段凱越，趙景壯，任廣明,4，邵軼智，盧彤巖, 4，何保全，徐黎明*

(1.上海海洋大學 水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306； 2.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070； 3.上海海洋大學 農業(yè)部漁業(yè)動植物病原庫，上海 201306； 4.中國水產科學研究院長江水產研究所，湖北 武漢 430223)

虹鱒Oncorhynchusmykiss是中國主要冷水魚養(yǎng)殖品種，廣泛分布在中國東北、西北、西南等冷水資源較發(fā)達的地區(qū)，在帶動當地經濟發(fā)展、促進漁民增收方面發(fā)揮了積極的作用。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大、苗種的頻繁流通，虹鱒病害頻發(fā)，嚴重制約了冷水魚養(yǎng)殖業(yè)的綠色健康發(fā)展。

傳染性胰臟壞死病(infectious pancreatic necrosis，IPN)是一種全球流行性疾病，于20世紀50年代在美國開始流行[1]，至今已傳播到法國[2]、土耳其[3]、智利[4]、墨西哥[5]、芬蘭[6]、挪威[7]、西班牙[8]、日本[9]、韓國[10]和伊朗[11]等國家，給鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經濟損失。該病是由傳染性胰臟壞死病毒(infectious pancreatic necrosis virus，IPNV)引起的一種病毒性疾病，主要威脅鮭科魚類。IPNV隸屬于雙RNA病毒科Birnavirdate水生雙RNA病毒屬Aquabirnavirus，其病毒粒子無囊膜包裹，呈二十面體。IPNV的基因組由A和B兩條RNA組成。A鏈包含兩個重疊的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，其中較大的ORF編碼外衣殼蛋白VP2、內衣殼蛋白VP3和蛋白酶VP4，小ORF編碼非結構多肽VP5[12-13]。B鏈編碼RNA依賴性RNA聚合酶VP1，用于轉錄和復制病毒基因組[14-15]。利用交叉中和測定法可將水生雙RNA病毒分為A和B兩個血清群(serogroup)[16]，其中，血清群A包含9種血清型，即A1(West Buxton，WB)、A2(Spajarup，Sp)、A3(Abild，Ab)、A4(Hecht，He)、A5(Tellina，Te)、A6(Canada 1，C1)、A7(Canada 2，C2)、A8(Canada 3，C3)和A9(Jasper，Ja)[17]，血清群B僅具有血清型B1。利用系統(tǒng)發(fā)育分析方法，可將水生雙RNA病毒分為7個基因型，包括基因組Ⅰ～Ⅶ(genogroup Ⅰ～Ⅶ)。目前IPNV基因型主要分布在基因組Ⅰ～Ⅵ[18]。中國于20世紀80年代首次暴發(fā)IPN疫情。該病在中國已經流行了30余年，造成了巨大的經濟損失，成為制約中國鮭鱒魚產業(yè)發(fā)展的重要疫病之一。已知的中國境內分離的IPNV為基因組Ⅴ型和基因組Ⅰ型[19-23]。

2020年，中國西北某虹鱒養(yǎng)殖場幼魚發(fā)生持續(xù)性死亡，死亡歷程延續(xù)4個月之久，累計死亡率近20%。為探究造成虹鱒幼魚死亡的病因，本研究團隊開展了流行病學調查工作，本研究中對患病虹鱒進行了組織病理學觀察，對病原進行分離鑒定，并進行了病毒分離株的系統(tǒng)發(fā)育分析、電鏡觀察及人工回歸感染試驗，以期為虹鱒養(yǎng)殖業(yè)中的疾病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

大鱗大麻哈魚胚胎細胞(chinook salmon embryo cells，CHSE-214)和胖頭鱥上皮細胞(epithelioma papulosum cyprini, EPC)由中國水產科學研究院長江水產研究所魚類病害教研室曾令兵研究員惠贈。PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒、Trizol試劑、DL2000 marker購自寶生物工程(大連)有限公司。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、胰酶(體積分數0.25%的EDTA-Tyrisin)、M199培養(yǎng)基購自Gibco公司。健康虹鱒(平均體質量5 g)購自遼寧本溪艾格莫林實業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本信息及組織病理學觀察 本試驗中共采集了3份患病虹鱒樣品，分別取自發(fā)病養(yǎng)殖場的孵化車間(體質量3～5 g，命名為F1)及養(yǎng)殖區(qū)域的兩個不同網箱(體質量20～30 g，分別命名為W1和W2)。分別取患病魚的肝、脾及腎組織，使用波恩氏液進行固定。用石蠟包埋制作切片后進行H.E染色。采用中性樹脂膠封片后，利用光學顯微鏡觀察組織病理變化。

