姜樹銀，張迅杰，張乃斌，李春煥，賀美蓮，石峰，咸瑞卿

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省仿制藥一致性評價(jià)工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101)

血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)是由血管內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓巨核細(xì)胞合成的一種多結(jié)構(gòu)域、多功能糖蛋白，在1期和2期止血中發(fā)揮重要作用[1-2]。人凝血因子Ⅷ(coagulation factor Ⅷ)是一種血漿糖蛋白，是內(nèi)源性凝血途徑中一種重要的凝血因子[3-6]。這兩種因子均為人體內(nèi)重要的凝血成分，一旦缺乏會引起不同程度的血友病，嚴(yán)重時(shí)會危及生命。人凝血因子Ⅷ/血管性血友病因子復(fù)合物凍干注射劑是目前此類疾病的最有效的治療藥物。該藥物的生產(chǎn)工藝涉及沉淀、離心、吸附、層析、超濾、滅活等工序，所用儀器設(shè)備及物料均有可能引入重金屬，監(jiān)測該制劑中重金屬元素的含量對于保證用藥安全非常重要。目前，采用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法測定藥品中金屬元素的方法較為成熟[7-9]，但尚無關(guān)于該產(chǎn)品中重金屬元素檢測方法的研究報(bào)道。本研究建立了ICP-MS測定人凝血因子Ⅷ/血管性血友病因子復(fù)合物凍干注射劑中21種常見金屬元素含量的方法，為該制劑的質(zhì)量控制提供了參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 7800型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(Agilent公司)；MARS 6型微波消解儀(美國CEM Corporation公司)；EHD-40趕酸爐(北京東航科技有限公司)；A10純水機(jī)(美國Millipore)；XSE205型電子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 主要試劑 單元素硼(B)、鈧(Sc)、鎂(Mg)、鋁(Al)、硅(Si)、釩(V)、錳(Mn)、鐵(Fe)、鈷(Co)、鎳(Ni)、銅(Cu)、鋅(Zn)、鍶(Sr)、鋯(Zr)、鉬(Mo)、銠(Rh)、鈀(Pd)、錫(Sn)、鋇(Ba)、鈰(Ce)、鉛(Pb)標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg·L-1，Inorganic)；鎘(Cr，1 000 μg·L-1，國家有色金屬及電子材料分析測試中心)；硝酸(65%，UP級,蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司)；超純水(純化水經(jīng)A10純水機(jī)過濾，電阻率<18 MΩ·cm。

1.3 樣品 樣品由山東泰邦生物制品有限公司提供，批號：202012S08、202012S09、202012S10。

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器工作參數(shù)

2.1.1 ICP-MS條件 等離子體選擇常規(guī)模式；功率為1 550 W，采樣深度為10.0 mm，等離子氣、霧化氣、輔助氣流量分別為15.0、0.99、0.9 L·min-1，He氣流量為3.7 L·min-1，泵速為0.10 r·s-1，霧化室溫度為2 ℃，積分時(shí)間為0.1 s，數(shù)據(jù)采集重復(fù)讀取3次，掃描/重復(fù)次數(shù)為100，峰型為3，穩(wěn)定時(shí)間為40 s；硼(B)元素采用No Gas調(diào)諧模式，其他元素采用He調(diào)諧模式，有效消除來自質(zhì)譜的干擾。

2.1.2 微波消解程序 依據(jù)消解罐的數(shù)量，選擇合適的功率。8～12罐：800 W,13～24罐：1 200 W,25～40罐：1 600 W。本研究選擇1 200 W，升溫程序：10 min內(nèi)升溫至120 ℃，保持2 min；5 min內(nèi)升溫至150 ℃，保持5 min，5 min內(nèi)升溫至190 ℃，保持20 min。

2.2 溶液制備

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液 選擇Sc(45)作為B(11)、Mg(24)、Al(27)、Si(28)、V(51)、Mn(55)、Fe(56)、Co(59)元素的內(nèi)標(biāo)；Ge(72)作為Ni(60)、Cu(63)、Zn(66)、Sr(88)、Zr(90)、Mo(95)元素的內(nèi)標(biāo)；In(115)作為Rh(103)、Pd(105)、Sn(118)、Ba(137)元素的內(nèi)標(biāo)；Bi(209)作為Pb(208)元素的內(nèi)標(biāo)。精密量取內(nèi)標(biāo)單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg·L-1)適量，用2%硝酸稀釋至200 mL，使Sc(45)、Ge(72)、In(115)元素濃度為300 μg·L-1、Bi(209)元素濃度為100 μg·L-1。使用蠕動(dòng)泵和T型混合三通在線添加，對分析信號進(jìn)行校正，有效地克服信號漂移、消除一定的基體干擾。

