王 蔚 杜 淵 鐘 霞 王洪連 孫長偵 劉增金 王 麗 楊思進

腦出血是臨床常見的急性、危重性疾病，在中老年人群中發(fā)病率較高，為(12～15)/10萬人年，在卒中類疾病中位居第二，該病的臨床病死率和致殘率亦較高，發(fā)病1個月內(nèi)的病死率高達35%～52%，嚴重威脅人類健康，對生存質(zhì)量造成嚴重影響[1]。課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，具有活血化瘀、祛痰通絡的蛭龍活血通瘀膠囊，能夠有效治療腦出血，促進患者神經(jīng)功能損傷的恢復，改善腦出血后腦水腫形成，保護腦組織[2，3]，但該藥的作用機制尚待進一步闡明。Rho/ROCK信號通路能夠介導腦出血后炎癥反應，影響血腦屏障通透性，與腦出血后腦水腫密切相關，為腦出血的藥物研究提供了新途徑。本研究通過觀察蛭龍活血通瘀膠囊對大鼠神經(jīng)功能評分，以及血腫周圍組織ROCK2、RhoA、p-MLC的表達，進一步探索該藥防治腦出血的有效作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性健康的SPF級SD大鼠，共96只，體質(zhì)量(280±20)g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，實驗單位使用許可證號為SYXK(川)2018-065。飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學實驗動物研究中心，環(huán)境溫度(22±2)℃，濕度30%～40%，普通大鼠飼料喂養(yǎng)，自由攝食及飲水。

1.2 藥物及儀器蛭龍活血通瘀膠囊(主要成分：黃芪、水蛭、地龍、大血藤、桂枝等)，規(guī)格0.4 g/粒，由西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，批號：20180216；鹽酸法舒地爾注射液：規(guī)格2 ml∶30 mg/支，成都菀東藥業(yè)有限公司，批號：180101；兔抗ROCK2多克隆抗體：abcam；羊抗RhoA多克隆抗體：Novus；小鼠抗p-MLC單克隆抗體：CST；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：Thermo scientific；大鼠腦立體定位儀：北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司；ATPB457A小動物電子稱：深圳安普特電子科技有限公司；BSA224S精密電子天平：賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；Centrifuge 5424 R臺式高速冷凍離心機：德國Eppenderf；Thermo 991-80 ℃超低溫冰箱：美國賽默飛世爾；IMS-40全自動雪花制冰機：常熟雪珂電器有限責任公司；KJ201-BS型震蕩器：江蘇康健醫(yī)療用品有限公司；DYY-10C電泳儀：北京六一儀器廠；ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad；NanoDrop 2000超微量分光光度計：Thermo scientific； LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀：瑞士Roche。

1.3 造模及模型評估大鼠稱重后以400 mg/kg腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，距尾尖0.5 cm處剪斷鼠尾，取血50 μl備用。用腦立體定位儀以大鼠俯臥位固定鼠頭，常規(guī)備皮及消毒后，沿頭皮正中縱向切開約10 mm，用30%雙氧水腐蝕骨膜使前囟及冠狀縫充分暴露，調(diào)節(jié)定位儀X、Y軸坐標以定位尾殼核區(qū)域，使針尖垂直于矢狀縫右側(cè)3.0 mm，前囟前0.2 mm處，用三棱針在針尖下鉆開顱骨，以顱骨外板為零點調(diào)節(jié)定位儀Z軸，進針深度為6.0 mm，以5 μl/min勻速將血緩慢注入，留針約15 min后緩慢退針，用骨蠟將鉆孔封閉，術后頭皮并常規(guī)縫合消毒[4，5]。假手術組大鼠只進針不注血。術后按照“5分制法”對大鼠進行神經(jīng)功能評分[6]，評分為1～3分則認為造模成功，可納入實驗。

1.4 分組及給藥實驗大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術組、腦出血模型組、鹽酸法舒地爾組、蛭龍活血通瘀組，各24只，各組又劃分為12 h、48 h、3 d、7 d，4個亞組每組6只。蛭龍活血通瘀組灌胃給藥每日1.2 g/kg，灌胃體積為3 ml；鹽酸法舒地爾組腹腔注射每日12 mg/kg[7]；假手術組和腦出血模型組均給予同蛭龍活血通瘀組等體積的生理鹽水灌胃。