1.2.2 病毒的分離培養(yǎng) 取患病虹鱒的肝、脾、頭腎組織混合勻漿，4 ℃下以12 000 r/min 離心5 min。用0.22 μm無菌過濾器對離心后的上清液進行無菌處理，然后用細胞維持液(含體積分數2%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和鏈霉素的M199培養(yǎng)基)將無菌組織勻漿上清液稀釋10倍接種于CHSE-214及EPC單層細胞，于15 ℃培養(yǎng)箱中吸附1 h后棄上清液，補加細胞維持液后置于15 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7 d內每天利用倒置顯微鏡觀察細胞狀態(tài)。若出現細胞病變(cytopathic effect，CPE)，則待80%的細胞出現病變時，收獲細胞培養(yǎng)物儲存于-80 ℃超低溫冰箱中；若未出現細胞病變，將細胞培養(yǎng)物進行盲傳，如果7 d內觀察到細胞病變則收獲細胞培養(yǎng)液存于-80 ℃超低溫冰箱中，若無細胞病變則判定該樣本為目標病毒陰性。

1.2.3 病毒的RT-PCR鑒定 根據中華人民共和國國家標準傳染性造血器官壞死病毒診斷規(guī)程(GB/T 15805.2—2017)[24]合成擴增傳染性造血器官壞死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)部分G基因的引物，其擴增片段大小為693 bp。根據文獻[25]合成擴增IPNV部分VP2基因的引物，其擴增片段大小為584 bp。以Trizol試劑提取的上述細胞培養(yǎng)物總RNA為模板，使用One Step RT-PCR Kit，分別利用上述引物對細胞培養(yǎng)物進行鑒定。一步法RT-PCR擴增反應的步驟為：50 ℃反轉錄30 min；95 ℃下預變性4 min；95 ℃下變性30 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸60 s，共進行35個循環(huán)；最后在72 ℃下終延伸10 min。擴增產物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行分析。陽性PCR樣本由吉林省庫美生物(中國長春)純化并進行基因序列測定。利用National Center for Biotechnology Information(NCBI)中的BLAST對鑒定的基因序列進行比對分析。

1.2.4 IPNV系統(tǒng)發(fā)育分析 選用VP2基因序列，使用MEGA X軟件中的最大似然法，采用自展值(bootstrap)為1 000[26]，最佳核苷酸代替模型為GTR+G，對分離的IPNV毒株進行系統(tǒng)發(fā)育分析。利用Megalign軟件計算本研究中分離的IPNV毒株與基因組Ⅰ～Ⅶ型水生雙RNA病毒VP2基因序列的一致性。本研究中使用的參考毒株信息見表1。

表1 本研究所用的參考毒株

1.2.5 IPNV的電鏡觀察 收集出現細胞病變的CHSE-214細胞，用PBS磷酸緩沖溶液洗滌3次，用體積分數2.5%的戊二醛溶液在4 ℃下固定24 h。然后用體積分數1%的四氧化鋨在25 ℃下固定70 min并使用乙醇溶液脫色。用丙酮沖洗細胞后，將其包埋在樹脂中，用乙酸鈾酰-檸檬酸鉛染色，然后使用透射電子顯微鏡(Hitachi 7650,日本)對細胞內病毒粒子進行觀察[27]。

1.2.6 IPNV滴度的測定 使用CHSE-214細胞對IPNV分離株的半數組織培養(yǎng)物感染劑量(tissue culture infective dose，TCID50)進行測定。具體方法如下：將CHSE-214細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，當細胞匯合成單層細胞，將體外傳代3次的IPNV病毒懸液用細胞維持液進行10倍梯度稀釋(10-1～10-8)，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每個稀釋度接8個孔，每孔接100 μL。同時設置只添加細胞維持夜的細胞作為陰性對照。將接種好的96孔細胞培養(yǎng)板置于15 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，對出現病變及未病變的細胞孔進行計數，并按Reed-Muench公式計算IPNV分離株的滴度。

