宋予震，史洪濤，范明夏，盧建洲，邊傳周，喬宏興

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院 動物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

中藥作為飼料添加劑在畜牧業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛，但因細胞壁的阻礙導(dǎo)致部分有效成分不能被動物吸收利用。黑曲霉(Aspergillusniger)是一種產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶等酶的真菌，纖維素酶能夠分解植物細胞壁，充分釋放營養(yǎng)物質(zhì)，促進動物消化吸收[1]。張帥等[2]將16 g橘皮添加到黑曲霉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量15%，發(fā)酵時間60 h，纖維素酶活力達1 816 U/g；胡偉等[3]采用正交試驗研究黑曲霉固體發(fā)酵三七殘渣產(chǎn)淀粉酶，結(jié)果顯示淀粉酶活力約為84 U/g。利用黑曲霉對中藥進行發(fā)酵能夠提高中藥藥效，改善動物腸道健康，從而提高生產(chǎn)性能。Sun等[4]研究證明，用黑曲霉發(fā)酵銀杏葉可改善蛋雞的生長性能、蛋品質(zhì)、脂質(zhì)代謝和免疫力。黑曲霉在固體發(fā)酵研究中也存在一些問題，如理論研究上缺乏動力學(xué)支持導(dǎo)致生產(chǎn)上停留在經(jīng)驗化生產(chǎn)水平。此外，黑曲霉為需氧型真菌，在固體發(fā)酵過程中存在參數(shù)不易檢測、無菌操作難以實現(xiàn)、過程不易控制、勞動強度大等問題。本研究通過對黑曲霉固體發(fā)酵黃芪產(chǎn)酶特性進行條件優(yōu)化，并研究其在蛋雞上的應(yīng)用情況，旨在為新型酶制劑的開發(fā)提供數(shù)據(jù)參考，同時為黃芪的綜合利用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃芪飲片購于河南省禹州市中藥材專業(yè)市場；黑曲霉菌(保藏編號3.316)購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 黑曲霉固體發(fā)酵黃芪條件優(yōu)化

1.2.1 菌種活化及麩曲種子制備 用接種環(huán)挑取黑曲霉菌種，接種到PDA斜面培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g, 蒸餾水1 000 mL)上，于28 ℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d。待孢子長滿后，采用同樣的方法將活化后的黑曲霉孢子接入麩曲培養(yǎng)基(市售麩皮:蒸餾水=2:1，拌勻后高壓滅菌備用)，于28 ℃培養(yǎng)8～10 d，麩曲菌種接種前將黑曲霉孢子用無菌水稀釋成1×108cfu/mL的孢子懸液備用。

1.2.2 黑曲霉發(fā)酵黃芪培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.2.2.1 接種量 以0.1%、0.5%、1%、3%、5%(W/W)的麩曲菌種接種量分別接種于含水量為35%(V/W)已滅菌的黃芪固體粉末中，28 ℃培養(yǎng)9 d。

1.2.2.2 時間 以1%(W/W)的麩曲菌種接種量接種于含水量為35%(V/W)已滅菌的黃芪固體粉末中，28 ℃分別培養(yǎng)0、3、6、9、12 d。

1.2.2.3 含水量 制備含水量為25%、30%、35%、40%、45%、50%(V/W)的黃芪固體粉末。以1%(W/W)的麩曲菌種接種量接種于已滅菌的不同含水量的黃芪固體粉末中，28 ℃培養(yǎng)9 d。

1.2.2.4 溫度 以1%(W/W)的麩曲菌種接種量接種于含水量為35%(V/W)已滅菌的黃芪固體粉末中，20、24、28、32、37 ℃分別培養(yǎng)9 d。

1.2.2.5 正交試驗優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗結(jié)果及正交試驗設(shè)計原則，選取溫度(A)、接種量(B)、含水量(C)3個因素，通過3因素3水平(L9(34))進行正交試驗，見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factor level

1.2.3 發(fā)酵過程 將黃芪粉培養(yǎng)基置于1 000 mL三角瓶中，瓶口覆蓋過濾透氣封口膜，高壓滅菌后在無菌操作臺中進行接種，然后置于霉菌培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每天晃動培養(yǎng)基防止結(jié)塊。

