葉 萍 張慧娥 李 光 陳長(zhǎng)寶 王恩鵬

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117)

黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)存在于天然污染的食物中，能抵抗熱降解[1]，是具有遺傳毒性、致突變性和免疫毒性的真菌毒素。不良的儲(chǔ)存條件、加工過(guò)程很有可能會(huì)引入AFT，并導(dǎo)致花生、面粉、香料和堅(jiān)果等食品污染。而攝入這些被污染的食品會(huì)導(dǎo)致各種疾病，如癌癥、出生缺陷、消化系統(tǒng)紊亂、生殖功能障礙和免疫抑制[2]。在發(fā)展中國(guó)家以及濕熱地區(qū)，肝癌的發(fā)病率與AFT的污染密切相關(guān)。AFT有很好的耐熱性，需加熱至280～300 ℃才能被分解，因此，在正常的食品加工過(guò)程中，這些毒素很難被去除掉。此外，修飾或掩蔽性的霉菌毒素(通常以與糖等極性物質(zhì)共軛的方式存在，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為極性更強(qiáng)的結(jié)合態(tài)代謝產(chǎn)物)的毒性可能與原霉菌毒素相同，甚至更高[3]。

目前，常用的AFT分析方法有高效液相色譜法(HPLC)[4]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[5]、熒光光譜法[6]、薄層色譜法(TLC)[7]等，雖然這些方法均被廣泛應(yīng)用，但普遍存在各種問(wèn)題。例如ELISA的檢測(cè)范圍較窄，熒光分光光度法的回收率、精密度以及檢測(cè)范圍較小[8]，且變異系數(shù)較大；而便宜且方便的TLC技術(shù)的主要目的是定性，并不能夠精確定量。為了更加準(zhǔn)確、快速和高通量地檢測(cè)食品中AFT含量是否超標(biāo)，質(zhì)譜技術(shù)作為一種獨(dú)特的定性、定量及分離待測(cè)物的有力工具而逐漸被大量采用，其特點(diǎn)是檢測(cè)限較低，線性關(guān)系好，與其他方法可相互兼容，能用于日常生活中的不同食品基質(zhì)及環(huán)境土壤中AFT的檢測(cè)。文章擬對(duì)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)AFT的方法進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)有關(guān)質(zhì)譜的AFT的分析研究方法提供依據(jù)。

1 黃曲霉毒素的主要類型

1.1 黃曲霉毒素B類

AFT(圖1)為二氫呋喃香豆素的衍生物，極性小，形成無(wú)色至淡黃色的晶體，這些晶體如果大量存在，則會(huì)在紫外光下呈強(qiáng)烈的熒光，發(fā)出藍(lán)光的為AFB類化合物，其中AFB1是AF家族的標(biāo)志性真菌毒素，毒性最強(qiáng)，其肝臟毒性和遺傳毒性已在動(dòng)物研究中被證實(shí)[9]，AFB1及其代謝物可通過(guò)食物鏈在肉雞肝臟中積聚，人類攝入后會(huì)引起慢性或急性肝損傷，甚至肝癌[10]。幾乎所有糧食谷物在適宜條件下均會(huì)成為此種化合物的寄生基質(zhì)。流行病學(xué)證據(jù)[11-12]表明，人類接觸AFB1與包括非洲部分地區(qū)在內(nèi)的許多中低收入國(guó)家的肝癌發(fā)病率之間存在密切聯(lián)系。而在中國(guó)，AFB1一直是被重點(diǎn)控制的對(duì)象。

1.黃曲霉毒素B1 2.黃曲霉毒素M1 3.黃曲霉毒素G1

1.2 黃曲霉毒素M類

AFM1是潛在致癌物AFB1的主要氧化衍生物，由肝臟細(xì)胞色素P450相關(guān)酶產(chǎn)生，主要存在于牛乳及乳制品中，其毒性和致癌性與AFB1基本相似[13-14]。AFM1可引起生鮮乳安全問(wèn)題[15]，因此通常被認(rèn)為是“乳毒素”[16]。巴氏消毒法無(wú)法破壞AFM1的結(jié)構(gòu)，而牛乳及乳制品作為嬰幼兒的主要食物，AFM1的存在對(duì)嬰幼兒的身體健康構(gòu)成了極大威脅。目前，已報(bào)道的AFM1的分析方法有ELISA法[17-18]、LC法[19]等，這些方法雖具有高度特異性和一定的選擇性等優(yōu)點(diǎn)，但耗時(shí)、操作繁瑣和價(jià)格昂貴。質(zhì)譜技術(shù)作為一種高通量、高選擇性、普適性的方法來(lái)用于準(zhǔn)確測(cè)定AFM1是非常適合的。

