張景霞，趙重博，李凡，李雅娟，王衛(wèi)鋒，李莎莎，李芳*

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003

抑郁癥是最常見的精神疾病，患者表現(xiàn)為心情持久低落、悲觀，多伴有睡眠障礙、身體不適、思維遲緩等，癡呆患病率高，神經(jīng)心理學(xué)測(cè)試受損較大，嚴(yán)重會(huì)產(chǎn)生自殺想法[1]。近年來，抑郁癥的發(fā)病率逐年上升，其發(fā)病機(jī)制尚不明確[2]。中醫(yī)主治抑郁癥多為疏肝理氣、解郁[3]。白芍為毛茛科植物，有養(yǎng)血斂陰、平抑肝陽、柔肝止痛的作用，現(xiàn)代藥理作用有抗炎、抗氧化、抗抑郁[4]等，在臨床常配伍使用。研究表明，白芍中的有效成分具有明顯的抗抑郁作用[5-12]，但其機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。多成分、多靶點(diǎn)、多通路是中醫(yī)藥治療疾病的特點(diǎn)，因此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接手段[13]，探討白芍治療抑郁癥可能的靶點(diǎn)和作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療抑郁癥的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 潛在活性成分及靶點(diǎn)篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)與分析平臺(tái)（TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）檢索“白芍”，得到白芍的化學(xué)成分，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件[3,14]，得到白芍主要化學(xué)成分及相關(guān)靶點(diǎn)，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（http//www.uniprot.org/）規(guī)范名稱。

1.2 抑郁癥靶點(diǎn)的獲取

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.disgenet.org/）檢索“depression”，物種設(shè)定為人類，得到抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 白芍靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)韋恩（Venn）分析

將白芍主要化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)與抑郁癥疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集進(jìn)行Venn 分析，得到白芍活性成分與抑郁癥的靶向關(guān)系。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)為“Homosapiens”，中等置信度（medium confidence）設(shè)為0.4，其余參數(shù)為默認(rèn)值，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，利用“Networkanalysis”功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩苑治?，根?jù)其節(jié)點(diǎn)度（degree）值明確靶點(diǎn)間作用關(guān)系。

1.5 生物過程注釋及代謝通路分析

通過R Studio 軟件進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（KEGG）和基因本體（GO）富集分析。GO富集分析描述了基因靶點(diǎn)的分子功能（MF）、細(xì)胞組成（CC）和參與的生物過程（BP），將MF、CC和BP均設(shè)Pvalue Cutoff為0.05；用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)富集靶點(diǎn)基因參與的主要代謝途徑，通路富集分析設(shè)定Pvalue Cutoff為0.05。

1.6 分子對(duì)接

在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載活性成分的3D 結(jié)構(gòu)；從RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到核心靶蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，去除水分子和配體小分子，分離出潛在蛋白的結(jié)構(gòu)。在Discovery Studio 2016軟件中采用LibDock 程序?qū)樱鶕?jù)化合物及蛋白質(zhì)分子設(shè)定對(duì)接空腔和大小，其余參數(shù)保持默認(rèn)值進(jìn)行分子對(duì)接。

2 結(jié)果與分析

2.1 有效成分的獲取與篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取白芍中85 個(gè)化學(xué)成分。根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18 篩選得到有效成分13 個(gè)，再根據(jù)抑郁癥的潛在靶點(diǎn)和白芍相關(guān)靶點(diǎn)的交集映射反推白芍可能具有治療作用的有效成分共8 個(gè)，化合物信息見表1。

表1 白芍治療抑郁癥的有效成分

2.2 疾病及藥物靶點(diǎn)篩選

通過GeneCards 和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)共9785個(gè)，與77個(gè)白芍潛在靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，通過Venny 2.1.0 映射最終得到交集靶點(diǎn)67個(gè)（圖1）。

圖1 白芍成分靶點(diǎn)及抑郁癥疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)建立

將67 個(gè)交集基因名導(dǎo)入SRTING 數(shù)據(jù)庫(kù)，下載TSV 文本導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），共67 個(gè)節(jié)點(diǎn)、422 條邊，蛋白激酶B1（Akt1）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）與其他靶點(diǎn)聯(lián)系最多，度值最高，處于核心地位，其次是絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、前列腺素G/H 合成酶2（PTGS2）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）和腫瘤壞死因子（TNF）等。