1.3 酶活力及黃芪多糖檢測方法

1.3.1 黃芪固體發(fā)酵物纖維素酶活力測定 采用羧甲基纖維素酶法測定纖維素酶活力[5]，在一定條件下，將1 g固體樣品每分鐘催化纖維素水解生成葡萄糖的微克數(shù)定義為1個酶活力單位，以固體樣品所含的酶活力單位(U/g)表示。

1.3.2 黃芪固體發(fā)酵物淀粉酶活力測定 淀粉酶活力測定參考食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.3.3 黃芪固體發(fā)酵物黃芪多糖提取測定 多糖含量的測定用苯酚硫酸法[7]。

1.4 動物試驗及試驗日糧

試驗采用單因子試驗設(shè)計，選擇280日齡海蘭褐蛋雞72只，由河南炎黃生物工程有限公司提供，隨機分為4組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)6只雞，預(yù)飼期3 d，試驗期28 d。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，黃芪組在對照組基礎(chǔ)上添加0.2%的黃芪，黑曲霉組在對照組基礎(chǔ)上添加0.2%的黑曲霉，發(fā)酵黃芪組在對照組基礎(chǔ)上添加0.2%的黑曲霉發(fā)酵黃芪，發(fā)酵制劑于37 ℃干燥箱內(nèi)烘干至恒重后添加到蛋雞日糧中，孢子數(shù)≥1×108cfu/g，添加量以日糧的質(zhì)量百分比計算?；A(chǔ)日糧參考NRC (1994)[8]蛋禽營養(yǎng)需要量配制, 詳細配方組成和營養(yǎng)水平見表2。

表2 基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)成分Table 2 Basic diet composition and nutritional composition

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1 生產(chǎn)性能測定 試驗期間，每天以重復(fù)為單位記錄產(chǎn)蛋數(shù)(截止每天21:00)、總蛋重，計算1～14 d、15～28 d的產(chǎn)蛋率和料蛋比。

1.5.2 血清抗氧化指標(biāo)測定 試驗第14、28天，每個重復(fù)隨機選1只雞進行心臟采血5 mL，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置分層，分離血清，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。用ELISA檢測試劑盒(均購自南京建成生物工程研究所)檢測血清中過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析，統(tǒng)計結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。利用SPSS 24.0軟件按3因子3水平(3×3)有重復(fù)程序?qū)φ辉囼灨黜棓?shù)據(jù)進行K值分析，確定最優(yōu)組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉酶活力檢測結(jié)果

淀粉酶活力檢測結(jié)果如圖 1a所示。淀粉酶活力隨黑曲霉接種量增加逐漸升高，在接種量為1%時酶活力達到最大值，為0.96 U/g(圖1)；淀粉酶活力隨黃芪含水量的升高逐漸升高，在含水量達45%時酶活力達到最大值0.99 U/g，之后逐漸下降(圖1b)；淀粉酶活力隨發(fā)酵溫度升高逐漸升高，當(dāng)溫度達28 ℃時達到最大值0.95 U/g，之后緩慢下降(圖1c)；隨發(fā)酵時間的增加淀粉酶活力逐漸升高，第9天達到最大值，為0.93 U/g，之后逐漸下降并趨于穩(wěn)定(圖1d)。

圖1 不同發(fā)酵條件對淀粉酶活力的影響Fig.1 Effect of different fermentation conditions on amylase activity

2.2 纖維素酶活力檢測結(jié)果

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 利用DNS法[9]進行還原糖含量的測定，并以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，540 nm條件下的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得葡萄糖的濃度和吸光度的關(guān)系?；貧w方程為Y=1.3511x-0.0676、R2=0.9997，葡萄糖濃度在0.1～0.7 mg/mL 間具有良好的線性關(guān)系(圖2)。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of glucose

2.2.2 不同發(fā)酵條件對纖維素酶活力的影響 纖維素酶變化規(guī)律如圖3所示。纖維素酶活力隨接種量的增加逐漸升高，在接種量為1%時達到最大值51.33 U/g，之后逐漸下降(圖3a)；纖維素酶活力隨黃芪含水量升高緩慢升高，當(dāng)接種量達45%時達到最大值71.00 U/g，之后趨于下降(圖3b)；隨發(fā)酵溫度升高纖維素酶活力呈現(xiàn)先升高后下降再逐漸升高的趨勢，當(dāng)溫度達到37 ℃時酶活力最高為73.33 U/g(圖3c)；纖維素酶活力隨著發(fā)酵時間增加逐漸升高，在第9天達到最大值60.67 U/g，之后趨于穩(wěn)定(圖3d)。