1.3 黃曲霉毒素G類

AFG類主要包括AFG1和AFG2，其中AFG1是僅次于AFB1的第二大毒性AFT[20]。動(dòng)物試驗(yàn)[21]表明，AFG1會(huì)誘導(dǎo)小鼠的肺增生性病變和肺腺癌，也會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)動(dòng)物肝臟腫瘤的發(fā)生。文獻(xiàn)[22]報(bào)道了AFG1誘導(dǎo)的肺炎是腫瘤壞死因子(TNF)所依賴的，其增強(qiáng)了炎癥肺組織AT-II細(xì)胞的DNA損傷以及細(xì)胞色素P450(CYP2A13)的表達(dá)，同時(shí)可誘導(dǎo)與肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)的慢性肺部炎癥[23]。在檢測(cè)AFG類化合物時(shí)，大多數(shù)情況下可采用HPLC-FLD和HPLC-MS法。如果用FLD檢測(cè)器檢測(cè)分離的組分，則需要柱后衍生化以增強(qiáng)AFG1的天然熒光性質(zhì)[24]。

2 黃曲霉毒素的質(zhì)譜檢測(cè)分析方法

2.1 液質(zhì)聯(lián)用法

近年來(lái)，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)因其可同時(shí)監(jiān)測(cè)多種真菌毒素而日益受到重視。其中液相部分從最初的常規(guī)LC，逐漸發(fā)展為超高壓液相色譜(UHPLC)[25]、二維液相色譜(2D-LC)、納升液相色譜(Nano-LC)[26]等，極大地提升了液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的檢測(cè)效率。質(zhì)譜部分可供選擇的離子源包括電噴霧離子源(ESI)、大氣壓化學(xué)電離源(APCI)、大氣壓光電離源(APPI)、基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)、實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜離子源(DART)[27]等。與離子源搭配的質(zhì)量分析器包括三重四極桿分析器(QQQ)、飛行時(shí)間分析器(TOF)[28]、軌道離子阱分析器(Orbitrap)[29]、傅里葉變換離子回旋共振(FT-ICR)[30]等。MALDI的廣泛應(yīng)用主要與其電離極性分子有關(guān)，該過(guò)程幾乎完全產(chǎn)生單電荷離子，近10年來(lái)，該技術(shù)作為一種快速、可靠的鑒定方法得到了廣泛應(yīng)用，與通過(guò)噴灑樣品溶液使分析物分子電離的ESI不同，MALDI分析的樣品需要在靶板上與過(guò)量的小分子基質(zhì)(通常是可吸收紫外線的有機(jī)酸)共結(jié)晶，然后通過(guò)激光輻射產(chǎn)生樣品離子，其與高質(zhì)量范圍的分析器TOF可以很好地結(jié)合在一起，只需一次電離就可以觀察到高分子量的生物分子。Ramos等[31]采用MALDI-TOF-MS對(duì)AFB1、B2、G1和G2進(jìn)行分析，獲得了無(wú)基質(zhì)質(zhì)譜，并加入NaCl，通過(guò)Na+增強(qiáng)靈敏度，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)AFB1、B2、G1和G2的有效檢測(cè)。該技術(shù)速度快、樣品制備少，不需要衍生化或色譜分離，因此適合于AFT的高通量篩選。LC與UPLC聯(lián)用時(shí)，其中的UPLC-Q-TOF-MS[32]作為機(jī)械分離科學(xué)中的一個(gè)全新類別，借助于HPLC的色譜理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、超低系統(tǒng)體積及快速檢測(cè)手段等全新技術(shù)，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。姚婷等[33]采用UPLC-Q-TOF-MS來(lái)分析發(fā)酵黑茶中AFB1的含量，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，其樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單、時(shí)間短，有機(jī)溶劑用量少，且目標(biāo)分析物無(wú)需衍生即可直接測(cè)定，能夠顯著提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2 熒光分析法結(jié)合質(zhì)譜法

