楊建安 張 超 文焱炳 方 芳

(1.貴州省化工研究院，貴州 貴陽 550002；2.長沙理工大學化學與食品工程學院，湖南 長沙 410114)

多糖是一類由不少于10個單糖分子通過糖苷鍵結(jié)合而成的多羥基醛或者酮的高分子聚合物[1]。研究表明，天然植物多糖具有抗腫瘤[2]、降血糖[3]、降血脂[4]、抗氧化[5]、抗癌[6]、抗輻射、抗衰老、保肝、抗菌[7]等多方面的生物活性作用。油茶籽粕是油茶籽經(jīng)機械榨油后的副產(chǎn)物，其中含有多糖、殘油、茶皂素、蛋白質(zhì)等物質(zhì)[8]。

油茶籽粕中含有20%～40%的油茶籽粕多糖(CamelliaOleiferaseed meal Polysaccharides，COP)[9]，但目前其利用率較低。研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，大部分天然植物多糖都具有活性或只具有較弱的活性，其大多受多糖分子中化學結(jié)構(gòu)的影響，所以通過改變天然植物多糖的大分子結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量、取代基團種類、作用點位置和數(shù)量等就可以改變其理化性質(zhì)和生物活性，從而擴大植物多糖的應用范圍和利用率。多糖的羧甲基化及乙?；揎棶a(chǎn)物可能對透明質(zhì)酸酶的抑制活性產(chǎn)生積極影響[12-13]，但目前有關(guān)COP羧甲基化、乙?；揎椉捌湫揎棶a(chǎn)物對透明質(zhì)酸酶的抑制活性影響尚未見報道。文章擬通過單因素試驗，研究各因素對COP羧甲基化及乙?；揎椀挠绊懸?guī)律，并探索不同取代度修飾產(chǎn)物對透明質(zhì)酸酶抑制活性的影響，以期為COP更好的開發(fā)應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶籽粕餅：市售；

氯乙酸、乙酸酐、羥基乙酸、鹽酸羥胺、三氯化鐵、2，7-二羥基萘、鄰苯三酚、水楊酸鈉、α-五乙?；咸烟?、透明質(zhì)酸酶等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫磁力攪拌器：85-2型，常州億通分析儀器制造有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-201D型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

減壓抽濾裝置(循環(huán)水式真空泵)：SHZ-D(Ⅲ)型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

真空干燥箱：DZF-6010型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

紫外分光光度計：723型，天津冠澤科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 油茶籽粕多糖的制備 油茶籽粕經(jīng)干燥、粉碎、石油醚脫脂，在料液比1∶8(g/mL)、時間2 h、溫度70 ℃下，采用95%乙醇對茶皂素進行脫除，離心收集沉淀。將脫除茶皂素的粉末按固液比1∶10(g/mL)加入蒸餾水，75 ℃下攪拌浸提3 h，離心后取上層清液，多次浸提合并上清液，即獲得COP水提液，將上清液旋蒸濃縮至原體積的1/4，用Sevage法除去蛋白，加入其4倍體積濃度為95%的乙醇，4 ℃醇沉24 h，離心，取上清液，沉淀冷凍干燥得COP。

1.3.2 羧甲基化修飾COP工藝研究 采用氫氧化鈉—氯乙酸法[14]。取240 mg COP，在NaOH濃度1.5 mol/L，反應時間3 h，反應溫度60 ℃下進行羧甲基化修飾。采用控制變量法，選擇NaOH濃度分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mol/L，反應時間分別為1，2，3，4，5 h，反應溫度分別為40，50，60，70，80 ℃，以羧甲基取代度為指標，考察各單因素對羧甲基取代度的影響，確定羧甲基化修飾COP的最佳工藝。

