呂素芳 ，胡莉萍 ，董炳梅 ，任洪林，莫 玲，李 峰*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州256600；2.山東省動物疫病預防與控制中心，山東 濟南250022；3.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州256600；4.吉林大學 人獸共患病研究所，吉林 長春130062)

布魯氏菌病(brucellosis)又稱地中海弛張熱、馬耳他熱，是由布魯氏菌(Brucellasp.)引起的一種以流產和發(fā)熱為特征的人畜共患性傳染病，主要宿主有豬、牛、羊、狗等動物和人，傳播途徑主要是經消化道、呼吸道和皮膚粘膜傳染。人可通過直接接觸患病動物、從事畜產品加工或食用感染食物等途徑感染，嚴重威脅著人和動物的生命健康。布魯氏菌病呈世界范圍性流行，可致多種家畜感染，繼而引發(fā)流產、不育以及人的波浪熱，對全球畜牧業(yè)造成嚴重的經濟損失，已成為潛在危害人類健康和公共衛(wèi)生的重要病原之一[1-2]。中國將該病列為二類動物疫病，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類流行病。中國流行的主要是羊(Br.melitensis)、牛(Br.bovis)、豬(Br.suis)3種布魯氏菌，其中以羊布魯氏菌病最為多見，其次是牛種布魯氏菌。近幾年來隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，布魯氏菌病在多數疫區(qū)有明顯回升的趨勢。由于該病的治療非常困難，對臨床檢測陽性的動物多采取淘汰處理，因此日常的防控與監(jiān)測工作尤為重要。

布魯氏菌細胞膜是3層膜結構，由內到外依次為細胞質膜、外周胞質膜和外膜，細胞膜中含有多種外膜蛋白(OMPs)。目前，國內外科研人員已經發(fā)現了許多針對布魯氏菌的免疫原性蛋白，可用作診斷和亞單位疫苗制備候選蛋白。其中外膜蛋白已經證明在實驗室條件下具有良好的免疫活性和保護作用，如OMP10、OMP16、OMP25、OMP31、OMP2b、OMP28(BP26)和L7/L12[3-4]。OMP28又稱 BP26，存在于所有布魯氏菌菌株中，能引起保護性免疫反應，且在羊、牛、狗和人中均具有很高的免疫原性，可作為未來亞單位疫苗的候選蛋白之一[5-6]。ElTahir等[7]通過抗BP26小鼠血清的研究，鑒定出BP26蛋白具有5個線性表位，其中C末端的肽結合最強。本研究以克隆、原核表達獲得的OMP28(BP26)蛋白為抗原，建立了針對BP26抗體的iELISA檢測方法，并在牛和羊血清樣品中初步應用，以期提高血清抗體檢測的準確率。

1 材料及方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 感受態(tài)細胞DH5α、BL21(DE3)表達菌、原核表達載體pET-28a由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院重點實驗室自制保存，豬種布魯氏菌S2株(Brucellasuis)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.2 主要試劑NdeⅠ、EcoRⅠ、pMD18-T載體、2×rTaq Mix、T4 Ligation kit、DL2000 Marker購自大連寶日醫(yī)生物技術有限公司；細菌基因組提取試劑盒和預染蛋白Marker 26616購自Fermentas,30%丙烯酰胺、過硫酸銨(APS)、SDS、TEMED、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、考馬斯亮藍快速染色液、乳清蛋白、豬血清、Triton-100、蛋白酶抑制劑等購自山東思科捷科學儀器有限公司；瓊脂糖、Tween-20、IPTG等購自Sigma公司；His-鎳離子親和層析柱購自GE生命科學；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和TMB購自北京天根生化科技有限公司；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；HRP標記兔抗反芻動物二抗購自河南洛陽佰奧通實驗材料中心；羊和牛布魯氏菌病標準陽性與陰性血清、布魯氏菌虎紅平板凝集抗原購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；其他試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因設計 根據GenBank網站公布布魯氏菌BP26蛋白的基因序列進行信號肽和抗原表位預測分析，去掉BP26蛋白基因前端信號肽序列，保留抗原表位序列，擴增約680 bp目的基因片段。上下游分別引入NdeI、EcoRI酶切位點，插入pET28a原核表達載體。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。BP26蛋白基因的上下游引物序列如下(劃線部分為引入雙酶切位點)：

BP26-1：5＇-CATATGGAGAATCAGATGAC GACGCAGC-3＇

BP26-2：5＇-GAATTCTTACTTGATTTCAAA AACGA-3＇

1.2.2 目的基因擴增 將布魯氏菌S2菌株80 ℃水浴30 min以上進行滅活，應用細菌基因組提取試劑盒提取其基因組作為PCR擴增模板。PCR反應體系為：2×rTaq mix 25 μL，上下游引物各1.0 μL(濃度均為10 mmol/L)，模板DNA 10 μL，ddH2O 補足至50 μL。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min終止反應。瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段為680 bp。

