柯 梅，侯鈺榮，張一弓

(1.新疆畜牧科學(xué)院草業(yè)研究所，烏魯木齊 830000；2.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)

0 引 言

【研究意義】世界鹽漬土面積約為9.54×108hm2，占全球陸地面積的7%[1-2]。我國鹽漬土面積約3 600×104hm2，占我國可利用土地面積的4.88%，主要集中于西部六省區(qū)(陜、甘、寧、青、蒙、新)，占全國鹽漬土面積的69%[3-4]。土壤鹽漬化不僅直接危害植物生長，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)減產(chǎn)、荒漠化加劇，還會提高土壤重金屬遷移能力，增加土壤重金屬污染程度，嚴(yán)重降低土地利用率?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】土壤鹽堿化主要是指以NaCl、Na2SO4為主的中性鹽和以Na2CO3、NaHCO3為主的堿性鹽對植物造成的脅迫[5]，二者對作物的危害機(jī)制既有相似也有不同，認(rèn)識植物對鹽堿脅迫的反應(yīng)，是判斷植物耐鹽堿性的重要基礎(chǔ)[6]。鹽堿脅迫會損傷植物的膜系統(tǒng)，使植物發(fā)生生理干旱、離子毒害、滲透脅迫，危害植物的生長、發(fā)育、產(chǎn)量及品質(zhì)，嚴(yán)重時甚至?xí)怪参锼劳鯷7]。堿脅迫相比于鹽脅迫，除了具有滲透脅迫和離子毒害之外還具有高pH脅迫[8]，高pH傷害植物根系的生長，影響植物礦質(zhì)元素吸收，干擾離子穩(wěn)態(tài)，破壞植物體內(nèi)的穩(wěn)定性，干擾或改變植物的各種代謝活動[9]。植物作為固著生物經(jīng)常會受到包括鹽堿脅迫在內(nèi)的各種逆境脅迫[10]，植物為了更好適應(yīng)逆境環(huán)境，會發(fā)生許多內(nèi)在的生理生化反應(yīng)，其中就包括根系分泌物種類和含量的變化[11-12]。植物根系分泌物中存在大量的H+和低分子量有機(jī)酸[13-14]，會降低土壤pH值，調(diào)節(jié)根系周圍土壤環(huán)境的酸堿平衡。研究表明，在高鹽脅迫下植物體會通過積累和分泌有機(jī)酸進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)[15]，不同的植物在受到鹽脅迫時積累的有機(jī)酸種類各異[16]。目前已知的植物根系分泌物的有機(jī)酸，包括酒石酸、草酸、檸檬酸、蘋果酸、甲酸、琥珀酸[17]等?！颈狙芯壳腥朦c】目前，針對逆境脅迫下植物體有機(jī)酸分泌機(jī)制已開展了部分研究，分析耐鹽堿植物根系有機(jī)酸分泌積累特性，是揭示耐鹽堿植物抗逆機(jī)制的一種有效途徑[18]。塔烏庫姆冰草(AgropyroncristatumTawukumu)為禾本科冰草屬多年生草本植物，是刈割-放牧兼用型草原良種，具有抗旱、耐寒，栽培生態(tài)幅度寬、生育期短、高產(chǎn)、營養(yǎng)豐富、適口性好、飼用價值高等優(yōu)良特性[19-20]。張一弓等[20]對塔烏庫姆冰草在不同堿脅迫條件下的發(fā)芽情況和生理指標(biāo)研究發(fā)現(xiàn)，其對堿脅迫(Na2CO3和NaHCO3)具有一定的耐受性，在脅迫濃度≤30 mmol/L即pH≤9.1時，萌發(fā)和生長不受影響；當(dāng)脅迫濃度≥90 mmol/L即pH≥10.1時，萌發(fā)和生長會受到明顯抑制；堿脅迫濃度≤60 mmol/L即pH≤9.8時，是塔烏庫姆冰草能夠萌發(fā)和生長的最大耐堿性范圍?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究設(shè)2種堿性鹽(Na2CO3和NaHCO3)處理，研究塔烏庫姆冰草耐堿性機(jī)理，分析根系分泌的有機(jī)酸與pH值在調(diào)控植物抗堿性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料塔烏庫姆冰草由新疆畜牧科學(xué)院草業(yè)研究所提供，試驗于新疆畜牧科學(xué)院草業(yè)研究所生物技術(shù)實驗室進(jìn)行。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設(shè)計

將2種堿性鹽Na2CO3、NaHCO3均按摩爾比9∶1混合，人工模擬天然堿性生境條件以處理冰草幼苗。每個處理類型內(nèi)設(shè)10、30、60、90、120 mmol/L 5個濃度，以0 mmol/L作為對照(CK)，堿脅迫組pH值在7.6～10.8。冰草幼苗在含有處理液的營養(yǎng)液中生長14 d后取樣測定指標(biāo)。

