李亞萍，翟 嵩，王 媛，鄧 江，吳鳳萍，王沐淇，賈曉黎，李 梅，黨雙鎖

有證據(jù)表明，脂肪酸是誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)發(fā)生的重要因素[1-3]。過氧化物酶體增殖激活受體共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor coactivator 1α, PGC1α)參與了線粒體生物合成和線粒體氧化應(yīng)激。在能量需求的情況下，這種核蛋白輔助轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控了電子傳遞鏈、脂肪酸氧化、三羧酸循環(huán)和活性氧(reactive oxygen species, ROS)清除等一系列蛋白的表達(dá)過程。PGC1α也通過抑制核因子 κB(nuclear factor κB，NF-κB)參與了炎癥反應(yīng)的調(diào)控[4]。NAFLD患者肝臟PGC1α表達(dá)下降了40%，同時伴有線粒體功能異常、脂肪堆積和胰島素抵抗[5，6]。小鼠肝組織脂肪含量與肝組織PGC1α表達(dá)呈正相關(guān)。在特異性敲除PGC1α小鼠，肝臟脂肪酸氧化顯著降低，但卻增加了胰島素抵抗。PGC1α被認(rèn)為是糖尿病和肥胖癥重要的治療靶點[7]。咖啡酸苯乙基酯(caffeic acid phenethyl ester，CAPE)是來源于蜜蜂蜂巢的一種酚類化合物，在腫瘤、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和免疫調(diào)節(jié)等方面都具有重要的保護(hù)作用[8]。CAPE能夠改善胰島素抵抗和脂肪肝形成，從而能夠促進(jìn)減重[9，10]。本研究采用棕櫚酸酯處理L02肝細(xì)胞系建立脂肪堆積肝細(xì)胞模型，主要目的是探討CAPE是否通過調(diào)控PGC1α表達(dá)發(fā)揮其抑制NAFLD形成的作用。通過研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)PGC1α信號通路，CAPE對棕櫚酸酯誘導(dǎo)的肝臟L02細(xì)胞脂毒性具有有效的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 L02人正常肝細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞公司； CAPE(Sigma公司)；棕櫚酸酯(Sigma公司)；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、 2× Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)；過氧化物歧化酶2(superoxide dismutase2, SOD2)、PGC1α和β-actin 的Real-time PCR 引物由北京擎科生物科技有限公司合成；檢測腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素6(interleukin-6，IL-6)的ELISA試劑盒( R&D公司)；Mito-SOX Red購自Invitrogen公司； 抗PGC1α抗體(CST公司)；抗Tubulin 抗體(Sigma公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗、蛋白Marker、BCA蛋白定量試劑盒、化學(xué)發(fā)光液和甘油三酯(triglyceride, TG)檢測試劑均購自美國Thermo公司；PGC1α shRNA和空載體慢病毒(西安天遇成生物科技有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 在10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基，37°C、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)L02人源正常肝細(xì)胞和PGC1α敲減細(xì)胞系。這兩種細(xì)胞分別設(shè)立高糖DMEM對照組、棕櫚酸酯處理組(棕櫚酸酯終濃度300 mM)、CAPE(CAPE終濃度10 μM)聯(lián)合棕櫚酸酯(棕櫚酸酯終濃度300 mM)處理組，加入棕櫚酸酯或棕櫚酸酯聯(lián)合CAPE培養(yǎng)細(xì)胞7 d。

1.3 PGC1α shRNA敲減細(xì)胞系的建立 PGC1α shRNA序列為5′-ATGACAGCTACGAGGAATAT-3′。接種野生型L02細(xì)胞于六孔板，待細(xì)胞50%融合時，按照MOI=80感染慢病毒，48 h后加入嘌呤霉素(puromycin)8 μg/ml，篩選2～3 d，后換正常完全培養(yǎng)基繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞TG含量檢測 待細(xì)胞90%以上融合時，收集細(xì)胞，采用RIPA細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司)裂解細(xì)胞，10000 r/m離心15 min，取上清。用BCA蛋白定量試劑盒測蛋白含量。檢測細(xì)胞上清TG含量。取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，檢測細(xì)胞因子水平。