圖3 不同發(fā)酵條件對纖維素酶活力的影響Fig.3 Effect of different fermentation conditions on cellulase activity

2.3 多糖含量檢測結(jié)果

2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 根據(jù)苯酚硫酸法[10]進行多糖含量的測定，并以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，490 nm吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得葡萄糖濃度與吸光度的關(guān)系?；貧w方程為Y=13.076x-0.0004、R2=0.9996，葡萄糖濃度在0～0.5 mg/mL 間具有良好的線性關(guān)系(圖4)。

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of glucose

2.3.2 不同發(fā)酵條件對多糖得率的影響 黃芪多糖得率測定結(jié)果如圖5所示。隨接種量增加多糖得率呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，在接種量為1 %時多糖得率最低，為4.12%(圖5a)；多糖得率隨黃芪含水量升高逐漸降低，當(dāng)接種量為40%時多糖得率最低，為3.10%，之后隨含水量增加緩慢上升(圖5b)；多糖得率隨發(fā)酵溫度升高而降低，當(dāng)溫度達到28 ℃時多糖得率最低，為4.62%，之后逐漸趨于穩(wěn)定(圖5c)；多糖得率隨發(fā)酵時間延長呈現(xiàn)先降低再升高的趨勢，第9天最低，為4.57%(圖5d)。

圖5 不同發(fā)酵條件對多糖得率的影響Fig.5 Effect of different fermentation conditions on polysaccharide yield

2.4 正交工藝優(yōu)化

通過正交試驗優(yōu)化發(fā)酵過程中的溫度、接種量、含水量等條件對纖維素酶活力的影響，結(jié)果如表3顯示，通過R值選擇各因素對纖維素酶活力的影響效果為溫度>接種量>含水量，考慮到黑曲霉發(fā)酵黃芪中纖維素酶活力指標(biāo)的重要性，確定其最佳工藝為A3B2C2，即溫度37 ℃，接種量1%，含水量45%時為最佳發(fā)酵條件。通過試驗驗證，在該條件下，纖維素酶活力可達82.26 U/g。

表3 纖維素酶活力正交試驗直觀分析表Table 3 Visual analysis of orthogonal test for cellulase activity

2.5 蛋雞的生產(chǎn)性能及血清抗氧化指標(biāo)

2.5.1 不同處理對蛋雞生產(chǎn)性能的影響 如表4所示，1～14 d各組間的產(chǎn)蛋率和料蛋比差異不顯著(P>0.05);15～28 d發(fā)酵黃芪組產(chǎn)蛋率最高，與對照組、黃芪組、黑曲霉組相比分別提高了18.79%、9.21%、12.85%，差異顯著(P<0.05);黃芪組與對照組相比提高了8.77%，差異顯著(P<0.05)。同時，發(fā)酵黃芪組料蛋比最低，與對照組、黃芪組、黑曲霉組相比分別降低了19.71%、9.49%、20.62%，差異顯著(P<0.05);黃芪組與對照組、黑曲霉組相比分別降低了9.33%、10.17%，差異顯著(P<0.05)。

表4 不同處理對蛋雞產(chǎn)蛋性能的影響Table 4 Effect of different treatments on laying performance of laying hens

2.5.2 不同處理對蛋雞抗氧化指標(biāo)的影響 如表5所示。在第14 d，發(fā)酵黃芪組CAT 活性最高，與黃芪組差異顯著(P<0.05)；發(fā)酵黃芪組MDA含量最低，與對照組和黑曲霉組相比差異顯著(P<0.05)，但與黃芪組相比差異不顯著(P>0.05)；發(fā)酵黃芪組T-AOC活性高于其他組，差異顯著(P<0.05)。在第28天，發(fā)酵黃芪組CAT、GSH-Px、SOD活性均高于其他組且差異顯著(P<0.05)。