1.3.3 乙?；揎桟OP工藝研究 采用乙酸酐法[15]。取100 mg COP，在乙酸酐用量3.0 mL，反應時間3 h，反應溫度60 ℃下進行乙?；揎?。采用控制變量法，選擇乙酸酐用量分別為2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL，反應時間分別為1，2，3，4，5 h，反應溫度分別為30，40，50，60，70 ℃，以乙?；〈葹橹笜?，考察各單因素對乙酰基取代度的影響，確定乙酰化修飾COP的最佳工藝。

1.3.4 取代度的測定

(1)羧甲基取代度：采用分光光度法[12]。按式(1)計算羧甲基取代度。

(1)

式中：

DS1——羧甲基取代度；

A——多糖中羥基乙酸百分含量，%。

(2)乙?；〈龋翰捎昧u胺比色法[16]。按式(2)計算乙?；〈?。

(2)

式中：

DS2——乙酰基取代度；

M——多糖中乙酰基百分含量，%。

1.3.5 COP、CM-COP和Ac-COP的紅外光譜表征 取COP、CM-COP和Ac-COP干燥后樣品各6 mg，分別與100 mg已烘干的KBr混合，研磨，壓片，使用紅外光譜儀于4 000～400 cm-1進行掃描[17]。

1.3.6 溶解度分析 稱取一定量的COP、CM-COP及Ac-COP，加入20 mL蒸餾水，震蕩至充分均勻，觀察其在冷水、加熱或超聲輔助條件下的溶解情況，并采用紫外可見分光光度計掃描其水溶液的透光率(400～600 nm)。

1.3.7 COP、CM-COP和Ac-COP對透明質(zhì)酸酶的抑制作用 取50 μL一定濃度的COP、CM-COP和Ac-COP，分別加入4.85 mL乙酸—乙酸鈉溶液(pH 6.0，0.2 mo1/L)及50 μL 透明質(zhì)酸酶(1 mg/mL)，充分搖勻，37 ℃下加入50 μL透明質(zhì)酸鈉(3.44 mg/mL)，反應15 min，加入2 mL 2.5%的CTAB(溶于2%氫氧化鈉溶液)，15 min后，測定400 nm處吸光度A1，樣品對照(緩沖液代替酶液)吸光度為AC1，空白對照(緩沖液代替酶液和樣品溶液)吸光度為AC2，用緩沖液代替樣品測吸光度A0[18]。按式(3)計算抑制率。

(3)

式中：

R——抑制率，%；

A1——樣品吸光度；

AC1——樣品對照(緩沖液代替酶液)吸光度；

AC2——空白對照(緩沖液代替酶液和樣品溶液)吸光度；

A0——緩沖液代替樣品吸光度。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2016、Origin 2018、SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析處理，P<0.05有顯著性差異。所有試驗均重復3次，結(jié)果以平均值±標準偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 羧甲基化修飾單因素試驗

2.1.1 NaOH濃度 由圖1可知，當NaOH濃度<1.5 mol/L時，CM-COP取代度隨NaOH濃度的升高而升高，但當NaOH濃度>1.5 mol/L時，CM-COP取代度開始下降。因此，NaOH濃度太高或太低，都會影響COP的羧甲基化效果。這可能是因為隨著NaOH濃度的不斷升高，由于空間位阻，使得COP溶脹得更為充分，與氯乙酸接觸的機會也增多，醚化反應效率提高，從而使反應取代度增加。但溶液中NaOH過量，氯乙酸可能發(fā)生副反應，使其利用率降低，反而使取代度降低。因此，當NaOH濃度為1.5 mol/L時，取代度達最大0.665。

圖1 NaOH濃度對CM-COP的影響

2.1.2 反應溫度 由圖2可知，當反應溫度<60 ℃時，隨著反應溫度的不斷升高，CM-COP的取代度逐漸升高，但當反應溫度>60 ℃時，取代度呈下降趨勢，說明適當提高反應溫度有利于羧甲基的修飾，但溫度過高不利于羧甲基的取代。這可能是因為溫度不斷升高，加快了分子運動速度，增加了分子間相互碰撞機會，致使多糖取代度增加。因此，選擇反應溫度60 ℃為宜。