隨著分析技術(shù)的發(fā)展，生物分析中出現(xiàn)了熒光分析[34]、比色分析[35]、化學(xué)發(fā)光分析[36]、電化學(xué)分析[37]等新方法。其中，熒光分析(FLD)因其背景強(qiáng)度低、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏度高而備受關(guān)注[38]。但由于AFT天然熒光較弱，許多方法在進(jìn)行前需對(duì)樣品柱前或柱后衍生化[39]?；谫|(zhì)譜技術(shù)的分析方法具有較高的特異性和靈敏度，并且隨著MS儀器的廣泛使用[40]，該技術(shù)的應(yīng)用變得越來(lái)越普遍，其能與LC-FLD[41-42]兼容，可用于單一或多種AFT的測(cè)定，而無(wú)需額外的樣品處理。Trucksess等[41]采用LC-FLD法結(jié)合三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，對(duì)玉米、花生和花生醬中的AFT總量和單個(gè)AFT進(jìn)行測(cè)定，其回收率比單獨(dú)使用FLD法高，此種方法適用于植物來(lái)源的食品中AFT的檢測(cè)。此外，Hao等[43]基于T7核酸內(nèi)切酶輔助的級(jí)聯(lián)循環(huán)擴(kuò)增策略和DNA模板銀納米簇(DNA-AgNC)的方法，建立了AFB1的無(wú)標(biāo)記FLD檢測(cè)新方法。即在靶標(biāo)AFB1存在的情況下，通過(guò)發(fā)夾H1特異性地捕捉靶標(biāo)，形成復(fù)合體H1-AFB1，這一步為復(fù)合物H1-AFB1-H2的形成創(chuàng)造了條件，此過(guò)程會(huì)逐步循環(huán)放大，并產(chǎn)生大量的序列，這些序列即AgNC的合成模板。其顯示的熒光強(qiáng)度與AFB1濃度呈良好的線性關(guān)系。該方法與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用，已被成功應(yīng)用于食品樣品中AFB1的測(cè)定，檢出限可達(dá)0.89 pg/mL。其中所用到的以DNA為模板的銀納米(DNA-AgNC)作為一種新型的熒光載體受到了特別的關(guān)注，其性能優(yōu)于有機(jī)染料和量子點(diǎn)[44]。更重要的是，作為AgNC合成模板的DNA序列可以靈活地編程到探針[45-46]中，避免了用熒光團(tuán)的繁瑣和麻煩，既節(jié)省了試驗(yàn)成本，又節(jié)省了人力和時(shí)間，是整個(gè)質(zhì)譜檢測(cè)體系中的新步驟。

2.3 同位素稀釋質(zhì)譜法

自Hevesy等[47]提出同位素稀釋法以來(lái)，已經(jīng)按照這種“稀釋”原理創(chuàng)建了多種分析方法，在此基礎(chǔ)上，同位素稀釋質(zhì)譜法(IDMS)已被廣泛地應(yīng)用于多種有機(jī)物和無(wú)機(jī)物的測(cè)定，受到了極大的關(guān)注和發(fā)展。LC-MS未使用同位素內(nèi)標(biāo)，樣品前處理步驟繁瑣，目標(biāo)物損失嚴(yán)重，檢出限高，回收率偏低。IDMS優(yōu)化了影響試驗(yàn)結(jié)果的一系列參數(shù)，能夠得到最佳的試驗(yàn)條件，可用于谷物及其制品、豆類及其制品、堅(jiān)果及籽類、油脂及其制品、調(diào)味品、嬰幼兒食品中AFB族和G族的測(cè)定[48]。羅蘭等[49]使用同位素內(nèi)標(biāo)，并采用UPLC-MS的方法來(lái)檢測(cè)嬰兒輔食中AFM1含量，得到的檢出限為0.01 μg/kg，RSD值均<4%。魏敏等[50]用液相色譜—同位素稀釋質(zhì)譜法來(lái)測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中AFM1基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的定值，其檢出限為0.01 μg/kg，定量限為0.05 μg/kg。Henrion[51]提出了精確匹配雙同位素稀釋質(zhì)譜(EMD-IDMS)的概念。EMD-IDMS是一種通過(guò)有效地消除儀器分析步驟中的偏差，并通過(guò)直接連續(xù)多次測(cè)量?jī)煞N混合物來(lái)減少不確定度的方法。通過(guò)尖峰加強(qiáng)要分析的物質(zhì)，以便產(chǎn)生樣品混合物和校準(zhǔn)混合物，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的數(shù)量使得樣品和校準(zhǔn)混合物中的同位素比率在雙重IDMS中“精確”匹配，在這種情況下，所有與儀器有關(guān)的偏差均變得可以忽略不計(jì)[52]。與LC-MS結(jié)合使用時(shí)，由于大氣壓電離源抑制了分析物的電離，快速分析時(shí)間和高進(jìn)樣量可能會(huì)對(duì)LC-MS的信號(hào)強(qiáng)度產(chǎn)生不利影響[53-54]，但同位素比率在一定程度上不受影響[55]，這既補(bǔ)償了基質(zhì)效應(yīng)的影響，也可有效抵消基質(zhì)效應(yīng)和前處理的操作損失，而提高色譜分辨率也是減少基質(zhì)效應(yīng)的一種較好的方法，因?yàn)樵陔x子抑制的情況下，信號(hào)強(qiáng)度有所提高[56]。穩(wěn)定同位素稀釋法(SIDA)同樣是在IDMS的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，Zhang等[57]采用SIDA與LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定食品中的多種真菌毒素，樣品用乙腈/水提取，濃度為1.0～1 000.0 ng/g，回收率的RSD值<10%，整個(gè)過(guò)程不僅簡(jiǎn)化了樣品的制備，也實(shí)現(xiàn)了樣品的同時(shí)鑒定和定量分析。

