徐智瑋，宋霞，李永鵬，吳立斌，劉亞蓉，賈守寧*，李亞偉，李啟恩，武嘉庚

1.青海省中醫(yī)院，青海 西寧 810000；2.青海藥品檢驗(yàn)檢測院，青海 西寧 810016；3.青海大學(xué) 藏醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810016

紅景天為藏醫(yī)常用藥材，藏語為“索羅瑪布”，用于肺臟熱疾等證的治療。藏醫(yī)藥用紅景天最早記載于《四部醫(yī)典》[1]?！毒е楸静荨酚涊d：“紅景天活血清肺、止咳退燒、止痛，用于治療肺炎、氣管炎、身體虛弱、全身乏力、胸悶、難于透氣、嘴唇和手心發(fā)紫?！盵2]藏藥中紅景天基原較為混亂，《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版[3]收載品種為大花紅景天Rhodiola crenulata（HK.f.et Thoms.）H.Ohba；而《藏藥志》[4]和《青海省藏藥標(biāo)準(zhǔn)》[5]中記載當(dāng)?shù)亓?xí)用紅景天主要為2 種，分別為藏譯名“噶都爾曼巴”，即狹葉紅景天R.kirilowii(Regel)Maxim.；藏譯名“索羅瑪?！?，即唐古紅景天R.algida（Ledeb.）Fisch.et Mey.var.tangutica（Maxim.）S.H.Fu。筆者也從市場調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，主流品種以大花紅景天和其代用品小花紅景天為主。經(jīng)考證發(fā)現(xiàn)，小花紅景天基原主要以長鞭紅景天R.fastigiata（Hk.f.et Thoms.）S.H.Fu 為主；而小花紅景天藥材外觀與正品相似，占領(lǐng)了低價格紅景天市場[6]。目前，圍繞小花紅景天開展藥理實(shí)驗(yàn)的文獻(xiàn)資料很少，而且這類藏藥品種中“同名異物”“同物異名”的現(xiàn)象較多，也導(dǎo)致同屬不同品種植物中主要藥效成分存在差異，達(dá)不到穩(wěn)定的質(zhì)量和療效。昝珂等[7]研究表明，以山梔苷甲酯和8-O-乙酰山梔苷甲酯為指標(biāo)成分對獨(dú)一味藥材進(jìn)行質(zhì)量控制，不能達(dá)到區(qū)分市場上獨(dú)一味及其偽品的目的，尤其是對采用偽品投料生產(chǎn)的制劑更難以控制。俞森[8]研究認(rèn)為，不同品種大黃的高效液相色譜法（HPLC）得到的色譜圖存在較大差異。汪榮斌等[9]對甘肅不同產(chǎn)地5 個種的秦艽藥材進(jìn)行活性成分含量比較研究，發(fā)現(xiàn)同種秦艽中，栽培品的龍膽苦苷含量均高于野生品，并且在不同品種間也有較大差異。因此，有必要建立起紅景天藥材的特征圖譜，研究不同品種紅景天成分之間的差異。

本實(shí)驗(yàn)收集不同產(chǎn)地、不同品種正品（大花紅景天）、習(xí)用品（唐古紅景天、狹葉紅景天）和代用品（長鞭紅景天）共29 批，考察紅景天中2 個含量較高的有效成分紅景天苷和沒食子酸，并以其作為主要評判標(biāo)準(zhǔn)，建立紅景天特征圖譜，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法進(jìn)行深入研究，以期為紅景天藥材質(zhì)量綜合評價和利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

美國Waters（ACQUITY-UPLC）超高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器；ACE Excei 2 C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2 μm）；AE200 型電子天平、XS105DU型分析天平（梅特勒-托利多公司）。

1.2 試劑

對照品沒食子酸（批號110831-201805，純度：91.5%）、紅景天苷（批號110818-201804，純度：98.8%）購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純）、無水甲醇（色譜純）均購于Merck 公司；磷酸（分析純，西隴化工股份有限公司）；超純水（Millipore公司）。

