孫明宇， 唐傳綱， 曹蘇生

乳腺癌是一種異質(zhì)性較強(qiáng)的疾病，臨床上常根據(jù)雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesteron receptor，PR)及人表皮生長因子受體2(HER-2)表達(dá)情況等免疫組化標(biāo)記，將乳腺癌分為luminal A型、luminal B型、HER-2過表達(dá)型及三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)[1]。其中l(wèi)uminal型乳腺癌是最常見的病理類型，占乳腺癌的65%～75%[2]。乳腺癌預(yù)后較好，早期乳腺癌的5年生存率近90%[3]，但TNBC預(yù)后較差，5年生存率不到30%[4]。然而，即便是預(yù)后較好的luminal型乳腺癌，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，其5年生存率也會(huì)降至約27%[3]。因此，繼續(xù)尋找對(duì)乳腺癌診療安全有效的靶點(diǎn)仍是一項(xiàng)很大的挑戰(zhàn)。

電壓依賴性陰離子通道1(voltage-dependent anion channel 1，VDAC1)屬于VDAC蛋白家族成員，位于線粒體外膜中，在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用[5]。但目前關(guān)于VDAC1在乳腺癌中的作用及其機(jī)制的研究較少。本研究通過對(duì)VDAC1進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析，以期為乳腺癌的診療提供更多的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料收集 從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA，https://portal.gdc.cancer.gov/)中獲取1 197例樣本(1 085例乳腺癌、112例正常對(duì)照)的基因表達(dá)信息和臨床信息。使用每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段數(shù)(fragments per kilobase million，F(xiàn)PKM)對(duì)RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。將1 070例具有有效隨訪數(shù)據(jù)的患者，根據(jù)VDAC1的表達(dá)量分為高表達(dá)組(表達(dá)量中位數(shù)的前50%，535例)與低表達(dá)組(表達(dá)量中位數(shù)的后50%，535例)。共有770例乳腺癌患者具有明確的分期記錄(Ⅰ期：132例，Ⅱ期：444例，Ⅲ期：173例，Ⅳ期：15例，Ⅹ期：6例)。同時(shí)篩選出可配對(duì)的乳腺癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織各82例。

1.2 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，乳腺癌與正常組織中VDAC1的基因表達(dá)差異比較采用t檢驗(yàn)，與其癌旁正常組織中VDAC1的基因表達(dá)差異比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。采用人類蛋白圖譜(human protein atlas，HPA)數(shù)據(jù)庫獲得乳腺癌與正常樣本中VDAC1的蛋白表達(dá)差異。使用受試者工作特征(ROC)曲線分析評(píng)價(jià)VDAC1對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值。采用Kaplan-Meier方法評(píng)估VDAC1對(duì)乳腺癌預(yù)后的評(píng)估價(jià)值。采用基因表達(dá)譜交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA，http://gepia.cancer-pku.cn/)VDAC1與乳腺癌臨床分期的相關(guān)性。采用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(http://www.linkedomics.org/)獲取VDAC1的共表達(dá)基因?；虮倔w(gene ontology，GO)分析包括生物學(xué)過程(biological process, BP)、細(xì)胞定位(cellular component, CC)及分子功能(molecular function, MF)。GO分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析采用gProfileR(版本0.6.434)進(jìn)行。采用TIMER 2.0(http://timer.cistrome.org/)對(duì)VDAC1相關(guān)的免疫浸潤水平進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中VDAC1的表達(dá)量及其臨床意義 乳腺癌組織的VDAC1 mRNA表達(dá)量明顯高于正常組織(圖1A，P<0.001)。乳腺癌組織的VDAC1 mRNA表達(dá)量高于其癌旁正常組織(圖1B，P<0.05)。免疫組化結(jié)果顯示，乳腺癌組織的VDAC1蛋白表達(dá)水平也顯著高于正常組織(圖1C、1D)。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，VDAC1的曲線下面積(AUC)為0.843(圖1E，P<0.001)。Kaplan-Meier生存分析表明，VDAC1高表達(dá)組的總生存期顯著低于VDAC1低表達(dá)組(P<0.001，圖1F)。