1.2.7 人工回歸感染試驗 隨機將虹鱒分為4組，每組30尾。攻毒組為健康虹鱒腹腔注射IPNV細胞培養(yǎng)物(0.1 mL/尾)，對照組為健康虹鱒腹腔注射空白細胞培養(yǎng)物(0.1 mL/尾)。攻毒后將虹鱒置于15 ℃循環(huán)水族箱中隔離喂養(yǎng)，每天記錄虹鱒的臨床癥狀及死亡情況。分別在攻毒后的第30天和第60天，從每組取5尾魚的肝、脾、頭腎組織分別混合，按照每克組織加10 mL PBS溶液的比例進行勻漿，4 ℃下以12 000 r/min 離心10 min，組織勻漿上清用0.22 μm無菌濾膜過濾，進行10倍梯度稀釋并接種于96孔細胞培養(yǎng)板，按“1.2.6節(jié)”中的方法測定IPNV在組織中的含量。

2 結果與分析

2.1 患病魚臨床癥狀及組織病理學觀察

患病虹鱒表現為離群，上浮于水面，游動緩慢，出現眼球突出(圖1A)、體色發(fā)黑(圖1C)、腹部及脾臟腫大和肝臟蒼白等癥狀(圖1B)。組織病理學觀察顯示，患病魚肝脾腎組織細胞廣泛性壞死、空泡化、溶解，腎小球結構不完整，細胞溶解。

A～C—患病魚臨床癥狀；D—正常虹鱒的肝；E—正常虹鱒的脾；F—正常虹鱒的腎；G—患病虹鱒的肝；H—患病虹鱒的脾；I—患病虹鱒的腎。

2.2 病毒的細胞分離

取患病虹鱒的肝、脾、頭腎組織制備勻漿后分別接種CHSE-214及EPC細胞，進行鮭鱒常見病毒分離。接種后48 h,各組CHSE-214細胞均出現明顯病變，表現為細胞變薄、消融、出現圓形膜結構，而此時的EPC細胞則無任何病變；在接毒后72 h，各組CHSE-214細胞大面積崩解，脫落嚴重，80%以上的細胞出現崩解，接種W1和W2的EPC細胞開始變圓，部分脫落，而接種F1樣品的EPC細胞盲傳后仍無細胞病變(圖2和圖3)；陰性對照CHSE-214和EPC細胞狀態(tài)始終正常。

圖2 接種IPNV后CHSE-214細胞的病變

2.3 病毒的RT-PCR鑒定

對出現細胞病變的細胞培養(yǎng)物(包括F1、W1和W2接種的CHSE-214細胞及W1和W2接種的EPC細胞)進行總RNA提取，利用IHNV和IPNV的鑒定引物進行一步法RT-PCR擴增。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，全部細胞培養(yǎng)物在IPNV鑒定中均獲得了與目的條帶大小相符的特異性條帶(584 bp)，而在IHNV鑒定中未觀察到任何條帶，陽性對照及陰性對照泳道均正常(圖4)。測序結果顯示，同一樣品接種CHSE-214和EPC細胞分離獲得的病毒株目的基因序列一致，而不同樣品之間的目的基因序列不同。將擴增獲得的基因序列在GenBank中進行BLAST比對，結果顯示，上述基因序列與IPNVVP2基因的同源性最高，序列一致性高達99.81%～99.05%。將分離獲得的病毒分別命名為IPNV-F1、IPNV-W1、IPNV-W2。

M—DL2000 DNA marker；P—陽性對照；N—陰性對照；IHF1、IHW1、IHW2—IHNV的鑒定；IPF1、IPW1、IPW2—IPNV的鑒定。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank中獲取基因組Ⅰ～Ⅶ 型的水生雙RNA病毒VP2基因序列，采用本研究中RT-PCR鑒定獲得的IPNVVP2基因片段序列，對IPNV毒株進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結果顯示，本研究中分離的IPNV毒株分屬兩種不同的基因型，IPNV-F1和IPNV-W2屬于基因組Ⅰ型，IPNV-W1屬于基因組Ⅴ型；IPNV-F1和IPNV-W2分別與中國IPNV分離株WZ2016及ChRtm213具有最近的親緣關系，VP2基因序列一致性分別為100%和98.5%；IPNV-W1與同屬基因組Ⅴ型的意大利毒株IPNV/O.mykiss/I/PN/208/Mar88(MG543567)具有最近的親緣關系，二者的VP2基因片段序列一致性為99.1%(圖5)。