1.5 線粒體ROS檢測 使用MitoSOXTMRed Mitochondrial Superoxide Indicator 試劑盒(Thermo，美國)檢測線粒體ROS水平。用5 μM MitoSOXTM試劑孵育細(xì)胞，37°C孵育15 min。PBS洗滌細(xì)胞2次，胰酶消化，收集細(xì)胞。在流式細(xì)胞儀(BD Accuri C6 Plus型，美國)檢測平均紅色熒光值。

1.6 細(xì)胞mRNA水平檢測 采用qPCR定量檢測，提取細(xì)胞總 RNA，取RNA 1 μg，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；PCR引物: SOD2上游引物為5′-CCCTGGAACCTCACATCAAC-3′，下游引物為5′-GGTGACGTTCAGGTTGTT

CA-3′； PGC1α 上游引物為5′- CCTTGCAGCACAAGAAAACA -3′，下游引物為5′- TGACCGAAGTGCTTGTTCAG -3′；β-actin上 游 引 物 為 5′-CCTGTATGCCTCTGGTCGTA-3′，下 游 引 物 為 5 ′ -CCATCTCTTGCTCGAAGTCT-3 ′。采用 2- △△Ct法，以 β-actin 為參照，計算mRNA相對水平。各組實驗數(shù)據(jù)均獨立重復(fù)3次，取均值。

1.7 細(xì)胞 PGC1α蛋白表達(dá)檢測 采用Western-blot法，取細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取蛋白。取蛋白20 μg上樣， 200 v電泳1 h，半干轉(zhuǎn)膜20 min， 加牛奶封閉液室溫封閉2 h；加入一抗，4°C搖床孵育過夜；用TBST 洗膜5 min，共4 次。加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫?fù)u床孵育 1 h；用TBST 洗膜5 min，4 次。加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，在BioRad凝膠成像儀上成像，采用Image Lab 3.0軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞TG、TNF-α和IL-6水平比較 棕櫚酸酯處理組L02細(xì)胞TG含量為(16.9±1.4)mg/g protein，顯著高于對照組[(4.92±0.48)mg/g protein，P<0.05]，棕櫚酸酯與CAPE聯(lián)合處理組細(xì)胞TG含量為(10.5±0.8)mg/g protein，顯著低于棕櫚酸酯處理組(P<0.05)；棕櫚酸酯處理組細(xì)胞上清TNF-α和IL-6水平分別為(117.6±3.72)pg/ml和(67.9±2.7)pg/ml，顯著高于對照組[分別為(49.49±1.70)pg/ml和(45.19±1.96)pg/ml，P<0.05]，棕櫚酸酯與CAPE聯(lián)合處理組TNF-α和IL-6水平分別為(74.88±3.37)pg/ml和(53.94±2.39)pg/ml，顯著低于棕櫚酸酯處理組(P<0.05)。

2.2 各組細(xì)胞線粒體ROS、SOD2和PGC1α mRNA水平以及PGC1α蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比，棕櫚酸酯處理組細(xì)胞線粒體ROS水平為(1.7±0.06)，顯著高于對照組(P<0.05)，而棕櫚酸酯與CAPE聯(lián)合處理組細(xì)胞線粒體ROS水平為(1.36±0.04)，顯著低于棕櫚酸酯處理組(P<0.05，圖1A)；棕櫚酸酯處理組SOD2和PGC1α mRNA分別為(0.55±0.05)和(0.57±0.03)，均顯著低于對照組(P<0.05)，棕櫚酸酯與CAPE聯(lián)合處理組分別為(0.76±0.03)和(0.73±0.04)，均顯著高于棕櫚酸酯處理組(P<0.05，圖1B和2C)；棕櫚酸酯處理組PGC1α蛋白表達(dá)顯著低于對照組，而棕櫚酸酯與CAPE聯(lián)合處理組PGC1α蛋白表達(dá)顯著高于棕櫚酸酯處理組(圖1D)。

圖1 各組細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS、SOD2和PGC1α mRNA以及蛋白表達(dá)水平比較與對照組比，*P < 0.05；與棕櫚酸酯組比，#P < 0.05