圖2 白芍治療抑郁癥關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析

GO 富集分析結(jié)果表明，白芍治療抑郁癥67 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)主要集中在BP 上，共2825 條富集結(jié)果，其中對(duì)脂多糖的反應(yīng)、細(xì)菌源分子的反應(yīng)和對(duì)抗生素的反應(yīng)參與的基因數(shù)目最多；CC 中有189 條富集結(jié)果，其中靶點(diǎn)參與最多的是膜筏、膜區(qū)和突觸后膜；MF 中有71 條富集結(jié)果，其中神經(jīng)遞質(zhì)受體所占比重較大，其與神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合并傳遞信號(hào)，改變細(xì)胞活動(dòng)；還涉及銨離子結(jié)合、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活動(dòng)和G 蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活動(dòng)等過程。推測(cè)白芍可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體以上多種生物過程而發(fā)揮抗抑郁作用。排名前10位的GO分析結(jié)果見圖3。

圖3 白芍治療抑郁癥活性靶點(diǎn)GO富集分析

對(duì)67 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，共得到209 條富集結(jié)果，篩選P<0.05，排名前20 的通路G為候選信號(hào)通路，主要涉及糖基化終末產(chǎn)物及其受體（AGE-RAGE）信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt信號(hào)通路等，推測(cè)白芍可能通過作用于多種疾病通路、信號(hào)通路發(fā)揮抗抑郁作用（圖4）。

圖4 白芍治療抑郁癥活性靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

2.5 藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 3.7.2 中的Merge 功能將藥物-成分、成分-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)合并，得到藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，見圖5。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)圖分析得知，通路AGE-RAGE 和神經(jīng)活性配體-受體相互作用與潛在靶點(diǎn)存在較多的連接（表2）。度值排名前5 位的化合物為山柰酚、β-谷甾醇、兒茶酚、芍藥苷和谷甾醇，分別能與44、30、6、3、2 個(gè)靶點(diǎn)蛋白發(fā)生作用。芍藥二酮、山柰酚、谷甾醇、β-谷甾醇、丁字香萜均作用于靶點(diǎn)PGR。

表2 白芍治療抑郁癥的代謝通路與靶點(diǎn)

圖5 白芍治療抑郁癥的藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對(duì)接分析

根據(jù)藥材-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)選取活性成分連接靶點(diǎn)數(shù)較多的成分，β-谷甾醇、丁子香萜、谷甾醇、芍藥二酮和山柰酚均作用于靶點(diǎn)PGR，利用Discovery Studio 2016 軟件進(jìn)行對(duì)接驗(yàn)證，見表3、圖6。丁字香萜能夠與PGR 中ALA211、PRO210、PHE241、TYR63等氨基酸殘基結(jié)合，產(chǎn)生氫鍵和共軛效應(yīng)，增加了結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，配體受體結(jié)合得分較高；β-谷甾醇能夠與LYS58、TYR63、PHE241 等位點(diǎn)結(jié)合形成大量的氫鍵，親和力較好；谷甾醇與TYR63、PRO235、TYR26等位點(diǎn)結(jié)合；芍藥二酮與PRO235、TYR27、TYR26等位點(diǎn)結(jié)合。表明各活性成分與靶點(diǎn)PGR 具有良好的親和力，這與藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果一致。

