測(cè)和較為準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤患者對(duì)改善患者預(yù)后至關(guān)重要。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于CHKα蛋白在膠質(zhì)瘤中的作用及對(duì)患者預(yù)后的影響研究甚少，加之臨床病例樣本有限，與患者預(yù)后的關(guān)系可能還不像其他的特異性分子那樣明確。本研究以2017年1月—2019年12月經(jīng)手術(shù)治療的膠質(zhì)瘤患者為研究對(duì)象，因此本次研究使用的是2016年WHO膠質(zhì)瘤分類指南作為診斷標(biāo)準(zhǔn)。2021年版WHO膠質(zhì)瘤分類指南與2016年版指南相比，診斷標(biāo)準(zhǔn)的主要區(qū)別是在兒童膠質(zhì)瘤中增加了MYB或MYBL1和MAPK基因突變，在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中則增加了H3K27、H3G34、H3及IDH突變。在成人膠質(zhì)瘤的病理學(xué)診斷上基本維持了2016年版的診斷標(biāo)準(zhǔn)。因在膠質(zhì)瘤內(nèi)部腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，病理學(xué)診斷往往以在該視野條件下占比較多的細(xì)胞作為診斷依據(jù)。因此，2021年的WHO膠質(zhì)瘤分類指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)不會(huì)對(duì)本研究結(jié)果造成明顯的影響。

綜上所述，CHKα蛋白在膠質(zhì)瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，其高表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤大小、病理學(xué)分期有關(guān)。CHKα蛋白表達(dá)的高低與膠質(zhì)瘤患者的生存率有著密切的關(guān)系。因此，檢測(cè)CHKα在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)可作為判斷膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后的指標(biāo)之一。