1.2.3 重組原核表達載體構建 將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠回收，用NdeⅠ與EcoRⅠ分別對目的基因和pET-28a質粒進行雙酶切并回收純化，并將目的基因克隆至pET-28a載體上，經雙酶切鑒定后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序鑒定。經鑒定構建成功的重組原核表達載體命名為pET28a-BP26。

1.2.4 重組原核表達載體的誘導表達及條件優(yōu)化 取構建成功的原核表達載體，轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，涂布在含有卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h。獲得的菌液經測序鑒定為陽性后，作為原始母液進行誘導表達。母液按照1∶50比例接種新鮮含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基，37 ℃震蕩誘導培養(yǎng)2～3 h。按0.5、1和1.5 mmol/L比例分別加入IPTG誘導劑，在2、4、6、8 h分別取樣，誘導溫度為25 ℃和37 ℃，進行最佳表達條件摸索。

1.2.5 BP26蛋白的可溶性分析及純化鑒定 利用摸索好的條件，對蛋白進行擴大培養(yǎng)、誘導表達。對培養(yǎng)物進行處理后超聲波破碎裂解，進行SDS-PAGE電泳，分析其可溶性。沉淀用1/10體積的8 mol/L尿素溶解，保存待純化。

含有蛋白溶液的菌體破碎液利用AKATA蛋白純化系統，經過His-鎳離子親和層析純化柱(5 mL×3)進行親和層析純化，所有緩存溶液均含8 mol/L尿素并進行0.22 μm孔徑的濾膜抽濾排氣除雜。具體純化步驟參照說明書。洗雜和洗脫步驟中分別收集峰值處流出的液體，進行SDS-PAGE檢測。對親和層析后的蛋白溶液進行透析除尿素。取透析后的蛋白液進行SDS-PAGE檢測及含量測定。

1.2.6 BP26蛋白Western blot分析 應用羊和牛布魯氏菌病標準陽性血清為抗體，BP26純化蛋白經SDS-PAGE后轉移至硝酸纖維素膜上，分別進行Western blot，確定純化蛋白的抗原性和特異性，將純化并鑒定正確的BP26蛋白分別凍干保存。

1.2.7 BP26抗體iELISA檢測方法建立與優(yōu)化

1.2.7.1 BP26蛋白抗原與血清最佳稀釋度的確定 采用方陣法，利用純化后的BP26蛋白作為包被抗原，設置1:25、1：50、1：100、1：200、1：400幾個稀釋度，分別用包被緩沖液稀釋后包被ELISA板，每孔100 μL，選擇3個包被條件(4 ℃過夜、37 ℃ 1 h和37 ℃ 2 h)進行優(yōu)化；羊和牛布魯氏菌病標準陽性血清和陰性血清分別按照1:25、1：50、1：100、1：200、1：400幾個稀釋度，每孔100 μL,37 ℃孵育1 h。其余步驟采用常規(guī)方法，測定OD450值，計算相應陽性血清孔OD450值與陰性血清孔OD450值的比值，即P/N值。選取P/N值最大孔所對應的抗原包被濃度和陰、陽性血清稀釋倍數為最佳條件，最終確定抗原與血清最佳稀釋度。

1.2.7.2 封閉條件的確定 封閉液分別選擇乳清蛋白和豬血清，封閉條件為4 ℃過夜、37 ℃ 1 h和37 ℃ 2 h進行篩選，用陰、陽性血清檢測OD450值，選取P/N值最大孔所對應的一組條件為最佳封閉條件。

1.2.7.3 二抗稀釋度與TMB底物作用條件的確定 酶標二抗稀釋度分別選擇1/2000，1/4000和1/8000，其他條件選擇優(yōu)化后的最佳條件進行，選取P/N值最大孔所對應的一組條件為最佳二抗稀釋度。底物顯色條件分別選擇室溫15 min，37 ℃ 15 min 和室溫30 min進行優(yōu)化，其他條件選擇優(yōu)化后的最佳條件進行，選取P/N值最大孔所對應的一組條件為最佳底物作用條件。

1.2.7.4 陰陽性臨界值的確定 選取經虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗檢測均陰性的羊布魯氏菌抗體陰性血清樣品110份和牛布魯氏菌抗體陰性血清樣品180份，按照上述優(yōu)化后的ELISA檢測條件進行檢測，最終確定臨界值。臨界值=3×標準差+陰性血清OD450均值。