1.2.2 測定指標(biāo)1.2.2.1 電導(dǎo)率

采用電導(dǎo)率儀法測定溶液電導(dǎo)率。

1.2.2.2 水勢

采用小液流法。

計算植物水勢：ΨW=Ψπ-CRTi(MPa)式中：ΨW為植物的水勢(MPa)；Ψπ為溶液的滲透勢(MPa)；R為氣體常數(shù)，0.008 314 L.Pa/(mol·K)；T為絕對溫度(273+t℃)K；i為解離系數(shù)。

1.2.2.3 相對生長率

相對生長率=(ln處理前整株干重-ln處理前后整株干重)/處理天數(shù)。

1.2.2.4 相對含水量

相對含水量=(鮮重-干重)/鮮重×100%。

1.2.2.5 根系生長溶液的pH值

用PHS-3C筆式酸度計以電位測定法來測量溶液pH值。

1.2.2.6 根系組織pH值

先用自來水沖洗干凈，再用吸水紙吸干后，壓榨其汁液，用精密試紙測定。

1.2.2.7 根系組織有機(jī)酸含量和種類

參照李德華等[22]的方法，隨機(jī)選取3株處理過的冰草幼苗并用蒸餾水沖洗干凈，將根系置于盛有適量蒸餾水(浸沒根系即可)的三角瓶中24 h收集分泌物，每處理重復(fù)3次，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)測定收集液中有機(jī)酸的種類和含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及圖表繪制，采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，以新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿脅迫對塔烏庫姆冰草相對生長率的影響

研究表明，塔烏庫姆冰草經(jīng)不同濃度的堿液處理14 d后，隨處理液濃度的增加，離子濃度逐漸增大，電導(dǎo)率不斷升高，水勢不斷下降，相對含水量逐漸降低，胚根和胚芽生長均呈下降趨勢，植株受脅迫不斷加重。處理液濃度10 mmol/L時，胚根胚芽的生長率下降緩慢，與對照差異不明顯。當(dāng)處理液濃度超過10 mmol/L時，胚根的相對生長率隨處理液濃度的增加呈直線下降趨勢，各處理之間差異顯著；胚芽的相對生長率隨處理液濃度的遞增緩慢下降；當(dāng)處理液濃度為120 mmol/L時，胚芽的相對生長率比對照下降25.37%，胚根的相對生長率比對照下降60.50%，胚根相對生長率降幅更大，胚根受堿脅迫的抑制更明顯。表1，圖1

表1 處理液基本信息Table 1 Basic information table of processing liquid

2.2 堿脅迫對塔烏庫姆冰草根系內(nèi)外pH影響

研究表明，處理前各處理隨處理液濃度的增加，根系外pH迅速升高，之后趨于穩(wěn)定；相同堿液濃度下，處理后的根系外pH值較處理前有所下降，但都高于處理前pH。表2

其pH值隨堿液濃度的遞增保持在6.65～6.68，除濃度為90 mmol/L外，其它濃度條件下根系內(nèi)pH值與對照差異不顯著，保持了根系內(nèi)pH不受外部環(huán)境的影響。冰草根系在高pH條件下仍舊能保持細(xì)胞內(nèi)pH穩(wěn)定，能夠一定程度上降低根系溶液pH值。表2

表2 根系pH值變化方差Table 2 Variance analysis table of root pH variation

2.3 堿脅迫下冰草根系有機(jī)酸含量變化

研究表明，組織中有機(jī)酸以酒石酸為主，包含檸檬酸和少量蘋果酸，含量依次為酒石酸>檸檬酸>蘋果酸。隨著堿脅迫濃度的升高，酒石酸的含量呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，各濃度處理下酒石酸含量均與對照差異顯著。對照中酒石酸含量呈最高值，為231.67×106μg/kg，150 mmol/L處理時酒石酸含量最低為22.97×106μg/kg，僅為對照的9.91%；10 mmol/L酒石酸含量與對照相比下降了27.91%(P<0.05)，30 mmol/L相比對照減少了53.38%；60、90、120 mmol/L處理相比，酒石酸含量無顯著差異(P>0.05)，但是相比對照分別減少了79.85%、82.91%、78.23%，呈顯著降低趨勢(P<0.05)，隨著堿液濃度的升高酒石酸的積累會受到明顯抑制。圖2

蘋果酸的含量在堿脅迫下呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。與對照相比，10、30、60 mmol/L濃度下與對照差異顯著(P<0.05)，在60 mmol/L濃度時蘋果酸含量最高，為對照含量的3.55倍；當(dāng)濃度≥90 mmol/L時，蘋果酸含量出現(xiàn)明顯下降，各濃度差異不顯著(P>0.05)，在濃度為120 mmol/L時，蘋果酸的含量最低，與對照相比降低65.03%。圖3

