嚴(yán)英慈， 禹立霞， 涂云霞， 王春， 王欣玥， 劉寶瑞， 李茹恬

腹腔積液常見(jiàn)于晚期肝癌患者，臨床上易導(dǎo)致腹脹、腹痛等不適，甚至壓迫周?chē)鞴僖鸷粑щy、惡心嘔吐、血壓下降等癥狀，極大程度影響患者生存質(zhì)量，更甚者威脅患者生命。腹腔化療為抑制腹腔積液癌性擴(kuò)散的主要治療方式之一，其將藥物與腹腔直接接觸，加強(qiáng)了病灶局部與血液對(duì)藥物的吸收，然而由于化療藥物本身毒性及短時(shí)間內(nèi)高濃度的吸收，常導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生，因此亟需維持藥物療效并延緩藥物吸收的方法應(yīng)用。

漢防己甲素(Tetrandrine, Tet)是一種提取自中草藥粉防己根塊的雙芐基異喹啉類生物堿。以往研究發(fā)現(xiàn)，Tet可通過(guò)直接細(xì)胞毒作用[1]、逆轉(zhuǎn)耐藥[2]、誘導(dǎo)凋亡[3]、抑制增殖[4]、協(xié)同放化療[5-6]等機(jī)制抵抗腫瘤進(jìn)展。但Tet的疏水性與局部刺激性極大程度地阻礙了其臨床應(yīng)用。隨著藥物投遞系統(tǒng)的發(fā)展，其在抗腫瘤治療中的應(yīng)用也日益受到關(guān)注。納米粒子作為載體，不僅可以增加疏水性抗腫瘤藥物的投遞效率，還可以增強(qiáng)投遞的靶向性，進(jìn)而改善藥物的分布與代謝，降低不良反應(yīng)，提高療效[7-8]。在前期工作中，本課題組已實(shí)現(xiàn)負(fù)載Tet納米載體的建立與表征，確定了最佳配比[9-10]，同時(shí)通過(guò)HDRA模型、凋亡等方式驗(yàn)證其體外抗腫瘤活性[11-12]。在此研究基礎(chǔ)上，本研究將進(jìn)一步探討負(fù)載Tet的高分子納米粒子載體經(jīng)由腹腔給藥模式對(duì)體內(nèi)癌性腹腔積液的控制效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品與試劑 Tet購(gòu)自江西億博醫(yī)藥公司，ε-己內(nèi)酯(ε-caprolactone，ε-CL)購(gòu)自美國(guó)Fluka公司，使用前用CaH2干燥后減壓蒸餾；聚乙二醇(methoxypolyethylene glycol，mPEG)購(gòu)自南京威爾化工公司。

1.1.2 瘤株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 鼠肝癌細(xì)胞株H22購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。15只SPF級(jí)雄性ICR小鼠(7周齡，體質(zhì)量24～38 g)購(gòu)自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 負(fù)載Tet的甲氧基聚乙二醇-聚己內(nèi)酯(mPEG-PCL)納米粒子制備與表征 采用開(kāi)環(huán)聚合法制備mPEG-PCL嵌段聚合物[10]。在裝有適量mPEG的聚合管中加入ε-CL及0.1%(w/w)的辛酸亞錫。真空下封管，置于130 ℃油浴反應(yīng)48 h。反應(yīng)所得到的粗產(chǎn)物用二氯甲烷(DCM)溶解后，沉淀于大量無(wú)水乙醚中，以除去未反應(yīng)單體及其他低分子量物質(zhì)，收集沉淀并洗滌數(shù)次后減壓干燥，得到mPEG-PCL嵌段聚合物。采用乳化-揮發(fā)法制備Tet載藥粒子[11]。將Tet與mPEG-PCL載體20 mg共溶于1 ml DCM中作為有機(jī)相，滴入3 ml 5%聚乙烯醇(PVA)溶液中，進(jìn)行超聲(17.5 W，30 s)，將所得的O/W乳劑進(jìn)一步分散在8 ml 1%PVA溶液中，室溫下攪拌2 h。將得到的液體用慢速濾紙過(guò)濾，去除可能存在的Tet沉淀后，采用超高速離心機(jī)以50 000 ×g的加速度離心30 min后，棄去上清，再將粒子重新分散于純水中，上述液體按3%(w/w)的比例加入甘露醇后冷凍干燥72 h，避光貯存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 腫瘤模型的建立與處理方法 將15只小鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組4只(予生理鹽水0.5 ml)、Tet裸藥組3只(予Tet 10 mg/kg)、空白納米粒子組4只(予mPEG-PCL 5 mg/只)及Tet納米粒子組4只(Tet 10 mg/kg+ mPEG-PCL 5 mg/只)。每只小鼠腹腔注射H22細(xì)胞(4～6)×106，并于第2天開(kāi)始給藥，每天觀察并記錄小鼠腹圍、體重及生存情況，連續(xù)觀察7 d。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組比較采用方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 給藥后不同時(shí)間各組小鼠腹圍比較