2.4 電感耦合等離子體質(zhì)譜

2001年，Zhang等[58]提出了基于電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)檢測(cè)的免疫分析方法。隨后，ICP-MS在生物分子分析中的重要性呈指數(shù)增長(zhǎng)[59]。與其他成熟的方法相比，ICP-MS具有譜線簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、易于與多種分離技術(shù)耦合的特點(diǎn)。最初，分析僅限于那些含有ICP-MS能檢測(cè)到的雜原子的物種，容易受到光譜干擾，分析優(yōu)值系數(shù)也會(huì)受到影響[60-61]。為了提高分析優(yōu)值，以及解決不含雜原子生物分子的測(cè)定問(wèn)題，生物分子可以通過(guò)與雜原子或有機(jī)金屬化合物的化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行衍生化[62-63]，但這種方法的選擇性較低。目標(biāo)分析物也可以通過(guò)使用雜原子標(biāo)記的抗體免疫反應(yīng)來(lái)標(biāo)記[64-65]。由于抗原—抗體反應(yīng)的高度特異性，可以在復(fù)雜的混合物中如奶制品中測(cè)定AFT。此過(guò)程使用的雜原子標(biāo)記物包括過(guò)渡金屬和金屬納米顆粒等，而Pérez等[66]認(rèn)為，使用金屬納米顆粒是提高分析優(yōu)值(如靈敏度等)的最有利方法，并通過(guò)使用二級(jí)生物素化的抗體與鏈霉親和素結(jié)合的金屬納米顆粒的競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)，建立了ICP-MS對(duì)超痕量牛奶樣品中的AFM1進(jìn)行檢測(cè)，在最佳條件下，該免疫分析方法的檢出限可低至0.005 μg/kg。以ICP-MS為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的氫化物—電感耦合等離子體質(zhì)譜法(HG-ICP-MS)[67]、氣相色譜—電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用(GC-ICP-MS)[68]、在線電感耦合等離子體質(zhì)譜(Electrochemical On-line-ICP-MS)[69]、四極桿ICP-MS[70]、激光消融-ICP-MS(LA-ICP-MS)[71]、毛細(xì)管電泳—電感耦合等離子體質(zhì)譜(CE-ICP-MS)[72]結(jié)合的方法得到了廣泛關(guān)注，可為檢測(cè)AFT技術(shù)的發(fā)展提供參考，尤其是在檢測(cè)AFM1時(shí)，由于其具有較高的健康風(fēng)險(xiǎn)和限制性的法律要求，可用半抗原模型來(lái)評(píng)估以上不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