表5 不同處理14 d和28 d對蛋雞抗氧化指標(biāo)的影響Table 5 Effect of different treatments on the quality of eggs for 14 days and 28 days

3 討 論

3.1 不同發(fā)酵條件對黑曲霉產(chǎn)酶活力的影響

王曉嬌[11]研究發(fā)現(xiàn)含水量、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間等是影響固體發(fā)酵的重要因素。本研究利用這4個條件對黑曲霉固體發(fā)酵黃芪產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶進行了單因素優(yōu)化試驗。結(jié)果表明：接種量較低時，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分沒有被充分利用，產(chǎn)酶量較低；接種量過大時黑曲霉生長迅速，黃芪中營養(yǎng)成分供應(yīng)不足，菌體快速生長導(dǎo)致溶氧不足，產(chǎn)生大量熱，使培養(yǎng)基溫度過高，從而對菌絲生長和酶活力都有影響，這與張家慶等[12]的研究一致。在固體發(fā)酵中，含水量是制約菌體生長和產(chǎn)酶的關(guān)鍵因素。含水量過低，一方面無法滿足菌體正常的生長代謝，另一方面影響黃芪粉末顆粒的吸水膨脹，阻礙其中營養(yǎng)成分的溶解與傳遞，導(dǎo)致產(chǎn)酶量下降；含水量過高，黃芪顆粒易結(jié)成塊狀物，降低培養(yǎng)基透氣性，阻礙氧氣的輸送及熱量的擴散，不利于菌體的生長和孢子的產(chǎn)生，從而影響產(chǎn)酶量。在優(yōu)化發(fā)酵時間方面，發(fā)酵時間較短時，黑曲霉菌體處于生長調(diào)整期，隨著發(fā)酵時間的延長，產(chǎn)酶量逐漸增多，之后趨于平穩(wěn)，達到產(chǎn)酶穩(wěn)定期。在優(yōu)化發(fā)酵溫度方面，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度升高會加快黑曲霉的生長代謝，產(chǎn)酶量增加；當(dāng)溫度過高時，黑曲霉機體內(nèi)的某些核酸、蛋白質(zhì)遭到破環(huán)，菌體易衰老，同時還會影響培養(yǎng)基的物理性質(zhì)和溶氧，從而間接影響酶的合成[13]。因此在發(fā)酵過程中，含水量、接種量、發(fā)酵時間和溫度等條件對菌體生長和產(chǎn)酶極其關(guān)鍵，控制好條件是發(fā)酵過程的重要環(huán)節(jié)。本研究在單因素條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，通過正交試驗確定了黑曲霉固體發(fā)酵黃芪產(chǎn)纖維素酶的最佳優(yōu)化條件為溫度37 ℃、接種量1%、含水量45%、發(fā)酵時間9 d。這為后期研究及工藝生產(chǎn)應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

3.2 不同發(fā)酵條件對多糖得率的影響

黃芪多糖作為黃芪重要的活性物質(zhì)，在許多情況下是機體貯存能量和結(jié)構(gòu)支撐的主要物質(zhì)，在機體代謝過程中被修飾轉(zhuǎn)化，發(fā)揮著提供能量和營養(yǎng)物質(zhì)的功能。本研究結(jié)果表明，在黑曲霉固體發(fā)酵黃芪過程中優(yōu)化接種量、含水量、發(fā)酵時間、溫度等因素條件下，多糖得率呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢，隨溫度變化多糖得率先降低后趨于平穩(wěn)，這與劉超等[14]的研究不完全一致。分析原因，一可能是由于本試驗所用的發(fā)酵培養(yǎng)基沒有添加額外的營養(yǎng)成分，而在菌體發(fā)酵過程中碳源對于黑曲霉的生長代謝具有重要影響[15]，而多糖作為黃芪中重要的碳水化合物，在發(fā)酵過程中很可能被菌體消耗利用，并進行自我繁殖；二是本研究采用固體發(fā)酵，與液體發(fā)酵有所區(qū)別。目前有關(guān)黑曲霉固體發(fā)酵黃芪的研究報道甚少，黃芪經(jīng)黑曲霉菌發(fā)酵后多糖、黃酮、皂苷等活性成分的變化規(guī)律尚不明確。此外，黃芪粒徑、pH等條件對發(fā)酵過程有何影響等都需要未來進一步的研究和探討。

