徐露， 黃蕭豐， 朱倩男， 陳銳， 史曉青， 徐迎港， 張娓娓， 查小明， 王玨

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]，三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)具有高侵襲性、易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，往往預(yù)后不良[2]。免疫治療的出現(xiàn)，是乳腺癌治療的新突破，程序性死亡受體1(programmed cell death 1，PD-1)及程序性死亡配體1(programmed cell death ligand 1, PD-L1)是目前最有希望的免疫治療策略之一[3]。TNBC具有較高的免疫原性[4]，因此其與PD-1/PD-L1之間的關(guān)系值得我們進(jìn)一步探討。已有研究表明，較高的PD-1/PDL-1表達(dá)和較高的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)可能與更好的臨床預(yù)后及免疫治療獲益相關(guān)[5]。但PD-1表達(dá)情況能否預(yù)測(cè)新輔助化療的療效，相關(guān)臨床研究報(bào)道較少。本文分析了22例接受新輔助化療的TNBC患者腫瘤組織中PD-1表達(dá)情況與患者臨床病理特征及新輔助療效的關(guān)系，以探討PD-1是否能作為預(yù)測(cè)早期TNBC患者新輔助化療療效的標(biāo)記物。

1 資料與方法

1.1 資料 選取南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2012年12月3日至2020年1月20日留存的病理確診為TNBC的乳房穿刺標(biāo)本蠟塊，入組條件為：①18～70周歲女性，生存期或預(yù)計(jì)生存期>12個(gè)月；②局部晚期乳腺癌：腫瘤最長(zhǎng)徑≥3 cm，或腋窩淋巴結(jié)臨床體檢(+)；③粗針穿刺病理學(xué)診斷為單側(cè)浸潤(rùn)性乳腺癌(炎性乳癌除外)；④初診條件可直接進(jìn)行新輔助化療，無(wú)絕對(duì)禁忌證；⑤有明確的穿刺病理學(xué)免疫組化報(bào)告(ER、PR、HER2、Ki67)；⑥IHC檢測(cè)HER2(-)，或HER2(+)，或IHC(++)但FISH檢測(cè)HER2基因無(wú)擴(kuò)增；⑦ER<1%陽(yáng)性、PR<1%陽(yáng)性；⑧在臨床或者影像學(xué)方面均無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)證據(jù)；⑨患者接受新輔助化療后進(jìn)行手術(shù)及輔助化療，新輔助化療方案為EC序貫T；⑩患者在新輔助化療前、中、后各進(jìn)行至少1次乳房MRI及超聲評(píng)估新輔助療效,術(shù)后病理資料包含殘余癌灶大小，MP分級(jí)(Miller Payne分級(jí))和腫瘤分化程度。

排除條件為：①已發(fā)現(xiàn)乳腺癌有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；②接受過(guò)針對(duì)乳腺癌的系統(tǒng)性或局部性治療，包括化療、放療和內(nèi)分泌治療等；③5年內(nèi)有惡性腫瘤病史(可治愈的皮膚基底細(xì)胞癌和宮頸原位癌除外)，包括對(duì)側(cè)乳腺癌；④有精神疾病，認(rèn)知障礙，無(wú)法配合隨訪工作者；⑤無(wú)人身自由及獨(dú)立民事行為能力；⑥研究者判定無(wú)法獲取隨訪數(shù)據(jù)(由于無(wú)法獲得或嚴(yán)重的伴發(fā)疾病等原因)的患者。

1.2 免疫組化染色及結(jié)果分析 取穿刺組織蠟塊切片后，進(jìn)行免疫組化染色：①脫蠟：將載玻片上的蠟塊切片先后置于二甲苯、不同濃度的乙醇中浸泡脫蠟；②抗原修復(fù)：切片脫蠟后用清水沖洗，加入3%過(guò)氧化氫溶液浸泡10 min，再加入檸檬酸緩沖液，微波爐蒸煮2次，冷卻至室溫；③血清封閉：沖洗玻片后，加入血清，封閉非特異性位點(diǎn)，放入37 ℃溫箱孵育30 min；④抗體孵育：玻片上滴一滴PD-1一抗，置于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，次日加一滴二抗，室溫孵育30 min，然后用PBS液清洗3次，每次2 min；⑤DAB顯色：避光配備GENMED顯色工作液，加1滴至玻片上，鋪滿樣品表面，室溫孵育5～30 min，PBS緩沖液浸泡5 s。擦干后蓋上蓋玻片，進(jìn)行甲基綠或蘇木素復(fù)染，脫水后中性樹膠封片。結(jié)果分析：由兩位病理科高年資醫(yī)師閱片，最后綜合閱片結(jié)果，以PD-1表達(dá)≥10%為陽(yáng)性，<10%為陰性(圖1)。

1A:PD-1表達(dá)陰性；1B:PD-1表達(dá)<1%；1C:PD-1表達(dá)1%；1D:PD-1表達(dá)5%，免疫細(xì)胞散在浸潤(rùn)于癌巢及腫瘤間質(zhì)；1E:PD-1表達(dá)10%，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)于腫瘤間質(zhì)；1F:PD-1表達(dá)30%，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)癌巢