1.2.7.5 iELISA特異性試驗 應用建立的羊布魯氏菌病血清抗體iELISA檢測方法，分別對耶爾森菌、大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、羊布魯氏菌病陽性血清和牛布魯氏菌病陽性血清進行檢測，確定其特異性。

1.2.7.6 與虎紅平板凝集試驗符合率分析 應用布魯氏菌虎紅平板凝集試驗檢測采集自山東省不同地區(qū)的規(guī)模羊場的413份血清樣品和規(guī)模化牛場的186份血清樣品。413份羊血清樣品中陽性血清28份，陰性血清385份；186份牛血清樣品中陽性血清29份，陰性血清157份。應用本研究建立的BP26抗體iELISA檢測方法進行檢測，計算兩者的符合率。

2 結果與分析

2.1 目的基因擴增

利用設計的一對引物進行PCR擴增，電泳檢測成功獲得了約680 bp大小的目的基因片段(圖1)。

圖1 目的基因PCR擴增M. Marker DL2000；1. BP26基因Fig.1 PRC exemplification of target geneM. Marker DL2000；1. BP26 gene

2.2 重組原核表達載體的構建

將構建的原核表達載體pET28a-BP26進行NdeⅠ與EcoRⅠ雙酶切鑒定，可見約680 bp與5.4 kb大小的DNA片段和載體片段，與預期結果一致(圖2)。測序結果經Blast分析，與GenBank公布的目的基因序列100%相同。說明重組原核表達載體pET28a-BP26構建成功。

圖2 重組原核表達載體雙酶切鑒定1. pET28a-BP26載體雙酶切結果；M. Marker DL2000Fig. 2 Double enzyme digestion identification ofrecombinant prokaryotic expression vector 1. Double enzyme digestion identification of pET28a-BP26vector；M. Marker DL2000

2.3 目的蛋白的表達與可溶性分析

在BL21(DE3)表達菌中將重組原核表達載體pET28a-BP26進行誘導表達，經SDS-PAGE顯示，在約28 kU位置出現目的蛋白條帶(圖3)，與預期大小一致，而對照組沒有出現相應目的條帶。說明重組原核表達載體誘導表達成功。表達后菌液破碎處理后取上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測，結果表明BP26蛋白是以包涵體形式大量存在于沉淀中(圖4)。優(yōu)化后的蛋白最佳表達條件為：加入IPTG誘導劑濃度為1 mmol/L，37 ℃震蕩培養(yǎng)，誘導表達4 h后收集菌液即可。

圖3 重組載體pET28a-BP26表達的SDS-PAGE1，4. 菌液誘導表達后；2，3. 菌液誘導表達前；M. 蛋白Marker 26616Fig. 3 SDS-PAGE of recombinant vector pET28a-BP261，4. after induction of bacterial expression；2，3. beforeinduction of bacterial expression；M. protein Marker 26616

圖4 目的蛋白可溶性分析1. 超聲波破碎后上清；2. 超聲波破碎后沉淀；M. 蛋白MarkerFig. 4 Target protein solubility analysis1. Supernatant after sonication；2. Precipitation afterultrasonic breaking；M. protein Marker

2.4 目的蛋白的純化與Western blot分析

采用His-鎳柱親和層析法對目的蛋白進行純化，經SDS-PAGE電泳獲得1條28 kU大小的目的條帶，表明BP26蛋白純化成功(圖5)。經測定，純化后的BP26蛋白為680 μg/mL。將純化的BP26蛋白分別與牛和羊標準陽性血清進行Western blot分析，均檢測出了同樣大小的條帶，與SDS-PAGE檢測到的條帶相符。結果表明，BP26蛋白能與牛和羊的布魯氏菌陽性血清發(fā)生反應，具有良好的免疫學活性，可作為牛羊血清抗體檢測的通用抗原(圖6)。

圖5 BP26蛋白純化M. 蛋白Marker 26616；1. BP26蛋白柱純化后 Fig. 5 BP26 protein purificationM. protein Marker 26616；1. BP26 proteincolumn after purified

圖6 BP26蛋白Western blotM. 蛋白Marker 26616；1. 空白對照；2. 羊陽性血清；3. 牛陽性血清Fig.6 BP26 protein Western blotM. protein Marker 26616； 1. blank control；2. positive serum of sheep； 3. positive serum of cattle

2.5 BP26抗體iELISA檢測方法的建立

2.5.1 iELISA檢測方法條件優(yōu)化 通過方陣試驗，確定了BP26蛋白抗原對牛和羊血清的最佳包被濃度均為13.6 μg/mL，即1：50倍稀釋度。血清抗體最佳稀釋度為1：100。經過對其他條件篩選，發(fā)現牛羊用布魯氏菌病血清抗體iELISA檢測方法最佳條件是：1.5%豬血清封閉，37 ℃1 h，二抗稀釋度為1：2000，37 ℃顯色15 min。