3.3 發(fā)酵黃芪對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

黃芪作為傳統(tǒng)的補益類中藥，具有增強機體免疫力、降血糖、抗腫瘤和延緩衰老等功效[16]。因雞體內(nèi)缺乏內(nèi)源性纖維素酶，在黃芪的利用過程中由于細胞壁的存在嚴重阻礙其活性成分的釋放[17]，同時日糧中占相當(dāng)比例的纖維營養(yǎng)成分不能有效被利用。黃芪經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后，產(chǎn)生的纖維素酶能有效降解黃芪細胞壁，使活性成分得以充分釋放，從而提高藥效，同時纖維素酶能促進日糧飼料中纖維素和半纖維素降解成更多的葡萄糖及揮發(fā)性脂肪酸，產(chǎn)生獨特的香甜味，提高飼料的適口性，促進纖維營養(yǎng)成分的消化與吸收，進而提高蛋雞采食量[18-19]。本試驗在蛋雞基礎(chǔ)日糧中添加0.2%發(fā)黑曲霉發(fā)酵黃芪制劑，顯著提高了15～28 d的蛋雞產(chǎn)蛋率，同時料蛋比顯著降低。有研究人員報道，在基礎(chǔ)日糧中添加一定量的發(fā)酵黃芪能明顯促進動物生長，提高生產(chǎn)性能[20-21]。李岑曦等[22]研究表明添加纖維素酶可在一定程度上增加肉雞日增重，提高肉雞飼料轉(zhuǎn)化率。李文斌等[23]研究表明飼料中添加復(fù)合纖維素酶，提高蛋雞的產(chǎn)蛋率和蛋重，降低料蛋比。這些研究結(jié)果與本試驗結(jié)果一致。

3.4 發(fā)酵黃芪對蛋雞抗氧化指標(biāo)的影響

動物機體的抗氧化酶主要包括過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)等，他們在平衡動物機體氧化和抗氧化方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉發(fā)酵黃芪制劑能提高不同飼喂階段蛋雞的血清抗氧化水平。分析原因，可能是由于黃芪中甲苷、黃酮類等活性成分增加[24-25]，而且黃芪發(fā)酵后會產(chǎn)生其他具有抗氧化作用的成分。阮鳴等[26]研究表明，黃芪甲苷在發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化生成6-O-B-D-葡萄糖基-環(huán)黃芪醇，其具有顯著的抗氧化及增強藥效的作用。夏素銀等[27]研究發(fā)現(xiàn)苜蓿草粉和纖維素酶能顯著提高蛋雞的SOD活性，降低MDA含量。值得注意的是，第28天各組的MDA含量均有所升高，但差異不顯著，這可能與試驗周期延長、氨濃度的積累有關(guān)。有研究報道稱不同氨氣濃度能刺激動物機體相關(guān)的免疫基因下調(diào)，從而誘導(dǎo)機體出現(xiàn)氧化應(yīng)激和損傷等[28-29]。

4 結(jié) 論

本研究通過對黑曲霉發(fā)酵黃芪過程中酶活力和多糖得率進行單因素優(yōu)化，初步確定淀粉酶最優(yōu)發(fā)酵條件為溫度28 ℃，接種量1%，含水量45%，發(fā)酵時間9 d；纖維素酶最優(yōu)發(fā)酵條件為溫度37 ℃，接種量1%，含水量45% ，發(fā)酵時間9 d。在單因素試驗基礎(chǔ)上通過正交試驗確定黃芪固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的條件在溫度為37 ℃，接種量為1%，含水量為45%時纖維素酶活力達到最高。本試驗以纖維素酶活力為指標(biāo)對黑曲霉發(fā)酵黃芪工藝進行條優(yōu)化后，在蛋雞基礎(chǔ)日糧中添加0.2%的發(fā)酵黃芪制劑，能顯著提高蛋雞的產(chǎn)蛋率，降低料蛋比，同時提高血清抗氧化能力。綜上所述，黑曲霉發(fā)酵黃芪有望成為一種新型綠色的促生長飼料添加劑應(yīng)用到動物生產(chǎn)中。