柏建學(xué)，柴發(fā)永，范鋒

(1.山東省食品藥品審評查驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250014；2.辰欣藥業(yè)股份有限公司，山東 濟(jì)寧 272073)

甲磺酸達(dá)比加群酯(Dabigatran Etexilate Mesylate)是由德國勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim)公司研制開發(fā)的一種新型口服抗凝藥物，屬于可逆的、競爭性的直接凝血酶抑制劑，歐洲藥品管理局(EMEA)于2008年批準(zhǔn)其在歐盟上市[1-2]。其化學(xué)式為β-丙氨酸，N-[[2-[[[4-[[[(己氧基)羰基]氨基]亞氨基甲基]苯基]氨基]甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-基]羰基]-N-2-嘧啶-，乙酯，甲磺酸鹽，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

本品的合成、精制工藝中用到了甲磺酸、乙醇和異丙醇，故本品中有甲磺酸甲酯(MMS)、甲磺酸乙酯(EMS)和甲磺酸異丙酯(IMS)產(chǎn)生的可能。EMEA明確規(guī)定甲基磺酸酯類雜質(zhì)為遺傳毒性雜質(zhì)，必須嚴(yán)格控制。參照EP8.0版附錄中“Methyl,Ethyl and Isopropyl Methanesulfo Nate in Active substances”[3]和相關(guān)文獻(xiàn)[4-5]，采用GC-MS法直接對本品中3種甲磺酸酯進(jìn)行檢測，為甲磺酸達(dá)比加群酯原料中甲磺酸酯的控制提供了有效的分析手段。

1 儀器與試藥

6890N-5973N型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent，USA)，COMBI-PAL型頂進(jìn)樣器(CTC，Switzerland)；Mettler Toledo XS205電子天平；SK8200LH數(shù)控超聲波清洗儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

甲磺酸甲酯對照品(批號(hào)：A0338199，含量：99.0%，ACROS)，甲磺酸乙酯對照品(批號(hào)：10169291，含量：97.0%，Alfa Aesar)，甲磺酸異丙酯對照品(批號(hào)：B001983389，含量98.0%，Aldrich)，甲磺酸正丁酯對照品(批號(hào)：P23O，含量：99.0%，Matrix Scientific)；甲磺酸達(dá)比加群酯原料(批號(hào)：140301、140302、140303，山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司)；二氯甲烷(色譜純，J.T.Baker)。

2 方法與結(jié)果

2.1 GC-MS條件

2.1.1 GC條件 采用DB-624色譜柱(30 m×0.25 mm,1.4 μm)；柱溫采用程序升溫：起始溫度100 ℃，以15 ℃·min-1的速率升溫至200 ℃，再以25 ℃·min-1的速率升溫至240 ℃；進(jìn)樣口溫度為220 ℃；不分流；載氣為高純氦氣(99.999%)；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為2.0 μL。

2.1.2 MS條件 EI離子源；離子源溫度為230 ℃，電子能量為70 eV；采集模式為SIM。各雜質(zhì)質(zhì)譜定量/定性離子峰見表1。

表1 各雜質(zhì)質(zhì)譜定量/定性離子峰

2.2 稀釋溶劑的選擇 取本品和甲磺酸酯雜質(zhì)，采用甲醇、乙腈、異丙醇和二氯甲烷等溶劑進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，二氯甲烷效果最佳，故選擇二氯甲烷作為本品中甲磺酸酯檢測的稀釋溶劑。

2.3 溶液配制

2.3.1 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱定甲磺酸丁酯(BMS)10.8 mg，置玻璃小瓶中，準(zhǔn)確加入二氯甲烷1.08 mL，搖勻；精密量取1.0 mL，置100 mL量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻；精密量取0.1 mL，置50 mL量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，作為內(nèi)標(biāo)溶液(濃度為200 ng·mL-1)。

2.3.2 對照品溶液 精密稱定MMS對照品10.6 mg，置玻璃小瓶中，準(zhǔn)確加入二氯甲烷1.06 mL，作為MMS對照品溶液(濃度為10 mg·mL-1)；精密稱定EMS對照品10.5 mg，置玻璃小瓶中，準(zhǔn)確加入二氯甲烷1.05 mL，作為EMS對照品溶液(濃度為10 mg·mL-1)；精密稱定IMS對照品10.3 mg，置玻璃小瓶中，準(zhǔn)確加入二氯甲烷1.03 mL，作為IMS對照品溶液(濃度為10 mg·mL-1)。精密量取上述3種對照品溶液各1.0 mL，置100 mL量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品儲(chǔ)備液(濃度為100 μg·mL-1)；精密量取0.1 mL，置50 mL量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液(濃度為200 ng·mL-1)。

