張怡評(píng)，楊婷，張紅紅，胡賢陳，晉文慧，方華，洪專，邱遠(yuǎn)望，黃鳴清

(1.自然資源部第三海洋研究所，海洋生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)創(chuàng)新中心，福建 廈門 361005；2.福建中益制藥有限公司，福建 泉州 362712；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350108)

海帶(Laminariajaponica)，隸屬于褐藻門(Phaeophyta)，褐藻綱(Phaeophyceae)，海帶目(Laminariales)，海帶科(Laminariaceae)，海帶屬(Laminaria)，為多年生海藻植物，中藥名稱為“昆布”，具有消痰軟堅(jiān)散結(jié)、利水消腫等功效，始載于漢末的《名醫(yī)別錄》。《嘉佑本草》記載海帶能“去瘦行水，下氣化痰”[1]。現(xiàn)代研究表明海帶中含有多酚、多糖、活性碘、脂肪酸等多種有效成分，藥理學(xué)研究表明海帶提取物具有調(diào)節(jié)血脂、降血糖、降血壓、抗凝血、增強(qiáng)免疫功能等[2]。其中，海帶多酚作為褐藻海帶中一類重要的多酚化合物，主要是以間苯三酚為結(jié)構(gòu)單元的聚合物形式存在，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了海帶多酚多種生物活性，包括抗氧化、抗腫瘤、抗菌等[3-8]。近年來，有一些關(guān)于海帶多酚的提取工藝及活性評(píng)價(jià)的研究，但大都停留在多酚粗提取物上。如勞敏軍等以超聲波、微波為提取手段，確立微波輔助提取海帶多酚的最佳提取工藝條件[9]；林曉等[10]采用響應(yīng)面法優(yōu)化海帶中總多酚提取工藝，并采用粗提取物進(jìn)行初步的抗氧化活性研究。本研究將采用一定濃度的乙醇溶液提取海帶粗多酚，并采用大孔吸附樹脂進(jìn)行分離純化，獲得高純度海帶多酚。該方法操作簡(jiǎn)便，所制備的海帶多酚含量較高，可為海帶多酚類成分的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 儀器 HS-7磁力攪拌器(德國(guó)艾卡公司)；UH5300紫外可見分光光度計(jì)(日立株式會(huì)社)；DFT-200A萬能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；HH-ZK2水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；NT-901渦旋振蕩器(海門市其林貝儀器制造有限公司)；H1650-W離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司)。

1.2 材料 海帶(采自福建省東山縣，由福建遠(yuǎn)揚(yáng)藻業(yè)股份有限公司提供)；

1.3 試劑 沒食子酸(純度：98%，批號(hào)：110831-201906，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；福林酚試劑、碳酸鈉、無水乙醇等(均為分析純，購(gòu)自汕頭西隴化學(xué)試劑有限公司)；大孔吸附樹脂(SZ-1、SZ-2、SZ-3、SZ-4、SZ-5、SZ-6，廈門科譜生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 海帶多酚含量的測(cè)定 參照國(guó)標(biāo)及文獻(xiàn)方法，采用福林酚測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定[11-12]。精確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并配制成20 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)工作液。取6支10 mL具塞試管，分別精密加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μg·mL-1)，依次向試管中加入1.5 mL酚試劑和4 mL 8% 碳酸鈉溶液，加水定容至10 mL，混勻后置于30 ℃水浴反應(yīng)20 min，在765 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)樣品的吸光度A。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，以其吸光度A為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.014 2X+0.013 2，R2=0.998，在4～20 μg·mL-1濃度范圍有良好的線性關(guān)系。吸取樣品液1 mL自加入福林酚試劑起按照步驟進(jìn)行測(cè)定吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚含量。

2.2 海帶多酚提取單因素試驗(yàn) 取洗凈干海帶，粉碎，過80目篩，分別以乙醇水溶液(50%、60%、70%、80%和90%)、提取時(shí)間(0.5、1、1.5、2、2.5和3 h)、提取溫度(40、50、60、70、80和90 ℃)、料液比(1∶25、1∶35、1∶45、1∶55、1∶65和1∶75)為單因素進(jìn)行考察，篩選正交試驗(yàn)因素及水平。

2.3 海帶多酚提取工藝優(yōu)化 在單因素基礎(chǔ)上采用4因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化。乙醇濃度(65%、75%和85%)，提取時(shí)間(0.5、1.0和1.5 h)，提取溫度(55、65和75 ℃)，料液比(1∶45、1∶55和1∶65)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

2.4 海帶多酚柱層析分離純化

2.4.1 樹脂的選擇 稱取經(jīng)過預(yù)處理的上述6種吸附樹脂(SZ-1、SZ-2、SZ-3、SZ-4、SZ-5、SZ-6)各1.0 g置于50 mL三角瓶中，分別加入30 mL海帶多酚提取液，于30 ℃下振搖吸附24 h后過濾，測(cè)定濾液中的海帶多酚含量，原液中多酚含量扣除吸附后溶液中剩余的多酚量即為被樹脂吸附的多酚量。

