張海東，曲妮妮

(1． 遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110032；2. 遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種以咳嗽、咳痰、喘息、胸悶、氣短為主要臨床表現(xiàn)的，以持續(xù)性氣流受限為主要特征的慢性疾病。隨著人口老齡化的逐漸加劇，COPD的發(fā)病率及病死率也在逐年增高，并且COPD的并發(fā)癥較多，如呼吸衰竭、肺源性心臟病、自發(fā)性氣胸、胃食管反流、骨質(zhì)疏松、抑郁癥、焦慮癥等，該病病程長、花費大，對生活質(zhì)量有較大的影響。西醫(yī)治療COPD主要以抗感染、抗炎、解痙平喘、化痰、擴張支氣管等手段為主，其中激素治療效果顯著，但不可避免地帶來一系列不良反應(yīng)，且會影響體內(nèi)的多巴胺及5-羥色胺含量，影響人體情緒，誘發(fā)抑郁、焦慮等，且長時間應(yīng)用激素會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、胃應(yīng)激性潰瘍等疾病。 近些年很多研究表明，中西醫(yī)結(jié)合治療COPD可減少西藥帶來的不良反應(yīng)，并協(xié)同增強其藥物作用[1-2]。七味都氣丸為清代醫(yī)家張溫所著《張氏醫(yī)通》中所記載的經(jīng)典方劑，其中僅熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓、五味子7味中藥，為補腎斂肺、治療肺腎氣虛證的經(jīng)典方劑，此方為千古名方“六味地黃丸”加一味收斂之藥——五味子組成，臨床常用于喘病肺腎氣虛證的治療，療效顯著。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法分析七味都氣丸治療COPD的作用機制及通路，旨在為中醫(yī)藥治療該病的研究提供進一步參考。

1 資料與方法

1.1七味都氣丸有效成分篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫對七味都氣丸中各味中藥進行有效成分檢索，并根據(jù)口服藥物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選條件進行篩選，最后得到各藥物有效成分。

1.2七味都氣丸靶點預(yù)測篩選及復(fù)方活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 對篩選得到的有效活性成分，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫中的化合物關(guān)聯(lián)靶點(Related Targets)，通過Activeperl 5.28.1軟件運行g(shù)etTargrts.pl腳本將7味中藥的活性成分進行逐一配對潛在靶點(Targets Name)。運用addSymbol.pl腳本通過UniProt數(shù)據(jù)庫對靶點處理，得到標準名稱(Targets Symbol)，經(jīng)過以上數(shù)據(jù)庫得到的靶點即為中藥中活性成分相關(guān)靶點。最后，利用Gene Cards數(shù)據(jù)庫對COPD相關(guān)靶點篩選，得到疾病相關(guān)靶點。運用R 3.6.3軟件將藥物活性成分相關(guān)靶點與疾病相關(guān)靶點取交集，重合的靶點即為七味都氣丸活性成分作用于疾病的相關(guān)靶點，得到藥物-疾病的重合靶點，并制作韋恩圖。根據(jù)各成分性質(zhì)的不同予以標記，運用Cytoscape軟件進行中藥-化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及進行可視化分析。

1.3蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析 利用String在線數(shù)據(jù)庫對靶點的蛋白間相互作用(protein protein interaction,PPI)進行分析，將靶點信息導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，物種選擇人類(Homo sapiens)，將蛋白互作綜合得分>0.4作為篩選條件從而得到靶點的PPI信息，最后將得到的PPI信息導(dǎo)入Cytoscape軟件，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4靶點基因本體論(gene ontology,GO)和KEGG通路富集分析 運用R語言，利用bioconductor數(shù)據(jù)庫對得到的共同靶點進行GO和KEGG富集分析，保留P≤0.05的結(jié)果，得到GO及KEGG信號通路柱狀圖、氣泡圖，并獲取靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖，進一步說明靶點和信號通路在七味都氣丸治療COPD的作用。

1.5靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運用Cytoscape軟件，將靶點信息及KEGG富集所得到的的通路信息導(dǎo)入，進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到靶點與信號通路之間的網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié) 果

2.1方劑的中藥成分篩選 篩選最后得到81個有效成分，其中熟地2個，五味子8個，山藥16個，茯苓15個，丹皮11個，澤瀉10個，山萸肉20個。

2.2疾病相關(guān)的中藥活性成分靶點篩選 得到中藥中活性成分相關(guān)靶點共287個，排除重復(fù)之后共得到相關(guān)靶點102個。利用Gene Cards數(shù)據(jù)庫對COPD相關(guān)靶點篩選，得到疾病相關(guān)靶點5 971個。運用R語言得到藥物與疾病的靶點交集共89個，見表1；繪制韋恩圖，見圖1。