2.5.3 iELISA檢測方法的特異性試驗 應用以上建立的iELISA檢測方法分別對耶爾森菌、大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、牛布魯氏菌和羊布魯氏菌的陽性血清進行檢測。結果顯示，牛布魯氏菌陽性血清的OD450為0.384，羊布魯氏菌陽性血清的OD450為0.647，均為陽性。而其他菌的陽性血清均為陰性。說明該iELISA方法具有較好的特異性。

2.5.4 與布魯氏菌虎紅平板凝集試驗對比性試驗 對采集自山東省不同地區(qū)的規(guī)模羊場的413份血清樣品和規(guī)模化牛場的186份血清樣品應用布魯氏菌虎紅平板凝集試驗和iELISA檢測，結果見表1。本研究建立的iELISA檢測方法相對于傳統的虎紅平板凝集試驗，羊血清和牛血清符合率都在90%以上，特異性高。

表1 羊、牛布魯氏菌病BP26抗體iELISA與虎紅平板凝集試驗對比Table 1 Comparison of iELISA detection method for sheep and cattle brucellosis BP26 antibody and tiger red plate agglutination test

3 討 論

布魯氏菌病是一種全球性疾病，流行于全球170個國家和地區(qū)，據統計每年約50×104人新感染。人感染后治療周期長，療效不理想，該病是嚴重危害人類健康的疫病之一。由于人類主要是經患病動物或受污染的畜產品感染，所以如何控制并凈化家畜的布魯氏菌病成為畜牧業(yè)生產急需解決的問題。中國2012年發(fā)布《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012—2020年)》[8]，2014年發(fā)布《牛羊常見疫病防控技術指導意見》[9]，均將布魯氏菌病列為主要防控對象。

目前布魯氏菌病的實驗室檢測方法主要包括病原學和血清免疫學，其中病原學方面包括各類PCR方法、單核苷酸多態(tài)性檢測、脈沖場凝膠電泳技術、熒光偏振試驗等，免疫學方法包括虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗、補體結合試驗、變態(tài)反應、ELISA檢測方法等[10-11]。病原學方法由于細菌培養(yǎng)比較復雜、時間比較長，使用最先進的自動血液培養(yǎng)系統培養(yǎng)布魯氏菌仍需5～7 d[12]，而且對實驗室生物安全級別要求較高，不適合臨床大規(guī)模操作,目前臨床檢測仍以血清學為主。ELISA方法具有敏感性和特異性強、操作簡單快速、重復性好等特點，可同時完成大量樣品的檢測，是當前動物流行病學調查和臨床免疫監(jiān)測廣泛采用的血清學診斷技術[13]。Zhang等[14]通過收集不同國家和地區(qū)有關布魯氏菌病控制或根除計劃的資料，發(fā)現無論是單獨還是聯合，疫苗接種、檢測和屠宰計劃都能有效降低布魯氏菌病的流行率。本研究克隆、表達、純化了布魯氏菌外膜蛋白BP26，并作為包被抗原建立優(yōu)化了布魯氏菌抗體iELISA檢測方法，對臨床采集的牛和羊血清樣品進行了初步應用。結果表明，建立的iELISA檢測方法具有良好的特異性和敏感性，與虎紅平板凝集試驗結果相比，敏感性85%以上，特異性95%以上，符合率90%以上，與Chaudhuri等[15]的研究結果一致，且可同時進行大量樣品操作，適用于臨床對牛羊布魯氏菌病抗體進行大規(guī)模初篩。

造成敏感性差異較大的原因主要是診斷原理不同，虎紅平板凝集試驗檢測布魯氏菌全菌的凝集反應抗體水平，ELISA檢測布魯氏菌部分抗原的抗體反應水平。經組裝成牛羊用布魯氏菌病抗體iELISA檢測試劑盒，先后對采自山東濱城區(qū)、惠民縣、經濟技術開發(fā)區(qū)、博興縣等地區(qū)的近30家近500份牛/羊血清進行了初步檢測，大體摸清了周邊地區(qū)多個規(guī)模化牛羊場布魯氏菌病血清學抗體水平情況，為開展區(qū)域布魯氏菌病基線調查發(fā)揮了重要作用。

4 結 論

本研究建立的iELISA檢測方法具有良好的特異性和敏感性，與虎紅平板凝集試驗結果相比，敏感性85%以上，特異性95%以上，符合率90%以上，適用于臨床對牛羊布魯氏菌病抗體進行大規(guī)模初篩，為布魯氏菌病抗體監(jiān)測及凈化提供技術支持。