2.4.2 洗脫劑乙醇濃度的選擇 稱取5.0 g經(jīng)過預(yù)處理的SZ-3樹脂置于300 mL三角瓶中，加入150 mL一定濃度(4.3 mg·mL-1)的海帶多酚提取液，30 ℃下振搖吸附5.0 h后過濾，測(cè)定濾液中海帶多酚的總量。再將樹脂平均分成5份，分別用50 mL不同濃度乙醇溶液(20%、40%、60%、80%、100%)在30 ℃下振搖解析4 h后過濾，測(cè)定濾液中海帶多酚的總量。溶液中多酚含量越高，說明該溶液越能解析海帶多酚。

2.4.3 柱層析純化 稱取80 g經(jīng)過預(yù)處理的SZ-3樹脂，濕法裝柱(3×20 cm)，以1.5 mL·min-1的流速上樣(體積175 mL、濃度5 mg·mL-1)海帶多酚提取液，上樣完成后，先以3倍柱體積水洗脫，棄去洗脫液，后采用80%乙醇溶液以1.5 mL·min-1的流速洗脫，分管收集洗脫液，測(cè)定不同濃度的乙醇溶液對(duì)SZ-3樹脂吸附的多酚物質(zhì)的動(dòng)態(tài)解析效果，分段收集，并取多酚含量較高的洗脫組分，濃縮，凍干，測(cè)定樣品中多酚含量。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 不同濃度乙醇溶液對(duì)海帶多酚提取率的影響 采用加熱攪拌提取的方法，固定提取時(shí)間1.0 h，提取溫度60 ℃，料液比(乙醇∶海帶，mL·g-1)1∶35，觀察不同乙醇濃度對(duì)海帶多酚提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇濃度對(duì)多酚提取率的影響

提取濃度對(duì)多酚的提取率結(jié)果表明：多酚的提取率隨著乙醇濃度的升高而呈這件上升的趨勢(shì)，但當(dāng)乙醇溶液的濃度超過80%后，多酚提取率便開始下降，可能是由于太高濃度的乙醇溶液可能導(dǎo)致溶出較多的醇溶性雜質(zhì)、色素以及親脂性強(qiáng)的成分，使提取率降低。因此，正交試驗(yàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)應(yīng)在65%～85%。

3.1.2 提取時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響 固定提取溫度60 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，料液比(乙醇∶海帶，mL·g-1)1∶35，觀察不同提取時(shí)間對(duì)海帶多酚提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響

提取時(shí)間多多酚提取率的影響結(jié)果表明：提取時(shí)間為1.0 h時(shí)，提取率最高，而提取時(shí)間超過1 h后提取率呈下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)槎喾踊衔镂锓€(wěn)定性較差，在1 h時(shí)大部分多酚已經(jīng)被提取出，延長(zhǎng)提取時(shí)間將延長(zhǎng)多酚加熱時(shí)間以及光照時(shí)間，使得多酚類成分被氧化或降解。因此，選擇0.5～1.5 h為正交試驗(yàn)中提取時(shí)間范圍。

3.1.3 提取溫度對(duì)多酚提取率的影響 固定提取時(shí)間1.0 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，料液比(乙醇∶海帶，mL·g-1)1∶35，觀察不同提取溫度對(duì)海帶多酚提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取溫度對(duì)多酚提取率的影響

提取溫度對(duì)多酚提取率的影響結(jié)果表明：隨著提取溫度的升高多酚化合物的提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，這是由于溫度升高，多酚的溶解、擴(kuò)散速度加快，因而更易于從原料中溶出。但是當(dāng)溫度超過60 ℃時(shí)，提取率迅速降低，可能是由于多酚屬于熱敏性物質(zhì)，高溫導(dǎo)致部分的海帶多酚類物質(zhì)氧化破壞。因此，選擇55～75 ℃為正交試驗(yàn)的提取溫度范圍。

3.1.4 料液比對(duì)多酚提取率的影響 固定提取時(shí)間1 h，提取溫度60 ℃，乙醇溶液濃度為80%，觀察不同料液比(乙醇∶海帶，mL·g-1)對(duì)海帶多酚提取率的影響，結(jié)果見圖4。

