何原子，張雷，吳春勇*，張峻穎

(1.中國藥科大學(xué)藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點實驗室，江蘇 南京 210009；2.中國藥科大學(xué)藥物分析教研室，江蘇 南京 211198；3.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101；4.中國藥科大學(xué)中藥制劑教研室，江蘇 南京 211198)

肝臟是負責(zé)異源生物代謝的主要器官，也是藥物及其代謝物發(fā)生不良反應(yīng)的重要靶器官。據(jù)統(tǒng)計，在進入Ⅲ期臨床試驗階段的新藥中，20%以上的候選藥物出現(xiàn)肝毒性[1-2]，每個新化學(xué)實體的經(jīng)濟損失高達26億美元[3]。因此，開發(fā)可以真實預(yù)測藥物誘導(dǎo)肝毒性(drug-induced hepatotoxicity)的肝臟模型，并用于臨床前肝毒性藥物篩選，對于新藥研發(fā)至關(guān)重要。盡管動物模型可以在一定程度上反映藥物在復(fù)雜機體內(nèi)的處置情況，但實驗成本高、周期長以及種屬差異等缺點限制了此類模型在肝毒性預(yù)測方面的大規(guī)模應(yīng)用。

人原代肝細胞(primary human hepatocytes，PHH)的平面培養(yǎng)模型是目前評估藥物代謝和毒性的金標準模型[4]，但在2D培養(yǎng)過程中，原代肝細胞迅速去分化并喪失肝臟特異性功能[5]，無法有效監(jiān)測長期或重復(fù)給藥時的肝毒性反應(yīng)[6]。

為了解決上述難題，3D細胞培養(yǎng)技術(shù)被用于體外肝細胞模型的構(gòu)建。與傳統(tǒng)的2D細胞模型相比，3D肝細胞模型可以在體外模擬細胞-細胞、細胞-細胞外基質(zhì)(extracellular cell matrix，ECM)的相互作用，進而重現(xiàn)肝組織的特異性功能，為體外預(yù)測藥物毒性提供了更高的生理相關(guān)性[7]。一個理想的體外3D肝細胞模型應(yīng)當滿足以下要求[8-11]：①在Ⅰ、Ⅱ型代謝酶、轉(zhuǎn)運體以及肝臟特異性蛋白上與體內(nèi)肝細胞具有一致的表型；②可在較長的時間內(nèi)穩(wěn)定維持肝細胞活力以及肝臟特異性功能；③對藥物的毒性反應(yīng)靈敏，且具有分辨急性或長期肝毒性藥物的能力；④可重現(xiàn)體內(nèi)形態(tài)學(xué)特征與生理參數(shù)，如膽管的生成、與非實質(zhì)細胞的共培養(yǎng)以及含氧水平等；⑤適用于高通量毒性藥物篩選。與3D肝細胞模型相關(guān)的評價指標見表1。

研究人員已經(jīng)開發(fā)出許多建立3D肝細胞模型的方法，本綜述將重點討論三明治模型、球樣體模型、3D打印模型以及微流控模型在肝毒性評價的應(yīng)用以及各自的特點(見圖1)，以期為3D體外肝毒性模型的下一步發(fā)展提供參考。

A.灌注培養(yǎng)三明治模型的F-actin染色圖[38](Scale bar=20 μm)；B.倒膠體晶體支架中HepG2球樣體的熒光染色圖[56](Scale bar=200 μm)；C.3D生物打印構(gòu)建的微型肝組織示意圖以及HE染色圖[69](Scale bar=25 μm)；D.微流控芯片制造人造肝組織的示意圖以及實物圖[73]

1 三明治模型

由于2D培養(yǎng)無法復(fù)制細胞與細胞外基質(zhì)構(gòu)成的天然微環(huán)境，PHH 在24 h內(nèi)迅速去分化并失去部分肝功能[22]。為了模擬肝細胞在生理條件下的生長情況，Dunn等[23]將大鼠的肝細胞置于兩層膠原蛋白凝膠之間培養(yǎng)，形成“三明治”結(jié)構(gòu)，該模型可在42 d內(nèi)維持大鼠肝細胞的正常形態(tài)與白蛋白分泌功能。三明治模型的夾心結(jié)構(gòu)增強了肝細胞之間的相互作用，可為膽小管的形成提供必要的細胞極性[24]，通過對膽汁酸排泄以及藥物肝膽處置過程的監(jiān)測實現(xiàn)體外肝毒性評價[25-26]。譬如在三明治培養(yǎng)的PHH中，2型糖尿病治療藥物曲格列酮[27]和抗抑郁藥奈法唑酮[28]都會抑制膽汁酸轉(zhuǎn)運體(BSEP)，從而引起膽汁淤積。Lee等[29]等利用大鼠原代肝細胞的三明治模型，探討了地塞米松緩解抗腫瘤藥物曲貝替定誘導(dǎo)肝毒性的作用機制，發(fā)現(xiàn)地塞米松的干預(yù)下，多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)介導(dǎo)的膽汁排泄以及CYP3A1/2介導(dǎo)的代謝增加，從而使曲貝替定的肝臟毒性降低了2～3倍。為改善三明治模型中氧氣以及營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，Zhang等[30]將灌注培養(yǎng)系統(tǒng)引入三明治模型，此模型在維持細胞形態(tài)、尿素生成以及代謝酶活性的同時，表現(xiàn)出比靜態(tài)培養(yǎng)的三明治模型更高的藥物敏感性(圖1-A)。然而，與體內(nèi)肝細胞相比，三明治模型仍然存在自身的局限性，如三明治模型中肝細胞的表型以及膽小管的生成對于ECM的依賴程度較高，ECM性質(zhì)的變化可能會影響模型預(yù)測的準確性[31]，長期實驗過程中膽小管的泄漏和損壞也限制了三明治模型的發(fā)展[32]。