1.5 觀察指標

1.5.1 神經(jīng)功能評分采用學術界公認的大鼠卒中后神經(jīng)功能損害程度評分(Neurological Severity Scores，NSS)[8]對大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)功能進行綜合測評。測評的內(nèi)容包括提尾測試、行走測試、感覺測試、平衡測試、反射及異常活動。該項測試的總分為18分，分值越高說明大鼠的神經(jīng)功能損害程度越嚴重，若為0分則說明無神經(jīng)功能損害。

1.5.2 腦組織ROCK2、p-MLC蛋白表達采用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測腦組織中ROCK2、p-MLC蛋白的表達。大鼠NSS評分后，在規(guī)定時點予以深度麻醉，快速取出腦組織，去除軟腦膜及表面血液，切取出血側(cè)大腦半球血腫周圍腦組織，置于試管中，立即保存至-80 ℃冰箱。取0.1 g腦組織，用1 ml RAPI裂解液研磨粉碎提取蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，取50 μg總蛋白量進行SDS-PAGE電泳，濕法電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，相應一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后，HRP酶聯(lián)二抗常溫孵育1 h，TBST洗滌，化學發(fā)光法進行信號檢測。

1.5.3 qRT-PCR檢測ROCK2、RhoA mRNA水平采用實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)法檢測大鼠腦組織ROCK2、RhoA mRNA水平。大鼠NSS評分結(jié)束后，給予深度麻醉，快速取出腦組織，去除軟腦膜及表面血液，切取出血側(cè)大腦半球血腫周圍腦組織，置于試管中，立即保存至-80 ℃冰箱。用Trizol法提取總RNA，根據(jù)ROCK-2、RhoA的cDNA序列，由上海生物工程有限公司合成引物。

ROCK2：

上游5’-AGACAGGGAGGTACGACTTGGAAG-3’

下游5’-ACCACTGGAGCTGCCGTCTC-3’

RhoA：

上游5’-GCTACACCACCAATGCCTTCCC-3’

下游5’-CAGCCCCAGGTTCACAGGTTTAC’

逆轉(zhuǎn)錄后按95 ℃ 10 min預變性，40個循環(huán)(變性95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s)進行Real-time PCR擴增，用熒光定量PCR儀進行常規(guī)溶解曲線分析測定Ct值，以2-△△CT的計算值作為相對表達水平[9]。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠NSS評分比較假手術組術后12 h時NSS評分稍有升高，之后完全恢復；與假手術組比較，腦出血模型組各時點NSS評分均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，模型組大鼠于術后3 d時NSS評分最高，7 d時有所降低；與模型組比較，蛭龍活血通瘀組、鹽酸法舒地爾組各時點NSS評分均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠NSS評分比較 (只，

2.2 各組大鼠ROCK2蛋白相對表達量比較假手術組大鼠各時點腦組織內(nèi)ROCK2蛋白均無明顯改變(P>0.05)；與假手術組相比，腦出血模型組腦組織ROCK2蛋白在各時點表達均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，模型組術后ROCK2蛋白表達12 h至3 d時逐漸升高，至7 d時有所降低；與模型組相比，蛭龍活血通瘀組、鹽酸法舒地爾組大鼠腦組織ROCK2蛋白表達在各時點均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠ROCK2蛋白相對表達量比較 (只，

2.3 各組大鼠p-MLC蛋白相對表達量比較假手術組大鼠各時點腦組織內(nèi)p-MLC蛋白均無明顯改變(P>0.05)；與假手術組相比，腦出血模型組大鼠腦組織p-MLC蛋白在各時點表達均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，模型組術后p-MLC蛋白表達12 h至3 d時逐漸升高，至7 d時有所降低；與模型組相比，蛭龍活血通瘀組、鹽酸法舒地爾組p-MLC蛋白表達在各時點均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠p-MLC蛋白相對表達量比較 (只，