1.3 藥材

大花紅景天Rhodiola crenulata（HK.f.et Thoms.）H.Ohba、狹葉紅景天R.kirilowii（Regel）Maxim.、唐古紅景天R.algida（Ledeb.）Fisch.et Mey.var.tangutica（Maxim.）S.H.Fu、長鞭紅景天R.astigiata（HK.f.et Thoms.）S.H.Fu 藥材經(jīng)青海省中醫(yī)院中藥基礎(chǔ)研究所趙國福主任中藥師鑒定其基原準(zhǔn)確。具體樣品信息見表1。

表1 紅景天藥材來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為ACE Excei 2 C18（100 mm×2.1 mm，2 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1% 磷酸水溶液（B），梯 度洗 脫（0～15 min，4%A；15～20 min，4%～10%A；20～25 min，10%～15%A；25～30 min，15%～20%A；30～35 min，20%～22%A；35～40 min，22%～15%A；40～45 min，15%～10%A；45～50 min，10%～4%A）；體積流量為0.4 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為275 nm；進(jìn)樣量為5 μL。

2.2 對照品溶液制備

分別精密稱取干燥至恒重的對照品沒食子酸3.55 mg、紅景天苷2.05 mg，分別置于25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，作為對照品儲備溶液，使用時各精密量取1 mL 混合，即得沒食子酸質(zhì)量濃度為0.142 mg·mL-1、紅景天苷質(zhì)量濃度為0.082 mg·mL-1的對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取樣品粉末約1 g，精密稱定，置于100 mL 錐形瓶中，加50%甲醇100 mL，25 ℃超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理1 h，靜置至室溫，濾過，濾液先過0.45 μm 微孔濾膜，再過0.25 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 系統(tǒng)適用性考察 取供試品溶液（樣品5），在2.1 項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析，在此條件下各組分得到良好分離。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密稱取同一供試品（樣品5）1 g，按2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以紅景天苷為參照峰，計(jì)算特征峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD，結(jié)果各特征峰的相對保留時間<1%，單峰面積占總峰面積>2%的特征峰的相對峰面積<2%，采用Chem Pattern 2017 軟件進(jìn)行相似度分析評價，相似度為0.99，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一供試品（樣品5）1 g，按2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣5 μL，以紅景天苷為參照峰，計(jì)算特征峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD，結(jié)果各特征峰的相對保留時間<1%，單峰面積占總峰面積>2%的特征峰的相對峰面積<2%，采用Chem Pattern 2017軟件進(jìn)行評價，相似度為0.99，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品（樣品5）1 g，按2.3 項(xiàng)下方法各制備6 批供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以紅景天苷為參照峰，計(jì)算特征峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD，結(jié)果各特征峰的相對保留時間<1%，單峰面積占總峰面積>2%的特征峰相對峰面積<4%，采用Chem Pattern 2017 軟件進(jìn)行評價，相似度為0.99，表明該方法重復(fù)性較好。

2.5 紅景天正品特征圖譜的建立

取不同批次紅景天正品（樣品1～7）粉末1 g，精密稱定，按2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣量為5 μL，分別記錄UPLC 圖（圖1）。樣品8、9 未知粉末各1 g 同法制備后進(jìn)樣，用于化學(xué)計(jì)量學(xué)分析。

圖1 7批紅景天正品UPLC圖

2.6 特征峰的標(biāo)定及相似度計(jì)算

采用Chem Pattern 2017軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，設(shè)定樣品1 為參照圖譜，將其他樣品的色譜峰與參照圖譜進(jìn)行自動匹配，生成紅景天正品的共有模式特征圖譜（圖2）。在共有模式特征圖譜上標(biāo)定12個特征峰，經(jīng)過與對照品比對并結(jié)合光電二極管陣列（PDA）光譜，可知1 號峰為沒食子酸，3 號峰為紅景天苷。并計(jì)算樣品1～7 與特征圖譜的相似度，分別 為0.80、0.91、0.96、0.98、0.90、0.83、0.98，各批次的紅景天正品之間相似度均大于0.8，說明正品紅景天特征圖譜相似度良好。