2.3.3 供試品溶液 取甲磺酸達(dá)比加群酯原料約100 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2.0 mL，加二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性 取內(nèi)標(biāo)溶液和混合對照品溶液各1.0 mL，置10 mL量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液，精密量取2.0 μL進(jìn)行氣質(zhì)分析，記錄離子流圖，質(zhì)譜掃描模式為Scan模式，經(jīng)過質(zhì)譜分析得出4種成分的保留時(shí)間。結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，MMS、EMS、IMS和BMS保留時(shí)間分別為4.469、5.172、5.473和7.211 min，各成分峰的理論板數(shù)均大于10 000，各成分之間的分離度均大于2.0，且空白溶劑(二氯甲烷)對甲磺酸酯檢測無干擾。

圖2 系統(tǒng)適用性的MS圖

另精密量取對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各0.2 mL，置進(jìn)樣瓶中，用二氯甲烷稀釋至1.0 mL，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，各成分峰面積的RSD均小于2.0。

表2 系統(tǒng)適用性結(jié)果

2.5 線性關(guān)系與范圍 精密量取對照品溶液0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mL，分別置10 mL量瓶中，分別精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2.00 mL，用二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，分別依法測定，記錄總離子流圖，量取峰面積。以目標(biāo)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)目標(biāo)物濃度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表3。

表3 線性關(guān)系與范圍試驗(yàn)結(jié)果

2.6 精密度 精密量取對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各0.2 mL，置進(jìn)樣瓶中，用二氯甲烷稀釋至1.0 mL，配制6份，分別精密量取2.0 μL，注入氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀，記錄總離子流圖，量取峰面積，計(jì)算雜質(zhì)與內(nèi)標(biāo)的比值及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，雜質(zhì)與內(nèi)標(biāo)比值的RSD均小于2.0，說明本方法精密度良好。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.7 中間精密度 取本品(批號(hào)：140301)和內(nèi)標(biāo)溶液，依法測定6份，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算雜質(zhì)的含量，并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，MMS和IMS均未檢出，EMS為0.031 ppm，RSD為6.77%。說明本方法重現(xiàn)性良好。

表5 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.8 回收率 取本品(批號(hào)：140301)約100 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液各2.0 mL，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為空白校樣品溶液。另取本品(批號(hào)：140301)約100 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，精密加入對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各2.0 mL，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為100%濃度的供試品溶液(40 ng·mL-1)，同法配制200%濃度的供試品溶液(80 ng·mL-1)和50%濃度的供試品溶液(20 ng·mL-1)，每個(gè)濃度平行制備3份。精密量取空白樣品溶液2.0 μL，注入氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀，記錄離子流圖，扣除樣品中的檢出量，計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表6。由結(jié)果可知，MMS、EMS和IMS的平均回收率分別為96.98%、97.91%、96.57%，RSD分別為2.34%、2.93%、1.77%，說明回收率較高，準(zhǔn)確度較好。

表6 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 定量限 通過逐級(jí)稀法配制定量限溶液，按信噪比S/N≈10的溶液濃度為定量限溶液，精密量取2.0 μL，注入LC-MS，連續(xù)測定6次。結(jié)果表明，MMS、EMS和IMS的定量限均為5 ng·mL-1(0.5 ppm)。

2.10 檢出限 按信噪比S/N≈3的溶液濃度為檢出限溶液，精密量取2.0 μL，注入氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀，連續(xù)測定6次。結(jié)果表明，MMS、EMS和IMS的檢出限均為1.5 ng·mL-1(0.15 ppm)。

2.11 樣品測定 取本品3批樣品(批號(hào)：140301、140302、140303)，依法測定，結(jié)果見表7。結(jié)果表明，3批樣品中MMS和IMS均未檢出，EMS均小于0.1 ppm。

表7 3批樣品中甲磺酸酯的檢測結(jié)果

3 討論

烷基(或苯基)磺酸酯可與DNA發(fā)生烷基化反應(yīng)，從而可能成為引發(fā)癌癥的誘因，對人類的健康造成極大威脅，因此，必須嚴(yán)格控制藥品中的烷基(或苯基)磺酸酯的限度[6]。根據(jù)《遺傳毒性雜質(zhì)限度指導(dǎo)原則》相關(guān)規(guī)定，采用毒理學(xué)關(guān)注閾值(threshold of toxicological concern，TTC)作為控制遺傳毒性雜質(zhì)限度的方法。對于無閾值效應(yīng)的遺傳毒性雜質(zhì)，如果每日攝入量低于1.5 μg，則可忽略不計(jì)患者因服藥導(dǎo)致癌癥發(fā)生的額外風(fēng)險(xiǎn)[7-9]。按照本品日最大服用量300 mg計(jì)算，甲磺酸酯(MMS、EMS和IMS)的限度應(yīng)不得大于5 ppm。本方法的靈敏度、線性和范圍、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性完全滿足本品中甲磺酸酯的檢測要求。