2.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)元素線性溶液 精密量取21種單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg·mL-1)適量(見“1.2”項(xiàng)下主要試劑)，用2%硝酸溶液稀釋至50 mL，作為混合標(biāo)準(zhǔn)元素線性溶液(1)～(7)，其濃度范圍見表1。

2.2.3 供試品溶液和空白溶液 精密稱取本品約0.5 g，置微波消化罐中，加入2 mL水，使?jié)櫇瘢尤? mL硝酸，密封，浸泡過夜。置微波消解儀中，按“2.1.2”項(xiàng)下微波消解程序消解。冷卻后取出，置趕酸爐中，130 ℃下趕酸至紅棕色蒸汽揮盡后，繼續(xù)濃縮至剩余溶液約為0.5 mL，放冷，用水轉(zhuǎn)移并定容至25 mL離心管中，搖勻，即得。不加樣品，同法制備空白溶液。

2.3 測定法

2.3.1 線性關(guān)系和線性范圍 取“2.2.2”項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)元素線性溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下ICP-MS 條件進(jìn)樣測定，記錄儀器相應(yīng)值。以待測元素濃度為橫坐標(biāo)，待測元素響應(yīng)值(CPS值)與內(nèi)標(biāo)元素響應(yīng)值(CPS值)的比率為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸(儀器自動(dòng)計(jì)算)。結(jié)果見表1。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)元素線性溶液濃度、范圍、回歸方程(μg·L-1)

2.3.2 檢出限(LOD)與定量限(LOQ) 取2%硝酸溶液，連續(xù)進(jìn)樣11次，計(jì)算待測元素CPS值與內(nèi)標(biāo)CPS值比率的標(biāo)準(zhǔn)偏差SD，以3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差與線性方程中斜率的比值為檢出限，以10倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差與線性方程中斜率的比值為定量限，結(jié)果見表2。

表2 檢出限與定量限結(jié)果(μg·L-1)

2.3.3 精密度 取混合標(biāo)準(zhǔn)元素線性溶液(4)，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算檢測值的RSD(%)，結(jié)果見表3。

表3 精密度結(jié)果(μg·L-1)

2.3.4 回收率 照第“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，同時(shí)加入適量濃度的單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行制備6份，進(jìn)樣檢測，計(jì)算回收率(%)和RSD(%)，結(jié)果見表4。

表4 回收率結(jié)果(%)

2.3.5 重復(fù)性 照第“2.3.4”項(xiàng)下回收率中供試品溶液的制備方法，平行制備6份，計(jì)算回收率(%)和RSD(%)，結(jié)果見表5。

表5 重復(fù)性結(jié)果(%)

2.3.6 樣品檢測結(jié)果 取本品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣檢測，計(jì)算樣品中各元素的含量。結(jié)果見表6。表6中S08-3、S09-3、S10-3和S08-6、S09-6、S10-6為本品202012S08、202012S09、202012S10按加速試驗(yàn)條件[(40±2)℃，75%±5%]存放3個(gè)月和6個(gè)月的檢測結(jié)果。

表6 樣品中各元素含量檢測結(jié)果(μg·L-1)

3 討論

《中國藥典》2020年版人血白蛋白鋁殘留量測定法第二法收載了ICP-MS法。參照此法，采用5%硝酸沉淀蛋白4 h后，離心濾過，上樣測定，結(jié)果顯示基質(zhì)干擾大，結(jié)果重現(xiàn)性差。研究發(fā)現(xiàn)，該方法蛋白沉淀不完全，易帶來較大儀器污染導(dǎo)致測定結(jié)果出現(xiàn)較大波動(dòng)。本研究采用微波消解法，通過優(yōu)化樣品取樣量、消解液用量、消解時(shí)間、消解溫度等參數(shù)，建立了適用的樣品前處理方法，采用該方法樣品消解完全，溶液澄清，降低了酸對采樣錐的損壞，并消除其他試劑引入帶來的基體干擾，測定結(jié)果重現(xiàn)性良好。該方法快速簡便、靈敏度高、準(zhǔn)確性好，不僅適用于人凝血因子Ⅷ/血管性血友病因子復(fù)合物凍干注射劑中金屬元素的檢測，而且可為其他血液制品中金屬元素含量的測定提供參考。