圖1 七味都氣丸與慢性阻塞性肺疾病重合的靶點韋恩圖

表1 七味都氣丸與慢性阻塞性肺疾病交集靶點

2.3中藥-化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)組成復(fù)方的中藥、化合物、核心靶點以及疾病信息，運用Cytoscape軟件構(gòu)建七味都氣丸的“中藥-化合物-靶點-疾病”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖(圖2)。圖中正六邊形代表七味都氣丸方中的7味中藥，淺藍色代表七味都氣丸治療COPD的化合物，淺綠色代表七味都氣丸治療COPD的核心靶點，深綠色代表COPD。圖中包含175個節(jié)點，449條邊，通過對網(wǎng)絡(luò)分析得知，按照degree度值排序，其中排在第一位的化合物為槲皮素(quercetin)，其次依次是豆甾醇(Stigmasterol)、山柰酚(kaempferol)、β-谷固醇(beta-sitosterol)、谷甾醇(sitosterol)、四氫鴨腳木堿(Tetrahydroalstonine)、海風藤酮(Kadsurenone)、薯蕷皂苷配基(diosgenin)、常春藤皂苷元(hederagenin)。前十位基因依次是NCOA2、PGR、NR3C2、PTGS1、CHRM1、GABRA1、CHRM3、CHRM2、AR、PRSS1。并且各個靶點連接多種不同的化合物，說明七味都氣丸中的化合物是通過這些靶點來調(diào)控疾病的，可以得出中藥復(fù)方通過多靶點-多化合物共同調(diào)控整個疾病的治療過程。

圖2 七味都氣丸的中藥-化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.4PPI構(gòu)建 運用String數(shù)據(jù)庫，將藥物與疾病相同基因?qū)耄锖Y選條件選擇人類(Homo sapiens)，經(jīng)過設(shè)置，隱藏游離的點位，剩余87個蛋白，其蛋白互作關(guān)系如圖3。再運用Cytoscape軟件對圖3進行處理，將蛋白根據(jù)degree值大小進行處理，degree值越大，其圖形越大顏色也就越深，這樣能更明顯地看出各蛋白之間的互作關(guān)系，如圖4。最后，運用R語言對各蛋白進行排序，取前20位，如圖5。與各項密切相關(guān)的是IL6，有54個互作關(guān)系，其次依

圖3 七味都氣丸與慢性阻塞性肺疾病蛋白互作網(wǎng)絡(luò)1

圖4 七味都氣丸與慢性阻塞性肺疾病核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建2

圖5 七味都氣丸與慢性阻塞性肺疾病核心網(wǎng)絡(luò)靶點3

次為CASP3、VEGFA、MAPK8、EGFR、MYC、ESR1、CCND1、FOS、AR、ERBB2、MTOR、PPARG、RELA、PGR、NOS3、HIF1A、NR3C1、CAV1、AHR。

2.5GO富集及KEGG通路分析

2.5.1GO富集分析 共得到112個生物過程，按生物過程中包含基因數(shù)及padjust值為標準，經(jīng)R語言以篩選取前20位制作點狀圖(見圖6)，其分為生物過程(BP)、細胞組成(CC)、分子功能(MF)3個方面，分別是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性(DNA-binding transcription activator activity, RNA polymerase Ⅱ-specific)；泛素樣蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin-like protein ligase binding)；泛素蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin protein ligase binding)；RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase Ⅱ transcription factor binding)；核受體活性(nuclear receptor activity)；轉(zhuǎn)錄因子活性，直接的配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合(transcription factor activity, direct ligand regulated sequence-specific DNA binding)；類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)；類固醇結(jié)合(steroid binding)；核激素受體結(jié)合(nuclear hormone receptor binding)；氧化還原酶活性，作用于成對的供體上，并結(jié)合或還原分子氧(oxidoreductase activity, acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen)；G蛋白耦聯(lián)的胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)；激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(activating transcription factor binding)；激素結(jié)合(hormone binding)；神經(jīng)遞質(zhì)受體活性(neurotransmitter receptor activity)；乙酰膽堿受體活性(acetylcholine receptor activity)；G蛋白耦聯(lián)的血清素受體活性(G protein-coupled serotonin receptor activity)；血清素受體活性(serotonin receptor activity)；谷胱甘肽結(jié)合(glutathione binding)；寡肽結(jié)合(oligopeptide binding)；氧化還原酶活性，以NAD(P)H，血紅素蛋白為受體起作用(oxidoreductase activity, acting on NAD(P)H, heme protein as acceptor)。