2 球樣體模型

與三明治培養(yǎng)相比，球樣體模型表現(xiàn)出更為緊密的細胞間相互作用[33]。肝細胞在低黏附培養(yǎng)板、懸滴培養(yǎng)或旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中培養(yǎng)時，均可通過自組裝形成球樣體[34-36]。這類無須細胞黏附底物、通過懸浮細胞自發(fā)聚集成球的模型也被稱為無支架模型，其中簡單易行的低黏附培養(yǎng)板最為常用。低黏附培養(yǎng)形成的原代肝細胞和HepaRG球樣體模型在細胞活力、代謝酶功能(CYP1A2、CYP2C8、CYP3A4)和尿素分泌方面的表現(xiàn)較三明治模型更優(yōu)[37]，在肝毒性藥物如抗精神病藥氯丙嗪、非甾體抗炎藥對乙酰氨基酚、降壓藥波生坦以及帕金森治療藥物托卡朋等的重復(fù)暴露實驗中，表現(xiàn)出了更高的敏感性和預(yù)測能力[38-40]。PHH球樣體更是在蛋白質(zhì)組[12]、轉(zhuǎn)錄組[41]方面表現(xiàn)出與體內(nèi)肝臟的高度相似性，并且可以在三周內(nèi)穩(wěn)定保持與體內(nèi)一致的代謝組特征[42]。

與無支架模型相比，有支架模型的優(yōu)勢在于為形成球樣體的細胞提供了有利于增殖和遷移的環(huán)境[43]。在以半乳糖基修飾的纖維素、鈣-海藻酸鹽等材料為代表的細胞支架中，肝細胞球樣體在白蛋白和尿素合成、藥物敏感性、以及Ⅰ、Ⅱ型代謝酶的表達上具有優(yōu)勢[44-46]。然而，球樣體模型的主要缺點在于難以形成均一的尺寸，這種差異可能導(dǎo)致球體內(nèi)部的細胞間相互作用不同，從而引起細胞活力水平的變化。譬如，較小的球樣體無法提供與體內(nèi)相似的生理特性，而直徑太大的球樣體中心容易出現(xiàn)缺氧壞死[47]。

為了更好地控制球樣體的直徑，倒膠體晶體支架(inverted colloid crystal，ICC)應(yīng)運而生，如圖1-B所示，HepG2細胞在ICC支架中形成大小均一的球樣體[48]。這是一種高度均勻的體系，其中的孔狀結(jié)構(gòu)可以促進細胞之間的相互連接，材料具有良好的傳質(zhì)性，可以保持營養(yǎng)成分的均勻滲透[48-50]。Ng等[51]將原代人胎兒肝細胞培養(yǎng)于鋪被膠原蛋白Ⅰ的ICC支架中，該模型在體外可維持長達5個月的肝臟特異性功能，代謝酶CYP3A4、2D6以及2C19的活性在培養(yǎng)7周內(nèi)維持上升趨勢，可在體外預(yù)測氟尿苷的肝毒性作用機制。但人胎兒肝細胞具有來源稀缺以及倫理爭議等缺點，無法廣泛用于體外肝毒性模型的建立[52]。于是Ng團隊改用由誘導(dǎo)型多功能干細胞(iPSC)衍生得到的肝祖細胞(IH)，在Matrigel修飾的ICC支架中構(gòu)建了肝臟類器官，模型表現(xiàn)出與體內(nèi)相似的形態(tài)學(xué)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征，在蛋白質(zhì)分泌，藥物代謝方面等方面的表現(xiàn)更接近成年人的肝組織[53]，但ICC支架培養(yǎng)需要額外的ECM涂層(膠原蛋白Ⅰ以及Matrigel)，步驟煩瑣，涂層的厚度也會影響模型的可重復(fù)性。