圖6 白芍中化合物與治療抑郁癥的潛在靶點(diǎn)分子對(duì)接

表3 白芍中化合物與治療抑郁癥的潛在靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選了白芍的8 個(gè)活性成分，預(yù)測(cè)67 個(gè)治療抑郁癥的潛在靶點(diǎn)。根據(jù)藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)度值排名推測(cè)化合物谷甾醇、山柰酚及靶點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子p65（RELA）、Akt1、TNF、MAPK8、半胱氨酸蛋白酶-3（CASP3）、JUN和IL-6 可能是白芍配伍治療抑郁癥的關(guān)鍵化合物和靶點(diǎn)；PPI 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果表明，IL-6 和Akt1與其他靶點(diǎn)的連接最多，IL-6 可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白，作用于B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、肝細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞[15]，主要功能是參與炎癥反應(yīng)及造血過程、刺激活化B 細(xì)胞增殖等[16]。研究證實(shí)，抑郁障礙患者前額皮質(zhì)區(qū)IL-6 mRNA 和蛋白表達(dá)水平升高[17]；Akt1 是一種下游酶，通過調(diào)節(jié)其下游效應(yīng)物糖原合成酶激酶-3（GSK-3）來促進(jìn)生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的細(xì)胞存活和阻止細(xì)胞凋亡死亡[18]，研究表明，Akt1 合成的GSK-3 具有抗抑郁作用[18-19]。GO 富集結(jié)果顯示，白芍發(fā)揮抗抑郁作用的生物過程為參與調(diào)節(jié)膜電位、銨離子、G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)途徑及調(diào)節(jié)胞漿鈣離子濃度等。KEGG 富集結(jié)果顯示，在AGE-RAGE 信號(hào)通路、PI3K-Akt和TNF 信號(hào)通路上集中著白芍抗抑郁較多的靶點(diǎn)。選取成分β-谷甾醇、丁子香萜、谷甾醇、芍藥二酮和山柰酚與靶點(diǎn)PGR分子對(duì)接，結(jié)果表明，PGR 與這些化合物有較好對(duì)接活性。

臨床研究表明，抗抑郁劑可通過上調(diào)5-羥色胺（5-HT）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）的水平以促進(jìn)海馬神經(jīng)元新生[20]，增加海馬齒狀回前體細(xì)胞數(shù)量來發(fā)揮抗抑郁作用[21]。白芍可使海馬組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素（NE）和5-HT 的水平明顯升高，并且使5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）的水平明顯降低，達(dá)到抗抑郁的作用[22]。β-谷甾醇能顯著增加腦內(nèi)5-HT、NE 和代謝產(chǎn)物5-HIAA 水平，有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、解熱、免疫調(diào)節(jié)、止痛的作用，且其與潛在靶點(diǎn)高度聯(lián)系[23]。β-谷甾醇的抗抑郁活性是由5-HT、NE 和代謝產(chǎn)物5-HIAA 等神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo)的[24]；山柰酚是一類黃酮醇類化合物，具有較強(qiáng)的抗炎、抗糖尿病、抗癌及神經(jīng)保護(hù)等作用，研究表明，其能通過抗炎、抗氧化及降低海馬神經(jīng)元的凋亡率來減輕抑郁癥模型大鼠海馬體的損傷。從靶點(diǎn)角度來看，RELA、Akt1、TNF、MAPK8、CASP3、JUN 度值連接次數(shù)均在15 次以上，推測(cè)其為抗抑郁治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。MAPK8參與細(xì)胞各種過程，如增殖、分化、遷移及程序性細(xì)胞死亡，且已被證實(shí)在行為、學(xué)習(xí)和記憶等方面起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[25]；Akt1 通過調(diào)節(jié)其下游效應(yīng)物糖原合成GSK-3達(dá)到抗抑郁的作用[18-19]。綜上，推測(cè)白芍通過多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮抗抑郁作用。

神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路能通過改進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的傳導(dǎo)功能發(fā)揮抗抑郁作用[26]，為質(zhì)膜上通路的受體及配體[27]；小鼠前額葉灰質(zhì)和海馬內(nèi)的基因表達(dá)差異主要集中在該通路上[28]。PI3K-Akt信號(hào)通路是BDNF/酪氨酸激酶受體B（TrkB）的下游信號(hào)通路，被認(rèn)為是治療抑郁癥的重要信號(hào)通路[29]，Akt 為重要樞紐，能夠促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）蛋白表達(dá)，使炎癥反應(yīng)失調(diào)而加重抑郁癥狀[30]；研究表明，抑郁與促炎細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）及抗炎因子（IL-2、IL-4）的免疫激活及分泌之間存在因果關(guān)系[31]；綜上，推測(cè)白芍通過多種疾病多條通路發(fā)揮抗抑郁作用。

本研究預(yù)測(cè)了白芍治療抑郁癥的可行性，進(jìn)一步明確了其多成分、多靶點(diǎn)、多途徑治療的特點(diǎn)，但關(guān)鍵生物過程和關(guān)鍵途徑的調(diào)控仍需深入研究，后續(xù)應(yīng)通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等驗(yàn)證，確保預(yù)測(cè)結(jié)果的科學(xué)性和正確性。