給藥后第6、7天，Tet納米粒子組小鼠腹圍小于Tet裸藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 給藥后不同時(shí)間各組小鼠腹圍比較

2.2 給藥后不同時(shí)間各組小鼠體重比較

給藥前，各組小鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥后，Tet裸藥組體重大于對(duì)照組，空白納米粒子組與Tet納米粒子組體重小于Tet裸藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 給藥后不同時(shí)間各組小鼠體重比較

2.3 生存情況

截至第7天實(shí)驗(yàn)結(jié)束，對(duì)照組僅存1只小鼠，其他3組均剩3只小鼠。

3 討論

化療為腫瘤治療的常規(guī)方法之一，主要利用藥物殺滅局部及全身的腫瘤細(xì)胞，然而，隨血液播散的藥物往往因其自身的細(xì)胞毒性而帶來(lái)極大的不良反應(yīng)。腹腔化療雖然能更有效地接觸腹腔病灶并抑制其轉(zhuǎn)移，卻常因腹膜短期內(nèi)吸收大量藥物而加重化療藥物的毒性作用。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的結(jié)合使許多中藥的有效成分得以被鑒定并純化，進(jìn)而拓展其應(yīng)用范圍[13-14]。Tet是中藥粉防己的單體，研究發(fā)現(xiàn)，Tet具有直接抑制腫瘤生長(zhǎng)、放療增敏、逆轉(zhuǎn)耐藥及減輕放化療不良反應(yīng)等作用[6]。自上世紀(jì)末以來(lái)，納米技術(shù)的迅速發(fā)展不僅促進(jìn)了惡性腫瘤的早期診斷，因其代謝特點(diǎn)，更降低了化療的不良反應(yīng)。

前期研究表明，負(fù)載Tet的兩嵌段mPEG-PCL納米粒子能改善Tet水溶性差、局部刺激性強(qiáng)等問(wèn)題，從而在體內(nèi)達(dá)到緩釋效果[9-11,15]。本研究為探討其在生物體內(nèi)的作用效果，結(jié)果顯示，Tet納米粒子組小鼠的腹圍小于Tet裸藥組及對(duì)照組，提示Tet有抑制腹腔積液瘤的作用，且應(yīng)用納米粒子可促進(jìn)療效發(fā)揮；空白納米粒子組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示納米粒子無(wú)潛在促腫瘤生長(zhǎng)的作用。此外，瘤內(nèi)給藥由于組織間壓力較大，pH值與正常組織相近，加之腹腔積液瘤結(jié)構(gòu)松散，均可導(dǎo)致納米粒子的優(yōu)勢(shì)難以體現(xiàn)。依據(jù)小鼠生存情況，Tet裸藥組與Tet納米粒子組的生存情況優(yōu)于對(duì)照組，也提示Tet具有明顯的抗腫瘤療效。

綜上所述，負(fù)載Tet的兩嵌段高分子納米粒子具有良好的生物體內(nèi)抗腫瘤作用，然而由于各組小鼠樣本數(shù)量較小，中期小鼠死亡對(duì)結(jié)果的影響較大，故其作用機(jī)制與生物相容性有待加大樣本量深入研究。