圖2 反應溫度對CM-COP的影響

2.1.3 反應時間 由圖3可知，當NaOH濃度和反應溫度一定時，隨著反應時間的延長，CM-COP取代度逐漸提高。當反應時間>3 h時，CM-COP的取代度反而有所降低，可能是因為當反應時間為1～3 h時，隨著反應時間的延長，反應活性中心增多，醚化反應速率加快，因此CM-COP的取代度顯著增加。當反應時間超過3 h后，可能其體系內(nèi)副產(chǎn)物增多或不穩(wěn)定，導致中間產(chǎn)物分解，造成取代度降低。因此，最佳反應時間為3 h，此時取代度為0.665。

圖3 反應時間對CM-COP的影響

2.1.4 不同取代度CM-COP的制備 根據(jù)COP羧甲基化修飾單因素試驗結(jié)果，調(diào)整反應條件，制備CM-COP-A、CM-COP-B、CM-COP-C、CM-COP-D 4種不同取代度的CM-COP，其羧甲基取代度及制備工藝見表1。

表1 CM-COP的制備條件及取代度

圖4 COP及CM-COP的紅外光譜圖

2.1.6 羧甲基化多糖的溶解性 試驗發(fā)現(xiàn)，在同濃度條件下，用氯乙酸法制得的CM-COP與COP相比，在加熱或超聲波等外界輔助條件下，溶解度均有不同程度的提高，其修飾產(chǎn)物在冷水中稍稍振蕩即可溶解。由圖5可知，同一濃度條件下，CM-COP水溶液的透光率明顯高于COP溶液，說明羧甲基化修飾能提高其水溶性。

圖5 COP及CM-COP水溶液的透光率

2.2 乙?；揎梿我蛩卦囼?/h3>

2.2.1 乙酸酐用量 由圖6可知，取代度隨乙酸酐用量的增加而上升，可能是因為隨著乙酸酐用量的增多，增加了COP乙?；姆磻獛茁?，乙?；〈纫搽S之增加。但當乙酸酐用量>3 mL時，COP乙酰基的取代度逐漸下降，可能是因為反應體系的pH值隨乙酸酐的增加逐漸下降，增大了乙酸酐水解的副反應程度。因此適宜的乙酸酐用量為3 mL，此時取代度為0.400。

圖6 乙酸酐用量對Ac-COP的影響

2.2.2 反應溫度 由圖7可知，一定程度的反應溫度有利于COP的乙?；揎?。當反應溫度為30～60 ℃時，隨反應溫度升高，COP的乙?；〈葞缀醭手本€增加，可能是在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，反應物活性越強，COP乙?；〈入S之增大。但當反應溫度>60 ℃時，乙?；〈瓤焖傧陆?，說明溫度太高并不利于COP的乙酰化反應，可能是當反應溫度>60 ℃時，乙酸酐的水解速度過快，導致COP乙?；娜〈葴p小。

圖7 反應溫度對Ac-COP的影響

2.2.3 反應時間 由圖8可知，當反應時間為1～3 h時，Ac-COP乙?；娜〈入S反應時間的延長而提高，3 h后，Ac-COP乙?；娜〈入S反應時間的延長而下降，可能是因為Ac-COP在體系中并不穩(wěn)定，隨著反應時間的延長，部分產(chǎn)物發(fā)生分解，引起乙?；潭冉档?。因此，COP的乙?；揎椀妮^佳反應時間應為3 h。

圖8 反應時間對Ac-COP的影響

2.2.4 不同取代度Ac-COP的制備 根據(jù)對COP乙酰化修飾的3個影響因素的研究結(jié)果，調(diào)整反應條件，制備由低到高4種不同取代度的Ac-COP(Ac-COP-A、Ac-COP-B、Ac-COP-C、Ac-COP-D)，其乙?；〈燃爸苽涔に囈姳?。