3 應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)AFT在食品中的應(yīng)用

3.1 谷物

質(zhì)譜技術(shù)是檢測(cè)谷物、糧食中AFT是否超標(biāo)的重要步驟。郭芳芳等[73]采用LC-MS對(duì)小麥粉中的AFB1進(jìn)行測(cè)定，樣品用甲醇—水提取并用免疫親和柱凈化富集，串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)后得到的檢測(cè)限為0.03 μg/kg，可為檢測(cè)其他食品中的真菌毒素提供參考。谷葉等[74]采用TSQ-MS檢測(cè)花生、玉米、燕麥片中的AFT，其對(duì)AFB1、B2、G1、G2的檢出限分別為0.110，0.009，0.012，0.008 μg/kg，且回收率與精密度較好，可為其在谷物和糧食檢測(cè)方面提供依據(jù)。

3.2 奶制品

奶制品中污染最大的真菌毒素主要是AFM1，通過(guò)奶牛的尿液和奶汁排出。近年來(lái)，液質(zhì)聯(lián)用法用于檢測(cè)奶制品中AFT含量具有很大的應(yīng)用價(jià)值，張俊等[75]采用LC-MS/MS檢測(cè)生鮮乳中AFM1含量，通過(guò)優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)以達(dá)到最大的離子強(qiáng)度，其回收率為80%～110%，RSD在8.4%以內(nèi)，重復(fù)性良好，此種方法在檢測(cè)奶制品方面值得推廣應(yīng)用。此外，Campone等[76]采用在線固相萃取-UHPLC-MS對(duì)69種牛奶樣品進(jìn)行分析，以評(píng)估AFM1的發(fā)生率。結(jié)果表明，巴氏殺菌牛奶中AFM1的檢出率為72.7%，其中在線SPE清除具有高度的選擇性，能為檢測(cè)奶制品中AFT提供新方法。

3.3 調(diào)味品

醬油、食用醋等調(diào)味品生產(chǎn)中主要使用的是曲霉菌，一定程度上給AFT的產(chǎn)生提供了條件[77]，污染嚴(yán)重不僅會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生嚴(yán)重的危害，也會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了檢測(cè)傳統(tǒng)調(diào)味品中AFT含量是否超標(biāo)，楊春林等[78]將豆瓣等樣品先通過(guò)免疫親和柱凈化后再用UPLC-TSQ-MS進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)調(diào)整信噪比，最終得到的檢出限為0.017～0.051 μg/L，提示此方法較為靈敏，能同時(shí)測(cè)定調(diào)味品中的多種AFT。除UPLC-TSQ-MS外，新型質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)如QuEChERS萃取-UPLC-MS/MS也被廣泛應(yīng)用，梁劍鋒等[79]為了測(cè)定花生醬中AFB1含量，先采用QuEChERS凈化樣品，再用UPLC-MS/MS掃描檢測(cè)，該方法檢出限較低，回收率較高，精密度好，作為檢測(cè)調(diào)味品中AFT的技術(shù)具有較大的推廣價(jià)值。

表1為AFT質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)在食品中的應(yīng)用。

表1 AFT質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)的分類及應(yīng)用

4 結(jié)語(yǔ)與展望

近年來(lái)，各種質(zhì)譜新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，已成為推動(dòng)現(xiàn)代分析技術(shù)進(jìn)步的重要支撐，其高通量、高選擇性、高靈敏度、高精密度的特性，可對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)分析等特點(diǎn)，使其在黃曲霉毒素檢測(cè)方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。將新型質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于飼料、煙草、糧食谷物及奶制品中，并擴(kuò)大到其他領(lǐng)域，可以在最大程度上節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，提高準(zhǔn)確度。雖然傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)因特異性差、選擇性低、靈敏度差、檢測(cè)限高等缺點(diǎn)應(yīng)用逐漸減少，但仍不失為較簡(jiǎn)易的方法。質(zhì)譜技術(shù)在黃曲霉毒素的檢測(cè)領(lǐng)域雖然具有較多自身優(yōu)勢(shì)，但同樣存在一些如設(shè)備成本較高，對(duì)儀器操作人員要求高等缺點(diǎn)。因此如何能夠針對(duì)不同種類的食品基質(zhì)，通過(guò)優(yōu)化前處理?xiàng)l件，利用不同種類的質(zhì)譜技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行專門檢測(cè)將成為未來(lái)一段時(shí)間內(nèi)較為熱門的話題。此外，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)原位、快速、實(shí)時(shí)、操作簡(jiǎn)單、高通量的質(zhì)譜方法，并將其做到便攜化、小型化，將極大地推動(dòng)質(zhì)譜技術(shù)在現(xiàn)場(chǎng)食品黃曲霉毒素檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用。