3 3D生物打印模型

3D生物打印是將含細胞的生物墨水以自動化的方式逐層打印成型，通過改變生物墨水的組成以及目標結(jié)構(gòu)的不同而實現(xiàn)對體外器官模型的靈活構(gòu)建[54]。常用于構(gòu)建肝細胞模型的生物墨水有甲基丙烯化明膠(GelMA)[55]、膠原蛋白[56]、纖維蛋白[57]和海藻酸鈉[58]等。3D生物打印技術(shù)在肝細胞模型的構(gòu)建上仍處于起步階段，與其他模型相比，3D生物打印構(gòu)建的肝臟模型適用于多細胞培養(yǎng)，具有與體內(nèi)組織水平相當?shù)募毎芏?，并可在較長的培養(yǎng)周期內(nèi)實現(xiàn)肝臟特異性功能的持續(xù)表達[59]。Faulkner等[60]將人類誘導(dǎo)多能干細胞(hiPSC)和人類胚胎干細胞(hESC)打印到藻酸鹽水凝膠中，誘導(dǎo)形成肝樣細胞(HLC)，模型中細胞核因子4α(HNF4α)和白蛋白可穩(wěn)定表達超過21 d。Nguyen等[61]進一步構(gòu)建了包括肝實質(zhì)細胞PHH、非實質(zhì)細胞肝星狀細胞和內(nèi)皮細胞HUVEC在內(nèi)的3D肝臟微組織(圖1-C)，具有與體內(nèi)肝臟相似的特性(如脂質(zhì)與糖原的儲存以及實質(zhì)與非實質(zhì)細胞之間的分區(qū))，可在4周內(nèi)維持肝細胞活力、白蛋白和CYP3A4的表達?；诮M織工程學(xué)上的優(yōu)勢，3D生物打印構(gòu)建的肝細胞模型在藥物肝毒性評價上也具有良好的前景。Richard等通過優(yōu)化膠原蛋白I-透明質(zhì)酸這一混合生物墨水的比例，進行了原代肝細胞和肝星狀細胞共培養(yǎng)的3D肝組織構(gòu)建，并將對乙酰氨基酚(APAP)作為驗證模型毒性預(yù)測能力的指標，結(jié)果表明該組織表現(xiàn)出了與體內(nèi)相似的藥物反應(yīng)[62]。Massa等[63]使用犧牲材料搭建微血管通道，將HUVEC引入封裝于GelMA中的HepG2/C3A球樣體中，構(gòu)建了血管化的肝臟模型，APAP誘導(dǎo)毒性實驗結(jié)果表明，血管的存在使得APAP對肝球樣體的毒性作用得到了緩解。

4 微流控模型

利用微流控技術(shù)制造的動態(tài)肝臟體外系統(tǒng)，也被稱為“芯片上的肝臟”[64-65]，已被用于藥物篩選、毒性測試、新陳代謝預(yù)測、肝病模型建立以及多器官相互作用研究等領(lǐng)域[64]。微流控技術(shù)也適用于多細胞共培養(yǎng)模式。Deng等[65]將HepG2、人肝星形細胞LX-2、人臍靜脈細胞融合細胞EA.hy926和人組織細胞淋巴瘤細胞U937按生理狀態(tài)排列，構(gòu)建了人造肝芯片，并分別在其上層和下層構(gòu)建了供血液以及膽汁通過的人造管道(圖1-D)，與單層靜態(tài)培養(yǎng)模型相比，此模型大幅提高了肝細胞的合成和分泌功能，包括CYP1A1、CYP1A2和UGT酶的活性，以及對藥物代謝毒性的敏感性。Kalchman等[66]制造了由HepG2和HUVEC細胞共培養(yǎng)組成的肝小葉陣列，通過操作介質(zhì)電泳，使得微流體室中隨機分布的細胞重新排布成類似于肝小葉的狀態(tài)，并由此將HepG2細胞中CYP450酶的活性提高80%。除了多細胞共培養(yǎng)外，與其他模型的聯(lián)用可以進一步優(yōu)化體外肝臟微流控模型。Bhise等[67]采用3D點陣列打印肝球樣體模型，培養(yǎng)時引入微流控芯片的動態(tài)灌注功能，不僅可維持白蛋白、ZO-1、MRP2等肝功能指標的長期表達，并可發(fā)現(xiàn)APAP引起的長期毒性反應(yīng)。微流控系統(tǒng)結(jié)合多細胞共培養(yǎng)以及多模型聯(lián)用技術(shù)，能夠獲得比靜態(tài)系統(tǒng)更好的預(yù)測值和更高的代謝活性，并有望實現(xiàn)個性化藥物篩選[68]。

5 總結(jié)與展望

相對于傳統(tǒng)的2D肝細胞模型，3D模型在細胞間相互作用、肝臟表型的可持續(xù)性和體外肝功能重現(xiàn)等方面更有優(yōu)勢，可以為藥物研究和疾病治療提供更加可靠的平臺。但由于器官結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性，目前的3D肝模型仍與體內(nèi)器官存在較大的差距，細胞共培養(yǎng)以及多模型聯(lián)用將成為之后體外肝臟模型的主流[9]。通過將多學(xué)科融合的大數(shù)據(jù)以及人工智能等前沿信息技術(shù)用于新型材料的發(fā)現(xiàn)以及培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)化，未來的3D肝細胞模型定會在毒效評價、新藥發(fā)現(xiàn)等方面展現(xiàn)出更大的潛力。