2.3 各組PGC1α敲除細(xì)胞TG、TNF-α、IL-6和線粒體ROS水平比較 成功建立PGC1α敲減的L02細(xì)胞系，檢測發(fā)現(xiàn)，PGC1α敲除后棕櫚酸酯處理組TG含量為(25.86±1.02)mg/g protein，顯著高于對照組[(6.3±0.75)mg/g protein，P<0.05]，而棕櫚酸酯與CAPE聯(lián)合處理組TG含量為(23.73±1.95)mg/g protein，與棕櫚酸酯處理組無顯著性差異；棕櫚酸酯處理組細(xì)胞上清TNF-α和IL-6水平分別為(145.78±5.79)pg/ml和(87.23±4.85)pg/ml，顯著高于對照組[分別為(59.76±4.67)pg/ml和(54.23±4.76)pg/ml，P<0.05]，而棕櫚酸酯與CAPE聯(lián)合處理組分別為(128.33±4.41)pg/ml和(80.33±3.76)pg/ml，與棕櫚酸酯處理組比較無顯著性差異；棕櫚酸酯處理組線粒體ROS水平為(2.05±0.14)，較對照組的(1.23±0.08，P<0.05)顯著增加，而棕櫚酸酯與CAPE聯(lián)合處理組為(1.83±0.25)，與棕櫚酸酯處理組比較無顯著性差異。

3 討論

CAPE是一種研究比較廣泛的抗氧化劑[11]。多個研究發(fā)現(xiàn)，通過抗氧化作用，CAPE能夠緩解包括糖尿病、脂肪肝在內(nèi)的多種代謝性疾病[12-14]。但是，對于脂肪堆積導(dǎo)致的細(xì)胞脂毒性，CAPE是否具有保護(hù)作用及其作用機(jī)制并不清楚。在肝細(xì)胞中堆積的脂肪導(dǎo)致的脂毒性對于NAFLD的發(fā)展過程具有重要的作用。因此，我們在肝細(xì)胞系首次研究了CAPE對于游離脂肪酸誘導(dǎo)的脂毒性的作用。我們發(fā)現(xiàn)CAPE能夠有效抑制棕櫚酸酯誘導(dǎo)的細(xì)胞脂毒性。CAPE抑制了棕櫚酸酯處理導(dǎo)致的TG含量增加，降低了細(xì)胞促炎因子TNF-α和IL-6的產(chǎn)生，降低細(xì)胞線粒體ROS水平。我們進(jìn)一步證明了CAPE主要是通過PGC1α通路促進(jìn)SOD2表達(dá)，改善線粒體氧化應(yīng)激，并最終改善細(xì)胞脂毒性。

PGC1α是能量代謝的調(diào)控因子，調(diào)控線粒體生物合成、氧化呼吸和葡萄糖產(chǎn)生等。PGC1α的主要功能就是對線粒體ROS的解毒作用，從而增強(qiáng)線粒體功能[15，16]。運動、低溫和饑餓等都是刺激PGC1α表達(dá)的物理因素[17，18]。最新研究表明，PGC1α介導(dǎo)了棕櫚酸酯在脂代謝中的作用。棕櫚酸酯主要是通過ERK和NF-NB通路[21]顯著降低骨骼肌C2C12細(xì)胞PGC1α mRNA水平。本研究發(fā)現(xiàn)，在L02細(xì)胞，棕櫚酸酯誘導(dǎo)PGC1α表達(dá)和線粒體抗氧化酶SOD2表達(dá)下降，同時伴隨有線粒體ROS增加，炎癥因子表達(dá)增加的脂毒性特征。給予CAPE處理能夠顯著逆轉(zhuǎn)這一脂毒性改變。PGC1α敲除在很大程度上削弱了CAPE的治療作用，提示CAPE是通過PGC1α通路改善線粒體功能和細(xì)胞脂毒性。

在脂肪細(xì)胞，CAPE處理能夠誘導(dǎo)脂肪合成，并以TG的形式儲存于脂肪細(xì)胞，抑制其分解，具有降低血脂的作用。在肝細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)CAPE處理抑制了TG的合成，減少細(xì)胞脂質(zhì)累積。