圖5 基于VP2基因片段序列構建的水生雙RNA病毒系統(tǒng)進化樹

2.5 IPNV分離株的電鏡觀察

將IPNV分離株接種于CHSE-214細胞48 h后，制備超薄切片進行電鏡觀察。結果顯示，在細胞質中觀察到呈晶格狀排列的無囊膜多面體IPNV病毒粒子，符合IPNV病毒粒子胞內排列特點(圖6)。

圖6 IPNV分離株的電鏡觀察

2.6 IPNV分離株滴度的測定

將IPNV病毒懸液以10倍梯度稀釋后接種于96孔細胞培養(yǎng)板，于15 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后，記錄病變及未病變細胞孔的數目，按照Reed Muench公式，計算出3株IPNV分離株的平均滴度分別為107.43TCID50/0.1 mL(IPNV-F1)、107.30TCID50/0.1 mL(IPNV-W1)和107.29TCID50/0.1 mL(IPNV-W2)。

2.7 人工回歸感染試驗

將3株IPNV分離株分別以0.1 mL/尾的劑量腹腔注射健康虹鱒，觀察到虹鱒體色發(fā)黑、眼球突出、拖管狀透明糞便等臨床癥狀，但是攻毒后60 d內未觀察到虹鱒魚死亡。對攻毒虹鱒肝、脾、腎組織內IPNV含量的測定發(fā)現，隨著時間的延長，虹鱒組織中的病毒滴度逐漸下降，在攻毒后30 d，IPNV在虹鱒肝脾腎組織的平均滴度分別為104.50TCID50/0.1 g組織(IPNV-F1)、105.38TCID50/0.1 g組織(IPNV-W1)及104.13TCID50/0.1 g組織(IPNV-W2)，而在攻毒后60 d，IPNV在虹鱒組織中的平均滴度逐步下降為103.43TCID50/0.1 g組織(IPNV-F1)、104.50TCID50/0.1 g組織(IPNV-W1)及103.21TCID50/0.1 g組織(IPNV-W2)。

3 討論

3.1 中國養(yǎng)殖虹鱒病毒的流行病學調查

IHNV和IPNV是危害虹鱒的兩種主要病毒，中國學者于20世紀80年代在國內養(yǎng)殖場便分離到了這兩種病毒。目前,這兩種病毒仍然是中國鮭鱒養(yǎng)殖環(huán)境最主要的病毒，并且自然條件下虹鱒能夠共感染這兩種病毒[28]。IHNV感染及IPNV感染均可導致虹鱒游動遲緩、離群，體色發(fā)黑、眼球突出，糞便呈管狀透明白色等癥狀。本研究中采集的虹鱒樣本臨床癥狀與上述癥狀相符。綜合以上因素，本研究中針對這兩種病毒開展了分離鑒定工作，利用國家標準推薦的細胞系進行了病毒的分離，結果從該發(fā)病養(yǎng)殖場成功分離出IPNV毒株。本實驗室人員此前曾從該養(yǎng)殖場網箱養(yǎng)殖虹鱒中分離出IHNV毒株，并且此次檢測時該養(yǎng)殖場環(huán)境條件也符合IHNV發(fā)病條件，但是并未在患病魚體內檢測到IHNV，只檢測到了IPNV。曾有學者發(fā)現，虹鱒共感染IPNV和IHNV時，IPNV對IHNV具有抑制作用[29]。本研究中未檢測到IHNV可能與該抑制作用有關，但是有待進一步流行病學調查研究驗證。本實驗室曾檢出過IHNV/IPNV共感染病例[30]，當時共感染病例在一個月內累計死亡率高達80%以上。本次發(fā)病虹鱒4個月內累計死亡率僅為20%，遠遠低于已報道的IHNV感染病例或者IHNV/IPNV共感染病例。根據毒株、宿主種類及大小、環(huán)境因素的差異，IPNV感染可導致虹鱒截然不同的死亡率，因此，應進一步加強傳染性胰臟壞死病的流行病學研究深度與廣度，充分掌握其病原學數據，為傳染性胰臟壞死病的科學防控提供參考。