料液比(乙醇∶海帶，mL·g-1)是影響多酚提取率的最重要因素之一，適當(dāng)?shù)牧弦翰粌H可以減少溶劑的浪費(fèi)，而且能夠比較高效的獲得目標(biāo)物。由圖4可以看出，隨著料液比的增大，多酚的提取率逐漸上升，當(dāng)料液比達(dá)到55 mL·g-1時(shí)，海帶多酚的提取率達(dá)5.27 mg·g-1，繼續(xù)增大料液比，使得溶劑對(duì)超聲的吸收增大，細(xì)胞對(duì)超聲的吸收減少，多酚從細(xì)胞中的溶出量減少，提取率降低[9]，但當(dāng)料液比超過1∶65時(shí)，提取率基本不再增加。因此，初步確定正交試驗(yàn)的料液比(乙醇∶海帶，mL·g-1)在1∶45至1∶65之間。

圖4 料液比對(duì)多酚提取率的影響

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 在海帶多酚提取單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以海帶多酚提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)和料液比(D)為4個(gè)提取因素，每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平，采用4因素3水平正交試驗(yàn)法進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，按照“2.1”的方法進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由表2可得，乙醇濃度對(duì)多酚的影響最大，提取溫度次之，料液比影響最小，方差分析結(jié)果表明，乙醇濃度和提取溫度對(duì)多酚提取具有顯著性影響。從直觀分析結(jié)果可得，最佳的提取工藝為A2B2C3D3，即采用料液比1∶65，乙醇濃度為75%，在75 ℃下提取1.0 h。

3.3 海帶多酚柱層析分離純化

3.3.1 樹脂的選擇 稱取經(jīng)過預(yù)處理的上述6種吸附樹脂(SZ-1、SZ-2、SZ-3、SZ-4、SZ-5、SZ-6)各1 g，分別加30 mL海帶多酚提取液(4.3 mg·mL-1)，于30 ℃下振搖吸附24 h后過濾，測(cè)定濾液中的多酚含量并求算樹脂吸附量。

由表4結(jié)果可得SZ-3樹脂對(duì)海帶多酚的吸附量最大，達(dá)到53.5 mg·g-1，后續(xù)將以此為吸附樹脂考察解析條件與層析條件。

表4 不同樹脂吸附量考察

3.3.2 解析劑乙醇濃度的選擇 選取5 g SZ-3樹脂按照“2.4.2”項(xiàng)下方式處理后，將樹脂平均分成5份，分別用50 mL不同濃度乙醇溶液，在30 ℃下振搖解析4.0 h后過濾，測(cè)定洗脫液中海帶多酚的總量，溶液中多酚含量越高，說明該溶液越能解析海帶多酚。

如圖5所示，20%乙醇即有部分多酚被解析，因此，不宜采用20%乙醇進(jìn)行洗脫雜質(zhì)。乙醇濃度從20%到80%，海帶多酚的解析率逐漸上升，最大時(shí)候解析率為94.29%；當(dāng)乙醇濃度超過80%時(shí)，解析率逐漸下降。因此，選用80%乙醇溶液作為海帶多酚的解析劑。

圖5 乙醇濃度對(duì)多酚靜態(tài)解析的影響

3.3.3 柱層析純化 按照“2.4.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行裝柱，上樣與洗脫，分管收集洗脫液，測(cè)定室溫下乙醇溶液的動(dòng)態(tài)洗脫效果，收集富含多酚的洗脫組分，濃縮，凍干，測(cè)定樣品中多酚含量。

如圖6可以看出，動(dòng)態(tài)解析條件下SZ-3樹脂上吸附的多酚物質(zhì)易被洗脫，多酚物質(zhì)的洗脫高峰也相對(duì)比較集中，當(dāng)采用80%乙醇溶液洗脫，洗脫液體積為80～130 mL時(shí)的海帶多酚含量較高，最高濃度可達(dá)21.03 mg·mL-1。收集多酚含量較高的多酚洗脫液，濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，按照“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定該組分海帶多酚的含量為80%，多酚的回收率達(dá)到75%。

圖6 海帶多酚的動(dòng)態(tài)洗脫曲線

4 討論

海帶多酚是一類主要存在于海帶中的多酚類化合物，主要是以間苯三酚為單元進(jìn)行生物合成得到的低聚物，可發(fā)展成為天然抗氧化劑或食品添加劑，從而提高海帶的綜合利用價(jià)值[13]。與其他多酚類化合物相似，海帶多酚也具有多種藥理活性，包括抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制作用等[13-17]。本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了提取海帶多酚類物質(zhì)的最佳提取工藝條件，即料液比(乙醇∶海帶，mL·g-1)1∶65，乙醇濃度為65%，提取溫度75 ℃，提取時(shí)間1 h。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在該條件下總多酚的一次提取率即可達(dá)到83%，因此，本研究選擇提取1次。通過對(duì)6種層析填料的篩選及層析條件的優(yōu)化，最終確定以SZ-3大孔吸附樹脂為最佳的分離填料，在所建立的層析條件分離獲得海帶多酚純度最高可達(dá)80%。本研究可為進(jìn)一步深入開展對(duì)海帶多酚提取及開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)參考。