1A：乳腺癌組織與正常組織中VDAC1 mRNA表達(dá)水平比較； 1B：乳腺癌組織與其癌旁組織中VDAC1 mRNA表達(dá)水平比較； 1C：正常組織中VDAC1蛋白表達(dá)； 1D：乳腺癌組織中VDAC1蛋白表達(dá)； 1E.ROC曲線分析VDAC1對(duì)乳腺癌的診斷效能； 1F：Kaplan-Meier生存分析VDAC1高表達(dá)組與低表達(dá)組的總生存期情況

2.2 VDAC1表達(dá)量與臨床分期的相關(guān)性及與VDAC1共表達(dá)的基因 VDAC1表達(dá)量與臨床分期無相關(guān)性(P=0.541，圖2A)。本研究還分析了與VDAC1共表達(dá)基因(圖2B)。呈正相關(guān)的前10個(gè)基因是H2AFY、HAPA9、PPP2CA、UBE2D2、TBCA、SRP19、HNRNPAB、NPM1、MRPL13及TCEB1(圖2C)。呈負(fù)相關(guān)的前10個(gè)基因是KIAA0467、POU6F1、CBX7、CLCN6、LTBP3、SHANK3、KIAA1274、PTCH2、INPP5B及WDR81(圖2D)。

2A:VDAC1表達(dá)量與臨床分期的相關(guān)性； 2B:與VDAC1共表達(dá)基因的火山圖； 2C:正相關(guān)的共表達(dá)基因熱圖； 2D:負(fù)相關(guān)的共表達(dá)基因熱圖

2.3 GO和KEGG分析 取與VDAC1正相關(guān)的前50個(gè)基因進(jìn)行GO分析，結(jié)果顯示，前5個(gè)BP條目分別為泛素依賴的蛋白質(zhì)分解代謝過程(ubiquitin-dependent protein catabolic process)、參與有絲分裂細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換的泛素蛋白連接酶活性的正調(diào)控(positive regulation of ubiquitin-protein ligase activity involved in regulation of mitotic cell cycle transition)，參與有絲分裂細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換的泛素蛋白連接酶活性的負(fù)調(diào)控(negative regulation of ubiquitin-protein ligase activity involved in mitotic cell cycle)、刺激C型凝集素受體信號(hào)通路(stimulatory C-type lectin receptor signaling pathway)和蛋白折疊(protein folding)(圖3A)。前5個(gè)CC條目分別為外泌體(extracellular exosome)、胞漿(cytosol)、核質(zhì)(nucleoplasm)、髓鞘(myelin sheath)和細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)(圖3B)。前5個(gè)MF條目分別為未折疊蛋白結(jié)合(unfolded protein binding)、poly(A)RNA結(jié)合[poly(A) RNA binding]、泛素蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin protein ligase binding)、蛋白結(jié)合(protein binding)和伴侶綁定(chaperone binding)(圖3C)。前5個(gè)KEGG富集通路包括蛋白酶體(proteasome)、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂(oocyte meiosis)、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解(ubiquitin mediated proteolysis)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工(protein processing in endoplasmic reticulum)和細(xì)胞周期(cell cycle)(圖3D)。

3A:BP分析； 3B:CC分析； 3C:MF分析； 3D:KEGG分析

2.4 VDAC1與免疫浸潤的關(guān)系 VDAC1表達(dá)與CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)ρ=0.121、0.174，P<0.001)；與CD4+T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(ρ=-0.286、-0.194，P<0.001)；與B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞無顯著相關(guān)性(ρ=0.035、0.033，P>0.05)，見圖4。

4A:VDAC1與CD4+T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)； 4B:VDAC1與CD8+T細(xì)胞呈正相關(guān)； 4C:VDAC1與B細(xì)胞無顯著相關(guān)性；4D:VDAC1與中性粒細(xì)胞無顯著相關(guān)性； 4E:VDAC1與巨噬細(xì)胞呈正相關(guān)； 4F: VDAC1與樹突狀細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)