3.2 中國IPNV毒株的基因型與血清型

VP2是IPNV病毒的主要結構蛋白，其上有中和抗體表位，能誘發(fā)宿主機體產生抗體免疫反應[31]，根據該基因的不同，可將水生雙RNA病毒分為7個基因型[18]。這7個基因型一共包含10種血清型。中國最初分離到的IPNV均為SP血清型[21-23]、基因組Ⅴ型，近年有報道稱在國內虹鱒養(yǎng)殖場分離到了基因組Ⅰ型的IPNV[19-20]。本研究中，在同一養(yǎng)殖場同時獲得了這兩種基因型的IPNV毒株，進一步證明了相同的養(yǎng)殖環(huán)境可同時存在這兩種基因型的IPNV。由于缺乏標準中和抗體，未對本研究中分離的IPNV毒株進行中和抗體試驗，因此，其血清型仍然未知。本研究中所分離的IPNV-F1和IPNV-W2屬于基因組Ⅰ型，其中IPNV-F1與中國IPNV分離株ChRtm213(云南省)同源性最高，IPNV-W2與中國IPNV分離株WZ2016(四川省)同源性最高，這兩株IPNV與日本的AM-98(AY283780)具有較高的同源性。而IPNV-W1則屬于基因組Ⅴ型，由于目前GenBank數據庫中未收錄中國基因組Ⅴ型IPNV毒株VP2基因序列，因此，無法得知該分離株與國內其他基因組Ⅴ型IPNV毒株的同源性，但是經過分析發(fā)現，該毒株與意大利毒株IPNV/O.mykiss/I/PN/208/Mar88同源性最高。同源性的高低一定程度上反映病毒進化來源關系，同源性越高表明來源自同一原始毒株的可能性越大。因此，中國IPNV毒株很可能與日本及意大利毒株來源于相同的原始祖先。由于IPNV能以水平傳播的方式感染宿主，養(yǎng)殖場在引進種苗的過程中應加強對IPNV的監(jiān)控力度，避免攜帶IPNV魚苗的流通。

3.3 IPNV分離株的毒力特性

本研究中，利用CHSE-214及EPC細胞對組織病料進行病毒分離培養(yǎng)，結果發(fā)現，獲得的IPNV分離株均能在CHSE-214細胞上生長并產生典型細胞病變，其中2株IPNV毒株可以在EPC細胞上生長并產生細胞病變。但是IPNV在EPC細胞上出現細胞病變所需時間較在CHSE-214細胞上出現細胞病變的時間長。該結果表明，CHSE-214更適合用作IPNV分離的敏感細胞系。因此，本研究中利用CHSE-214細胞對所獲得IPNV分離株進行了滴度測定，結果發(fā)現，這3株IPNV分離株的細胞毒力無顯著差異，均可達107TCID50/0.1 mL。盡管各IPNV分離株在CHSE-214細胞上具有較高的滴度，采用0.1 mL/尾病毒原液的劑量對虹鱒進行人工回歸感染試驗，但仍未能造成虹鱒死亡。此前，有學者發(fā)現[32]，對虹鱒進行攻毒，其死亡率較低且臨床癥狀不明顯。Bruslind等[33]的研究結果也發(fā)現，強毒株IPNV易感染魚苗但未表現出臨床癥狀，并且病毒在宿主中復制的能力與其對魚的致死能力無關。由此可知，盡管自然暴發(fā)傳染性胰臟壞死病會造成虹鱒大規(guī)模死亡，但是IPNV攻毒模型的建立仍然存在困難，因此，多數學者均采用測定試驗動物體內病毒載量來對傳染性胰臟壞死病疫苗效果進行評價[34]。但是該方法存在一定的局限性，無法直接反映疫苗的保護率。因此，今后應針對IPNV開展更深入的基礎研究，為傳染性胰腺壞死病的科學防控提供指導。

4 結論

1) 本研究首次從同一養(yǎng)殖場患病虹鱒體內分離到基因組Ⅰ型(命名為IPNV-W2和IPNV-F1)和基因組Ⅴ型(命名為IPNV-W1)的IPNV毒株，其中，IPNV-W2和IPNV-F1分別與中國IPNV分離株WZ2016(KX355401)和ChRtm213(KX234591)同源性最高，IPNV-W1與意大利的IPNV分離株同源性最高。

2) 盡管本研究中分離的IPNV毒株在CHSE-214細胞上具有較高的滴度，也能很好地在虹鱒體內繁殖，但人工回歸感染并未造成虹鱒死亡。