表2 Ac-COP的制備條件及取代度

圖9 COP及Ac-COP的紅外光譜圖

2.2.6 乙酰化多糖的溶解性 由圖10可知，同一濃度條件下，Ac-COP水溶液的透光率明顯高于COP溶液，說明乙?；揎椏擅黠@提高COP在水溶液中的溶解性。

圖10 COP及Ac-COP水溶液的透光率

2.3 COP、CM-COP和Ac-COP對透明質(zhì)酸酶的抑制作用

2.3.1 羧甲基化修飾 由圖11可知，COP和不同取代度的CM-COP均對透明質(zhì)酸酶活性具有良好的抑制作用，且抑制能力有明顯濃度依賴性，即隨著樣品濃度的增加其抑制率不斷提高。當多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，COP、CM-COP-A、CM-COP-B、CM-COP-C、CM-COP-D對透明質(zhì)酸酶的抑制率分別為51.1%，53.3%，56.3%，61.3%，63.7%，與COP相比，不同取代度的CM-COP對透明質(zhì)酸酶活性的抑制能力均有一定程度的提高，且隨取代度的增加抑制率越大，說明COP的羧甲基化有利于增加COP的透明質(zhì)酸酶抑制活性。這可能是羧甲基化后多糖內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響抑制透明質(zhì)酸酶的活性，其具體機理有待深入研究。綜上，不同取代度的CM-COP均有利于增強COP對透明質(zhì)酸酶活性的抑制作用。

圖11 COP及CM-COP對透明質(zhì)酸酶的抑制作用

2.3.2 乙酰化修飾 由圖12可知，COP及其不同取代度的Ac-COP均對透明質(zhì)酸酶的活性抑制有明顯作用。當多糖質(zhì)量濃度為0.2～1.0 mg/mL時，COP、Ac-COP-A、Ac-COP-B、Ac-COP-C、Ac-COP-D對透明質(zhì)酸酶活性的抑制率分別為50.9%，54.5%，58.3%，61.8%，65.3%。與COP相比，Ac-COP對透明質(zhì)酸酶活性具有更好的抑制作用，且抑制能力有明顯濃度依賴性。這可能是因為經(jīng)乙酰化修飾后的Ac-COP中乙?；吭黾?，從而導致COP的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，活性提高。綜上，COP的乙酰化修飾有利于增加COP對透明質(zhì)酸酶活性的抑制作用。

圖12 COP及Ac-COP對透明質(zhì)酸酶的抑制作用

3 結(jié)論

通過氫氧化鈉—氯乙酸法和乙酸酐法分別探究了羧甲基化油茶籽粕多糖和乙?；筒枳哑啥嗵堑男揎椆に?。結(jié)果表明，羧甲基化油茶籽粕多糖的最佳修飾工藝條件為：NaOH濃度2 mol/L、反應溫度60 ℃、反應時間3 h；乙?；筒枳哑啥嗵堑淖罴研揎椆に嚄l件為：乙酸酐用量3 mL，反應溫度60 ℃、反應時間3 h。油茶籽粕多糖及其兩種修飾多糖均具有多糖的顯著特征峰，3 413，2 930，1 611，1 420，1 323 cm-1等特殊峰值處均具有明顯峰，表示羧甲基化修飾成功；3 413，2 930，1 724，1 247 cm-1等特殊峰值處均具有明顯峰，表示乙?；揎棾晒?。油茶糖、羧甲基化油茶籽粕多糖和乙?；筒枳哑啥嗵蔷鶎ν该髻|(zhì)酸酶活性具有良好的抑制作用，且抑制能力有明顯濃度依賴性。后續(xù)將進一步探索羧甲基化及乙酰化油茶籽粕多糖在體內(nèi)對于透明質(zhì)酸酶的活性作用情況及作用機理。