圖2 紅景天正品的共有模式特征圖譜

2.7 紅景天正品與習(xí)用品、代用品特征圖譜比較

取不同批次紅景天習(xí)用品、代用品粉末各1 g，精密稱定，按2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣量為5 μL，分別記錄UPLC 圖（圖3）。根據(jù)結(jié)果，采用Chem Pattern 2017 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算紅景天正品與習(xí)用品、代用品特征圖譜相似度（表2），其中習(xí)用品狹葉紅景天各批次的相似度平均值>0.80，唐古紅景天各批次的相似度平均值>0.71；代用品長鞭紅景天各批次的相似度平均值>0.77。

圖3 紅景天習(xí)用品、代用品UPLC圖

表2 紅景天正品、習(xí)用品及代用品相似度

2.8 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.8.1 聚類分析 采用多元統(tǒng)計(jì)分析中的聚類分析法對29 批紅景天藥材進(jìn)行相似度分析，聚類分析參數(shù)選取歐氏距離和誤差平方和法，各樣本間距離的計(jì)算方法為夾角余弦，得出紅景天聚類分析圖（圖4），由圖4可知，1～8批樣品相似度高，可以聚為大花紅景天類，即8 號待測紅景天為大花紅景天；9～16 批樣品可以聚為一類，為狹葉紅景天類，即9 號待測紅景天為狹葉紅景天；17～23 批樣品可以聚為一類，為唐古紅景天；25～29 批樣品可以聚為一類，為長鞭紅景天。前3 種可聚為一大類，剩余長鞭紅景天可以單獨(dú)聚為一類。

圖4 紅景天藥材聚類分析

2.8.2 主成分分析（PCA）采用Chem Pattern 2017 軟件，以紅景天正品共有模式特征圖譜為參照模板，系統(tǒng)中添加其他品種紅景天，最終生成4 種紅景天共有模式特征圖譜，見圖5。將4種紅景天共有模式特征圖譜中的17 個特征峰峰面積作為輸入變量用于PCA，結(jié)果見圖6。由圖6 可知，PC1 顯示長鞭紅景天和狹葉紅景天樣品為正值，載荷得分較高的為2號峰沒食子酸；PC2顯示大花紅景天、部分批次唐古紅景天為正值，部分唐古紅景天為負(fù)值，載荷得分較高的為1 號峰紅景天苷、7 號峰和13 號峰；PC3 顯示狹葉紅景天正值，載荷得分較高的為4 號峰。由此可以得知，1 號峰沒食子酸、3 號峰紅景天苷、4號未知峰、7號未知峰和13號未知峰是區(qū)分紅景天品種的主要成分。13 號未知峰可以作為識別大花紅景天的特征峰；7 號未知峰可作為識別唐古紅景天的特征峰；4 號峰可以作為狹葉紅景天鑒別的特征峰。不同批次的長鞭紅景天中化學(xué)成分差異大于其他3種紅景天。

圖5 4種紅景天藥材共有模式特征圖譜

圖6 4種紅景天藥材共有模式下PCA

3 討論與結(jié)論

3.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

3.1.1 提取溶劑篩選 考察了蒸餾水、乙醇、甲醇作為溶劑提取紅景天中的化合物，自然生長的紅景天含有大量多糖物質(zhì)，用水和乙醇作溶劑提取產(chǎn)物比較黏稠，不宜過分子膜，且進(jìn)樣后各峰之間分離度不好，雜峰較多。相比之下，甲醇的極性比乙醇大，甲醇提取物的溶解度要相對大一些，故選擇甲醇作為紅景天藥材制備的溶劑。并在同一條件下考察30%、50%、70%甲醇及無水甲醇的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品在50%甲醇溶劑條件下出峰較多，且峰形較好。最終確定以50%甲醇為溶劑制備紅景天藥材樣品溶液。