檸檬酸的含量隨處理液濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這與蘋果酸的積累過程表現(xiàn)出協(xié)同一致性。在處理液濃度為60 mmol/L時檸檬酸的含量達(dá)到最大值，為對照的1.91倍，與其它濃度含量差異顯著；濃度≥90 mmol/L時，檸檬酸的含量逐漸降低，當(dāng)濃度為150 mmol/L時，檸檬酸的含量仍高于對照(P<0.05)，為對照的1.16倍。圖4

3 討 論

3.1 堿脅迫對塔烏庫姆冰草生長的影響

當(dāng)種子萌發(fā)時，胚根首先突破種皮，發(fā)育成幼苗的根，胚芽突破種皮后發(fā)育成葉和莖。胚根是植物吸收水分的主要器官，根尖部位是感知脅迫最敏感部位，植株受到的脅迫往往最先由根部感知[24]。試驗中，隨處理液濃度的增加，胚根胚芽的相對生長率都呈下降趨勢，即相對生長率與pH值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，結(jié)果與前人研究結(jié)果[25-27]相一致，其原因可能是根部直接接觸堿液環(huán)境，是最直接遭受脅迫的器官，植物會通過根系生理上的一系列改變來適應(yīng)堿脅迫傷害，如通過改變對養(yǎng)分的需求維持自身代謝和改變根系形態(tài)、生理機(jī)能來增強(qiáng)自身活化和吸收養(yǎng)分的強(qiáng)度[28-30]等，致使其生長受抑制作用更明顯。

3.2 根系溶液及根系組織pH值的變化

穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境pH是所有生物維系正常新陳代謝的必要條件，植物在受到外界逆境脅迫時，為保持體內(nèi)酶活性，就必須盡可能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境pH不受環(huán)境干擾[23]。

實驗幼苗根系在含有處理液的營養(yǎng)液中生長，根系一方面從中攝取養(yǎng)分和水分，另一方面向其分泌質(zhì)子、釋放無機(jī)離子、或大量的有機(jī)物質(zhì)，這些物質(zhì)統(tǒng)稱為根系分泌物[31]。根系分泌物組成和含量的變化是作物響應(yīng)環(huán)境脅迫最直接、最明顯的反應(yīng)[32]。試驗發(fā)現(xiàn)，處理前溶液pH值在9.2～10.1，處理后根系溶液的pH值都較處理前有所下降，總體保持在8.5～9.2；根系組織的pH值保持在6.61～6.68，僅處理液濃度為90 mmol/L時與對照差異顯著；植物在受到堿脅迫時，通過根系分泌某種物質(zhì)中和、稀釋或者緩沖高pH對根系的傷害，以保證植物正常生長。

3.3 堿脅迫對塔烏庫姆冰草有機(jī)酸含量的影響

有機(jī)酸是一類有緩沖作用的羧酸化合物，是許多化合物合成的前體，也是植物體內(nèi)物質(zhì)和能量代謝的重要中間產(chǎn)物[33]。某些非生物逆境因子可明顯增加植物根系分泌有機(jī)酸[34]，有機(jī)酸的合成、累積、轉(zhuǎn)運和分泌的增加是植物應(yīng)對環(huán)境脅迫的一種響應(yīng)[35]，通過分泌有機(jī)酸調(diào)節(jié)根際微環(huán)境pH以緩解營養(yǎng)脅迫，這是對環(huán)境的一種適應(yīng)性反應(yīng)[36]。

研究在實驗過程中共檢測到酒石酸、蘋果酸、檸檬酸3種有機(jī)酸。在未受到堿脅迫時，酒石酸的含量濃度為231.67×106μg/kg，蘋果酸和檸檬酸的含量分別為1.63×106、4.37×106μg/kg，酒石酸濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蘋果酸和檸檬酸，其是植物幼苗在未受到逆境脅迫時植株內(nèi)主要參與調(diào)控代謝的有機(jī)酸。酒石酸的含量隨堿液濃度的增加呈急劇下降趨勢，高濃度的堿液環(huán)境抑制了酒石酸的積累，當(dāng)堿液濃度≥60 mmol/L時其含量仍呈減少趨勢，但差異不顯著。