圖6 七味都氣丸中治療慢性阻塞性肺疾病的靶點GO富集點狀圖

2.5.2KEGG通路分析 共得到122個富集信息，包含疾病、炎癥信號通路、病毒感染通路、免疫信號通路、代謝過程等，以P<0.05，count值為標準，取前20位，制作柱狀圖見圖7。具體過程包括：PI3K-Akt 信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)；卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)；人巨細胞病毒感染(Human cytomegalovirus infection)；流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)；乙型肝炎(Hepatitis B)；癌癥相關(guān)蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)；前列腺癌(Prostate cancer)；肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma)；細胞凋亡(Apoptosis)；乳腺癌(Breast cancer)；大腸癌(Colorectal cancer)；糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)；TNF信號通路(TNF signaling pathway)；甲狀腺激素信號通路(Thyroid hormone signaling pathway)；胰腺癌(Pancreatic cancer)；內(nèi)分泌抵抗(Endocrine resistance)；HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)；鉑耐藥(Platinum drug resistance)；EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)；膀胱癌(Bladder cancer)；本研究共得出信號通路39條，除此之外，還有IL-17 signaling pathway；C-type lectin receptor signaling pathway；T cell receptor signaling pathway；MAPK signaling pathway等比較重要的信號通路。

圖7 七味都氣丸中治療慢性阻塞性肺疾病的靶點KEGG 柱狀圖

2.5.3靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖 將靶點信息及39條通路信息導(dǎo)入Cytoscape軟件進行網(wǎng)絡(luò)圖繪制，藍色正六邊形為信號通路，黃色圓形為靶點信息，以degree值為標準，值越大說明兩者關(guān)系越緊密，圖形形狀越大。見圖8。其核心靶點為RAF1、RELA、MAPK8、IKBKB、PRKCA、NFKBIA、GSK3B、EGFR、CCND1、FOS、BCL2、IL-6等。

圖8 七味都氣丸中治療慢性阻塞性肺疾病的靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

七味都氣丸中的有效成分以degree度值排序，從高到低依次為：槲皮素(quercetin)、豆甾醇(Stigmasterol)、山柰酚(kaempferol)、β-谷固醇(beta-sitosterol)、谷甾醇(sitosterol)、四氫鴨腳木堿(Tetrahydroalstonine)、海風藤酮(Kadsurenone)、薯蕷皂苷配基(diosgenin)、常春藤皂苷元(hederagenin)。槲皮素是廣泛存在于自然界的黃酮類化合物，目前被證實其具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤、抗氧化及清除自由基等作用[3]。有研究表明，槲皮素可通過降低IL-6水平，降低小氣道及肺組織結(jié)構(gòu)被破壞從而導(dǎo)致肺功能下降的風險。同時，其還可以改善胰島素抵抗，降低體內(nèi)三酰甘油及TNF-α、IL-8等炎癥因子的水平，從而降糖、降脂、降低炎癥因子分泌水平[4]。山柰酚與槲皮素同屬自然界的黃酮類化合物，其作用與槲皮素較為相似，可顯著降低肺泡灌洗液中炎癥細胞的數(shù)量[5]，且會顯著改善肺泡充血及肺組織白細胞浸潤等急性肺損傷的病理特征[6]。豆甾醇、谷甾醇、β-谷固醇均歸屬于類固醇范疇，這類化合物不僅可以調(diào)節(jié)膽固醇含量，并且具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[7]，還可以降低TNF-α和pNF-κB表達，從而抑制肺纖維化的發(fā)生[8]。