3 討論

VDAC1作為線粒體外膜的守門人，在多種生理及病理過程中起著重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道，VDAC1在肝癌[6]、肺癌[7]、子宮內(nèi)膜癌[8]及乳腺癌[9]等多種癌癥中也扮演著重要的角色，其功能主要集中在能量及代謝的重編程和凋亡細(xì)胞死亡逃避等[10]。Yang等[9]發(fā)現(xiàn)溴氰菊酯抑制劑(JQ1)可降低乳腺癌中組織VDAC1的表達(dá)，同時(shí)VDAC1也可能參與了乳腺癌對(duì)JQ1的耐藥性。Azeez等[11]發(fā)現(xiàn)VDAC1和SERCA3參與介導(dǎo)孕酮觸發(fā)的乳腺癌細(xì)胞鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，從而影響癌細(xì)胞的增殖活性。Shteinfer-Kuzmine等[10]以VDAC1為基礎(chǔ)構(gòu)建了一種肽段，在乳腺癌的小鼠模型中，該肽段可抑制腫瘤生長，這為VDAC1成為治療乳腺癌的潛在靶點(diǎn)提供了新思路。本研究利用各種生物信息學(xué)方法全面分析了VDAC1在乳腺癌診療中的價(jià)值及其可能的作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中VDAC1的基因和蛋白水平均高表達(dá)，且與乳腺癌的預(yù)后不良密切相關(guān)。ROC曲線分析表明VDAC1具有良好的診斷價(jià)值，提示VDAC1可能是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。靶向VDAC1的藥物研發(fā)在多種癌癥中已經(jīng)有所進(jìn)展。Seo等[12]利用Arg225、Arg236及Gln241將線粒體裂變因子MFF插入VDAC1的內(nèi)孔中，形成MFF-VDAC1復(fù)合物，該復(fù)合物在乳腺癌、肺腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等臨床前模型中均顯示出一定的抗癌作用。Arif等[13]用siRNA來降低VDAC1的表達(dá)，可導(dǎo)致包括TNBC在內(nèi)的腫瘤細(xì)胞代謝重編程、增殖減少，甚至分化為惡性程度較低的腫瘤細(xì)胞。韓國學(xué)者從當(dāng)歸中提取出順式甲殼酮，體外實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有抗癌作用[14]。順式甲殼酮的抗癌機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)凋亡因子BAX和BAK易位到線粒體及VDAC1的過度表達(dá)，加速線粒體膜電位破壞并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這些研究為以VDAC1為靶點(diǎn)的藥物進(jìn)入臨床提供了新的理論依據(jù)。

VDAC1通過與凋亡調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白[如己糖激酶HK、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)及B細(xì)胞淋巴瘤-xL(B cell lymphoma-xL，Bcl-xL)]相互作用來調(diào)節(jié)凋亡過程[15]。而且，還有研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-xL與VDAC1相互作用還可影響乳腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲過程[16]。通過對(duì)轉(zhuǎn)移性前列腺癌及乳腺癌細(xì)胞的RNA轉(zhuǎn)錄組芯片分析發(fā)現(xiàn)，干擾鞘氨醇激酶(SK1、SK2)的表達(dá)會(huì)引起包括VDAC1在內(nèi)的多個(gè)基因表達(dá)水平上調(diào)，并導(dǎo)致多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)異常[17]。表明VDAC1可能成為轉(zhuǎn)移性乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。

本研究還發(fā)現(xiàn)VDAC1的表達(dá)和CD8+T細(xì)胞浸潤水平呈正相關(guān)，而與CD4+T細(xì)胞浸潤水平呈負(fù)相關(guān)，提示VDAC1有可能在乳腺癌免疫治療中起著重要作用，但這方面的研究目前幾乎處于空白狀態(tài)。Rimmerman等[18]報(bào)道卡納比多醇(CBD)可抑制VDAC1的表達(dá)，其機(jī)制可能與CBD的免疫抑制作用有關(guān)。

本研究利用TCGA高通量測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)VDAC1進(jìn)行了全面的分析，發(fā)現(xiàn)VDAC1在乳腺癌中高表達(dá)，發(fā)揮促癌作用。但本研究也有一定的局限性。首先，本研究缺乏外部數(shù)據(jù)驗(yàn)證。第二，TCGA提供的mRNA數(shù)據(jù)是腫瘤內(nèi)部所有細(xì)胞mRNA表達(dá)水平的平均值。乳腺癌是一種異質(zhì)性很強(qiáng)的疾病，需要單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)一步探索VDAC1在乳腺癌中的作用及機(jī)制。第三，其他的一些常見分子事件(如拷貝數(shù)變異、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性及甲基化等)未納入分析中，這些分子事件對(duì)更深入理解VDAC1在乳腺癌中的作用也會(huì)有一定幫助。