蘋果酸是三羧酸循環(huán)及其支路乙醛酸循環(huán)代謝過程中的重要中間產(chǎn)物[37]，能通過呼吸作用對植物體內(nèi)許多代謝過程產(chǎn)生調(diào)控[38]。當(dāng)植物受到重金屬、干旱、鹽堿、高溫等非生物脅迫時，細(xì)胞中的蘋果酸積累量會顯著增加，在提高植物抗逆能力方面發(fā)揮重要作用[39-41]。檸檬酸也是三羧酸循環(huán)的重要代謝產(chǎn)物，廣泛分布于植物、動物與微生物細(xì)胞中，可以促進(jìn)機(jī)體腺苷三磷酸(ATP)的生成，促進(jìn)新陳代謝、恢復(fù)細(xì)胞活力[42]。蘋果酸與檸檬酸的含量較酒石酸含量低，但是在堿脅迫條件下，二者調(diào)節(jié)冰草根系內(nèi)pH的作用是明顯的。楊春武等[42]結(jié)果表明，有機(jī)酸積累是小冰麥(Triticumaestivum-Agropyronintermedium)在堿脅迫下保持體內(nèi)離子平衡和pH穩(wěn)定的關(guān)鍵生理響應(yīng)。蘋果酸與許多植物的抗逆作用密切相關(guān)[44]，研究中發(fā)現(xiàn)蘋果酸在未受到堿液脅迫時，在植株體內(nèi)含量僅為1.63×106(μg/kg)，隨著pH的增加，其含量在60 mmol/L時顯著積累達(dá)到最大值即5.78×106(μg/kg)，與其它各處理差異顯著，超過60 mmol/L蘋果酸含量大幅降低甚至低于對照，蘋果酸各處理含量無差異，失去pH調(diào)節(jié)作用；檸檬酸與蘋果酸總體趨勢一致，也在60 mmol/L時達(dá)到最大值8.35×106(μg/kg)，比對照增加了2倍的積累量。干旱脅迫下棉花體內(nèi)檸檬酸積累的現(xiàn)象[45]，鹽脅迫下苜蓿根中檸檬酸含量增加的現(xiàn)象[46]。楊國會[9]在堿脅迫誘導(dǎo)小冰麥有機(jī)酸積累和分泌的研究中發(fā)現(xiàn)，堿脅迫下蘋果酸、檸檬酸含量隨堿脅迫而顯著增大，與研究結(jié)果相一致。當(dāng)堿液濃度大于60 mmol/L時檸檬酸含量緩慢降低，總體仍高于對照，高濃度的pH繼續(xù)誘導(dǎo)植物根系分泌以檸檬酸為主的有機(jī)酸，以中和高鹽對植物體的傷害是塔烏庫姆冰草針對堿脅迫的特異生理響應(yīng)。

3.4 有機(jī)酸變化趨勢與pH值之間的關(guān)系

在不同濃度的堿液脅迫下根系分泌的有機(jī)酸中發(fā)現(xiàn)，酒石酸的含量在堿液濃度為60 mmol/L即pH為9.8時與低濃度堿液脅迫時差異顯著，大于60 mmol/L時與堿液濃度150 mmol/L差異顯著，其它濃度差異不顯著，由此得出60 mmol/L為酒石酸分泌量的重要拐點，超過60 mmol/L酒石酸分泌量趨于穩(wěn)定，對pH的控制作用不明顯；蘋果酸和檸檬酸的含量均在堿液濃度為60 mmol/L時達(dá)到分泌量的最大值，與其它各濃度差異顯著，60 mmol/L是蘋果酸和檸檬酸分泌量的高峰點。張一弓[20]在對堿脅迫下塔烏庫姆冰草的萌發(fā)及生理響應(yīng)研究中發(fā)現(xiàn)堿脅迫濃度≤60 mmol/L，即pH≤9.8是塔烏庫姆冰草能夠萌發(fā)和生長的最大耐堿性范圍，該結(jié)論與該文的研究結(jié)果相呼應(yīng)。塔烏庫姆冰草在堿液濃度為60 mmol/L、pH為9.8時如此耐堿，是通過積累以蘋果酸和檸檬酸為主的有機(jī)酸來維持根系組織pH穩(wěn)定，通過分泌有機(jī)酸調(diào)節(jié)根系環(huán)境pH，以中和或緩沖堿脅迫。

4 結(jié) 論

堿脅迫致塔烏庫姆冰草胚根胚芽生長緩慢，胚根受抑制更明顯；隨處理液濃度的增加，幼苗根系會分泌以蘋果酸、檸檬酸為主的有機(jī)酸，二者相互作用抵御高pH對植物的傷害，使植物根系內(nèi)pH保持在6.65～6.68。冰草根系分泌的有機(jī)酸在堿脅迫過程中雖然明顯增加，但不能阻止高濃度的pH對植物幼苗的傷害，處理液濃度為60 mmol/L，即pH為9.8時，有機(jī)酸分泌量為調(diào)控冰草根系pH最適宜濃度。