3.1.2 制備方法與優(yōu)化 考察了超聲提取法和加熱回流法的提取工藝，發(fā)現(xiàn)加熱回流法提取費(fèi)時費(fèi)力，提取的有效成分含量比超聲提取法低。隨后對超聲條件進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)室溫25 ℃下超聲1 h效果好。

3.1.3 色譜條件的篩選與優(yōu)化 考察了不同的流動相系統(tǒng)，如乙腈-水及《中國藥典》2020年版規(guī)定的紅景天中紅景天苷檢測流動相甲醇-水，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-水系統(tǒng)梯度洗脫效果好。紅景天的主要有效成分紅景天苷和沒食子酸均為酚類化合物，顯酸性，故在流動相中加入一定量的酸以抑制酚羥基離子化，分離效果明顯提高。在酸種類的選擇上，比較了甲酸、磷酸和冰醋酸溶液，分離效果為甲酸>磷酸>冰醋酸；但是甲酸為有機(jī)酸，酸性明顯強(qiáng)于磷酸，使用時間長容易腐蝕色譜柱，故選擇流動相為乙腈-磷酸水溶液。同時也考察了在超純水中加入不同體積分?jǐn)?shù)（0.05%、0.10%、0.20%）的磷酸、不同柱溫（30、35、40 ℃）及不同流速（0.3、0.4、0.5 mL·min-1）。結(jié)果表明，流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液、流速為0.4 mL·min-1，柱溫為30 ℃時對紅景天藥材進(jìn)行梯度洗脫，基線平穩(wěn)，各化合物之間分離度高且峰形較好，方法簡單，便于操作和控制成本。同時采用PDA 檢測器考察所需物質(zhì)紫外吸收，沒食子酸最大吸收波長在270 nm，紅景天苷最大吸收波長在275 nm，考慮各峰在275 nm 有較強(qiáng)的吸收，并參考《中國藥典》2020年版，選擇275 nm為檢測波長。

3.2 特征圖譜

7批紅景天正品UPLC 圖譜與紅景天正品的共有模式特征圖譜之間相似度>0.8，相似度良好，說明不同批次正品紅景天成分組成類似。而其他20 批紅景天習(xí)用品、代用品與正品共有模式特征圖譜之間相似度均大于0.7，說明紅景天正品與習(xí)用品、代用品成分之間存在一定的差異。

3.3 聚類分析

聚類分析結(jié)果表明，不同品種的紅景天之間存在差異，不同品種的樣品能夠顯著分開。唐古紅景天與狹葉紅景天距離較近，說明兩者化學(xué)成分組成相似。而長鞭紅景天與其他3 種紅景天距離較遠(yuǎn)，說明長鞭紅景天的化學(xué)成分組成與其他3 種紅景天差異較大。

3.4 PCA

PCA 結(jié)果表明，不同品種之間成分存在一定的差異性，每個品種有特定的特征峰；長鞭紅景天成分相比其他品種差異性最大。

3.5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)收集了不同品種、不同產(chǎn)地的藥用紅景天樣品，在同一色譜條件下建立藥材的特征圖譜，并用化學(xué)計(jì)量分析法對大花紅景天（正品）、唐古紅景天和狹葉紅景天（習(xí)用品）及長鞭紅景天（代用品）的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析和PCA，研究了不同紅景天的特有成分和共有成分，結(jié)果表明，不同批次的大花紅景天特征圖譜相似度高，紅景天習(xí)用品、代用品特征圖譜相似度較低，成分有一定差異。本實(shí)驗(yàn)建立的UPLC 特征圖譜方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高；聚類分析可區(qū)分4 種紅景天藥材；PCA 較好地展示了不同品種成分的差異性，為紅景天藥材及其飲片或中成藥投料的鑒定、質(zhì)量評價提供了參考。