從PPI網(wǎng)絡(luò)中可以得出，IL-6在其網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用，其次是CASP3、VEGFA、MAPK8、EGFR、MYC。IL-6是一種炎癥因子指標，IL-6可通過影響氣道重塑功能，從而加重COPD的病情；且IL-6是COPD急性加重的重要危險因素，COPD穩(wěn)定期患者IL-6水平升高會增加急性發(fā)作的風險[9]。劉溫娟等[10]研究證實IL-6在COPD全身炎癥反應(yīng)中起到了介導(dǎo)的作用，并且其在COPD合并肺動脈高壓的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了重要作用。CASP3是檢測細胞凋亡的一項指標，其水平可評價藥物對細胞凋亡的影響。血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)是一種影響血管重塑及增長的因子，VEGFA在COPD急性加重期可見明顯升高，可被視為急性發(fā)作期的血清標志物之一[11]。VEGFA主要通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的增殖，并增加微血管通透性，從而誘導(dǎo)血管生長[12]。絲裂原活化蛋白激酶8(MAKP8)可調(diào)控細胞的分化、生長、增殖各個階段，并對免疫功能進行調(diào)控。表皮生長因子受體(EGFR)在細胞生理活動中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，EGFR與氣道黏液高分泌相關(guān)，抑制EGFR的表達可降低COPD的氣道黏液高分泌[13]。Myc是一種原癌基因，其參與了成纖維細胞的分化增殖，并導(dǎo)致瘢痕的增生，從而影響氣道重塑[14-15]。

根據(jù)GO富集分析結(jié)果得知，七味都氣丸主要通過調(diào)節(jié)DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑，核受體、轉(zhuǎn)錄因子、類固醇激素受體等活性及連接泛素樣蛋白連接酶、泛素蛋白連接酶、RNA聚合酶Ⅱ、核激素受體等受體表達而恢復(fù)呼吸系統(tǒng)的生理活動。

通過KEGG通路分析結(jié)果可以看出，七味都氣丸治療COPD主要是通過PI3K-Akt信號通路、細胞凋亡、TNF信號通路、甲狀腺激素信號通路、相關(guān)病毒感染、相關(guān)疾病等生理過程來發(fā)揮治療作用的。以PI3K-Akt信號通路為例，該通路可在氣道慢性炎癥中通過對炎癥介質(zhì)釋放、炎癥細胞的活化及氣道重塑等功能的調(diào)控，從而發(fā)揮重要的作用[16-17]。COPD的炎癥反應(yīng)過程中，PI3K參與了其炎癥細胞的活化與聚集，而過量的炎癥細胞導(dǎo)致氣道收縮及重塑，并通過產(chǎn)生的多種蛋白酶對肺實質(zhì)產(chǎn)生損害，導(dǎo)致肺水腫的發(fā)生[18]。一項實驗研究表明，抗氧化物質(zhì)可以通過抑制PI3K-Akt通路及其相應(yīng)的節(jié)點物質(zhì)，從而抑制氣道炎癥的發(fā)生[19]。COPD患者應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療時效果時常不理想，遠不如哮喘及風濕性關(guān)節(jié)炎等療效明顯，故存在一定的糖皮質(zhì)激素抵抗存在，而糖皮質(zhì)激素抵抗與HDAC2活性減弱有關(guān)，而HDAC2活性減弱又一定程度上受到PI3K-Akt信號上調(diào)的影響[20-22]。故目前PI3K抑制劑藥物研究已成為熱點，可通過抑制PI3K-Akt通路從而減輕氣道炎癥程度及糖皮質(zhì)激素抵抗水平，這也成為中藥復(fù)方治療COPD的靶向研究的一條重要路徑。

從靶點與信號通路網(wǎng)絡(luò)圖中得知，RAF1、RELA、MAPK8、IKBKB、PRKCA、NFKBIA、GSK3B、EGFR、CCND1、FOS、BCL2、IL6等作為七味都氣丸治療COPD的核心靶點，在相應(yīng)的信號通路上發(fā)揮著重要的作用。RAF1、RELA、IKBKB、GSK3B、EGFR、CCND1均位于PI3K-Akt 信號通路(hsa04151)上發(fā)揮作用。

綜上所述，七味都氣丸作為治療喘病肺腎氣虛證的經(jīng)典方劑，臨床上用于治療COPD效果顯著，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法并檢索復(fù)方與疾病的相關(guān)靶點，得出共有靶點89個，再通過中藥-化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、PPI蛋白互作、GO富集及KEGG通路分析可以預(yù)測出：七味都氣丸通過其中的有效活性成分槲皮素、豆甾醇、山柰酚、β-谷固醇、谷甾醇等，并通過RAF1、RELA、MAPK8、IKBKB、PRKCA、IL6等靶點，調(diào)控PI3K-Akt、TNF等相關(guān)信號通路及細胞凋亡等生理過程，從而減輕氣道炎癥、調(diào)節(jié)免疫功能、降低對肺實質(zhì)的損害，來達到治療COPD的目的。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。