2.4 各組大鼠ROCK2 mRNA水平比較假手術組大鼠各時點腦組織內(nèi)ROCK2 mRNA水平均無明顯改變(P>0.05)；與假手術組相比，腦出血模型組大鼠腦組織ROCK2 mRNA水平在各時點表達均明顯升高(P<0.05)，術后ROCK2 mRNA水平12 h至3 d呈逐漸升高，至7 d時有所降低；與模型組相比，蛭龍活血通瘀組、鹽酸法舒地爾組大鼠腦組織ROCK2 mRNA水平在各時點均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠ROCK2 mRNA水平比較 (只，

2.5 各組大鼠RhoA mRNA水平比較假手術組大鼠腦組織內(nèi)RhoA mRNA水平各時點之間均無明顯變化(P>0.05)；與假手術組相比，腦出血模型組大鼠腦組織RhoA mRNA水平在各時點表達均明顯升高(P<0.05)，模型組術后RhoA mRNA水平于12 h至3 d呈逐漸升高，至7 d時有所降低；與模型組相比，蛭龍活血通瘀組、鹽酸法舒地爾組RhoA mRNA水平在各時點均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠RhoA mRNA水平比較 (只，

3 討論

近年來在腦出血的藥物研究領域，與之相關信號通路的研究越來越受到學術界的關注，并逐漸成為研究的熱點。在與腦出血后腦水腫相關的信號通路中，Rho-ROCK信號傳導通路具有重要的作用。該通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在極為普遍，可介導神經(jīng)細胞的再生、血管通透性、組織生長等多種機體功能[10，11]。ROCK2、RhoA是該信號傳導通路上的關鍵因子。Rho激酶(Rho-associated kinase)，即Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiled-coil forming protein kinase，ROCK)包括ROCK1、ROCK2，后者主要分布于大腦皮質(zhì)、小腦浦肯野細胞、海馬神經(jīng)細胞等部位。Rho GTP酶的相對分子量為20～25 kD，它們在細胞骨架的重組及調(diào)控方面具有重要的作用。研究表明，Rho GTP酶目前已發(fā)現(xiàn)有5個亞家族，它們分別是Rho亞家族、Rac亞家族、Cdc42亞家族、Rnd亞家族，以及Rho BTB亞家族。共包括20個成員，其中RhoA屬于Rho亞家族[12]。當機體發(fā)生腦出血等疾病狀態(tài)時，體內(nèi)的Rho-ROCK信號傳導通路被激活，Rho GTP酶與Rho激酶結(jié)合，使鈣調(diào)蛋白形成增加，Ca離子濃度在細胞內(nèi)升高，肌球蛋白輕鏈激酶(Myosin light chain kinase，MLCK)被活化，磷酸化肌球蛋白輕鏈(Phosphorylated myosin light chain，p-MLC)水平升高，最后導致血腦屏障功能減弱，血管內(nèi)皮細胞的通透性增加，腦水腫形成[13]。

為了進一步研究蛭龍活血通瘀膠囊防治腦出血的作用機制，我們以Rho/ROCK信號通路為研究出發(fā)點，以Rho激酶抑制劑鹽酸法舒地爾注射液作為陽性對照，比較各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分，采用Western blot、qRT-PCR技術，觀察蛭龍活血通瘀膠囊對腦出血大鼠血腫周圍組織ROCK2、RhoA、p-MLC表達的影響。本研究結(jié)果顯示，腦出血模型組大鼠NSS評分明顯高于假手術組(P<0.01)，存在明顯神經(jīng)功能損傷的表現(xiàn)，腦出血后Rho/ROCK信號通路被激活，模型組大鼠血腫周圍組織ROCK2、p-MLC蛋白表達在各時點均較假手術組明顯升高(P<0.01)，ROCK2、RhoA mRNA水平在各時點均較假手術組明顯上升(P<0.05)；而蛭龍活血通瘀組、鹽酸法舒地爾組大鼠NSS評分在各時點均較模型組顯著降低(P<0.01)，血腫周圍組織ROCK2、p-MLC蛋白表達各時點均顯著下降(P<0.01)，ROCK2、RhoA mRNA水平各時點均較模型組顯著降低(P<0.05)。綜上，蛭龍活血通瘀膠囊能夠明顯改善腦出血大鼠神經(jīng)功能損傷，起到良好的腦保護作用，這可能與該藥抑制Rho/ROCK通路，下調(diào)腦內(nèi)ROCK2、RhoA、p-MLC的表達有關。