1.3 影像學(xué)療效評(píng)估 基線值以患者確診前最后一次乳腺M(fèi)RI報(bào)告數(shù)據(jù)為準(zhǔn)，將患者新輔助化療療程結(jié)束后2周的乳腺M(fèi)RI數(shù)據(jù)與基線值進(jìn)行對(duì)比，采用實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST 1.1)[6]進(jìn)行評(píng)估，療效分為：完全緩解(complete response, CR)，所有病灶消失且無(wú)新病灶出現(xiàn)；部分緩解(partial response, PR)，病灶最大徑之和減少≥30%；病情進(jìn)展(progressive disease, PD)，病灶最大徑之和增加≥20%，或出現(xiàn)新病灶；病情穩(wěn)定(stable disease, SD)，病灶最大徑之和縮小未達(dá)PR，或增大未達(dá)PD。

1.4 病理學(xué)療效評(píng)估 病理學(xué)完全緩解(pathological complete response, pCR)定義為乳腺原發(fā)灶無(wú)浸潤(rùn)癌(可存在導(dǎo)管原位癌)且區(qū)域淋巴結(jié)陰性。Miller-Payne分級(jí)參照《乳腺癌新輔助治療的病理診斷專家共識(shí)(2020版)》[7]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Fisher精確檢驗(yàn)驗(yàn)證TNBC腫瘤組織中PD-1的表達(dá)情況與臨床病理特征及新輔助化療療效間關(guān)系的顯著性；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織中PD-1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 PD-1表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組的患者，其腫瘤長(zhǎng)徑基線值之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PD-1表達(dá)與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征均無(wú)顯著關(guān)系(表1)。

表1 TNBC中PD-1在腫瘤組織中表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.2 腫瘤組織中PD-1表達(dá)與新輔助化療療效的關(guān)系 PD-1陽(yáng)性組的TNBC患者療效優(yōu)于PD-1陰性組：陽(yáng)性組影像學(xué)PR(含CR)率及CR率顯著高于陰性組(P=0.002，P=0.022)；兩組之間影像學(xué)PD率無(wú)顯著差異(P=0.364)。PD-1陽(yáng)性組pCR率高于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031)(表2)。

表2 TNBC中PD-1在腫瘤組織中表達(dá)與新輔助療效的關(guān)系

3 討論

腫瘤組織浸潤(rùn)是影響免疫治療效果及預(yù)后的關(guān)鍵影響因素[8]，而不同個(gè)體的腫瘤微環(huán)境不同，其免疫浸潤(rùn)的類型和程度也不同[9]。PD-1表達(dá)于CD4+和CD8+ T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞(NKT細(xì)胞)和部分樹突狀細(xì)胞(DC)[10]，其與PD-L1間的相互作用是腫瘤細(xì)胞抑制免疫細(xì)胞活性的主要途徑[11]。PD-1可以在某種程度上反映腫瘤微環(huán)境中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)密度[12]，因此也有希望成為預(yù)測(cè)免疫治療是否有效的標(biāo)記物[13]。已有研究證明，高TIL含量的腫瘤患者，更有可能從免疫治療中獲益，患者的預(yù)后及生存期，也較低TIL含量組好[14]。Denkert等[15]報(bào)道，TIL含量越高，新輔助化療療效越好。大量證據(jù)表明，蒽環(huán)類藥物可以通過(guò)增強(qiáng)免疫細(xì)胞功能，利用腫瘤宿主的免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞[16]。有研究報(bào)道，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα(topoisomerase IIα, TOP2A)及17號(hào)染色體著絲粒復(fù)制(chromosome 17 centromeric duplication, Chr17CEP)等可預(yù)測(cè)蒽環(huán)類藥物在TNBC患者中的療效，受限于技術(shù)及成本原因，這在臨床上無(wú)法得到廣泛應(yīng)用[17]。目前關(guān)于PD-1的研究多著眼于免疫治療，PD-1表達(dá)情況能否預(yù)測(cè)TNBC患者新輔助化療的獲益情況，目前缺乏相關(guān)研究。本研究回顧性地分析了22例乳腺癌患者腫瘤組織中PD-1表達(dá)水平與臨床病理特征及新輔助化療療效間的關(guān)系。結(jié)果顯示，PD-1陽(yáng)性組與陰性組患者之間，臨床病理特征并差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；通過(guò)影像學(xué)及術(shù)后病理評(píng)估患者療效后，發(fā)現(xiàn)患者新輔助化療療效組間差異顯著，PD-1陽(yáng)性組的患者新輔助療效顯著優(yōu)于PD-1陰性組患者。其機(jī)制可能為PD-1表達(dá)情況反映了乳腺癌組織中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞數(shù)量，而化療藥物可以通過(guò)激活被腫瘤細(xì)胞抑制的免疫細(xì)胞，通過(guò)腫瘤組織浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞，具體機(jī)制尚需進(jìn)一步的機(jī)制試驗(yàn)證實(shí)。免疫組化染色雖為定性檢測(cè)方法，但其可以觀察檢測(cè)蛋白在腫瘤組織中的空間分布，具有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。若對(duì)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行Western Blot或qPCR等定量檢測(cè)試驗(yàn)，則能進(jìn)一步佐證本文結(jié)論。乳腺癌治療應(yīng)進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)個(gè)體化治療，基于分子表達(dá)情況的不同為患者量身定制的療法充分考慮了腫瘤間的異質(zhì)性，目前正成為新的目標(biāo)和方向[18]。本研究為TNBC的個(gè)體化治療提供了更多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

綜上，早期通過(guò)穿刺病理確認(rèn)病灶的PD-1情況，可能對(duì)新輔助化療方案的決策及療效的判斷有積極意義。本研究為單中心回顧性研究，樣本量有限，無(wú)法進(jìn)行亞組分析，尚需進(jìn)一步研究佐證本文結(jié)論。