趙龍妹，陳 林，杜東曉，董惠心，李 旺，李元曉，何萬領(lǐng)，曹平華

（河南科技大學動物科技學院，河南洛陽 471000）

0 引言

纖維素是陸地環(huán)境中光合作用的初級產(chǎn)物，也是生物圈中最豐富的可再生生物資源[1-3]。纖維素是由葡萄糖單元通過β-1,4糖苷鍵連接而成的線性均聚物，它是木質(zhì)纖維類物質(zhì)中最重要的多聚物，與半纖維素、木質(zhì)素共同構(gòu)成木質(zhì)纖維類物質(zhì)[4]。在所有種類的植物生物質(zhì)中，木質(zhì)纖維類物質(zhì)由于其大量可獲取、低成本和環(huán)保性，非常適合用于能量供應[5-6]，而酶解植物中的碳水化合物已經(jīng)成為生物質(zhì)發(fā)酵小分子化和能源化過程中最重要的技術(shù)[7-9]。自然界中植物、動物和微生物均能夠產(chǎn)酶，微生物來源的酶因其易于獲取和大規(guī)模生產(chǎn)而得到廣泛的關(guān)注和研究。真菌所產(chǎn)酶種類多，產(chǎn)量高，但生產(chǎn)周期較長，且可能會產(chǎn)生霉味，細菌中的芽孢桿菌所產(chǎn)酶的種類也較多[10]，除了蛋白酶和淀粉酶之外，芽孢桿菌還可分泌纖維素酶[11-12]、木聚糖酶[13]等木質(zhì)纖維降解酶以及具備特殊功能的酶如低溫酶[14]，此外芽孢桿菌生產(chǎn)周期短，工業(yè)能耗低，因此，篩選獲取產(chǎn)酶細菌已成為功能微生物研究的熱點。本研究擬通過平板法和酶活測定法，從玉米田土壤中篩選獲取產(chǎn)纖維素酶細菌，利用形態(tài)學和分子生物學法對其進行鑒定，并分析該菌的生長規(guī)律和產(chǎn)酶規(guī)律，研究所產(chǎn)酶的酶學特性，以期為新型飼料添加劑的研發(fā)及非常規(guī)飼料資源的利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 篩菌樣品

采集于河南省洛陽市河南科技大學校園內(nèi)玉米田地土壤，琴湖水樣。

1.2 主要儀器和設備

立式高壓蒸汽滅菌鍋（型號：LDZX-50KBS）購于上海申安醫(yī)療器械廠；雙人單面超凈工作臺（型號為SW-CJ-2FD）購于蘇州凈化設備有限公司；生物顯微鏡（型號為CX31）購于奧林巴斯有限公司；高速臺式離心機(TGL-16B)購于上海安亭科學儀器廠；酶標儀(ReadMax 1000F)購于上海閃譜生物科技有限公司。

1.3 主要試劑和培養(yǎng)基

1.3.1 主要試劑 蛋白胨購于北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；葡萄糖、瓊脂粉等均購于天津市科密歐化學試劑有限公司；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、氯化鈉等均購于國藥集團化學試劑有限公司。DNS試劑的配置參考Miller等[15]的方法。

1.3.2 篩選培養(yǎng)基 CMC-Na 10 g，K2HPO41.31 g，NaNO33 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，加蒸餾水至1000 mL，pH 6.5，在121℃，0.11 MPa條件下滅菌20～25 min，冷卻后使用。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 蛋白胨10 g，酵母粉0.5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 10 g，加蒸餾水至1000 mL，pH 6.5，在121℃，0.11 MPa條件下滅菌20～25 min，冷卻后使用。

1.3.4 固體培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基在上述培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加2.3%的瓊脂粉，按照上述條件配制后，在121℃，0.11 MPa條件下滅菌20～25 min，冷卻至常溫或制備平板后接種使用。

1.4 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

稱取0.5 g樣品，溶于50 mL無菌水中，置于搖床中200 r/min振蕩4～6 h后取1 mL樣品進行梯度稀釋，取適度稀釋的樣品50 μL涂布于篩選培養(yǎng)基固體平板上，30℃條件下培養(yǎng)1～3天，直至長出單菌落。挑取生長情況良好的單菌落點接種于篩選培養(yǎng)基固體平板上，待菌落長出后，使用1 mg/mL剛果紅對平板染色2 h，然后使用1 mol/L NaCl溶液洗脫1 h直至出現(xiàn)清晰透明圈，觀察菌株周圍透明圈情況，確定產(chǎn)纖維素酶菌株，并進行后續(xù)研究。

1.5 菌株的鑒定

觀察固體平板上菌落的形態(tài)，革蘭氏染色后進行鏡檢，觀察菌體的形態(tài)特征，進行初步鑒定。利用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取菌株的基因組，以基因組為模板，使用引物進行PCR獲取16S rDNA序列，經(jīng)生工生物工程股份有限公司測序后，將序列信息在NCBI網(wǎng)站上(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行比對分析，并使用MEGA X軟件通過鄰接法(Neighbor-Joining Method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對菌株進行鑒定。

1.6 菌株所產(chǎn)纖維素酶的酶學特性分析

1.6.1 粗酶液的制備和酶活力的測定

（1）粗酶液的制備：挑取單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min培養(yǎng)16 h，將發(fā)酵菌液12000 r/min離心5 min，上清即為粗酶液。

（2）酶活力的測定：以羧甲基纖維素鈉作為底物，使用DNS法[15]測定反應后還原糖的含量，計算酶活力大小。纖維素酶活力的定義：在一定溫度和pH下，每分鐘水解1%羧甲基纖維素鈉生成1 μmol還原糖所需的酶量為一個酶活單位(U)。

1.6.2 溫度對酶活力的影響 在一定pH下，分別將粗酶液與底物溶液在30、40、50、60、70、80℃條件下反應，測定酶活力大小，分析溫度對纖維素酶活力的影響。

1.6.3 pH對酶活力的影響 在一定溫度條件下，分別測定粗酶液在pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9、pH 10條件下的酶活力，分析酸堿度對纖維素酶活力的影響。

1.6.4 耐熱性分析 分別將粗酶液在80℃條件下處理10、20、30、40、50、60 min，然后測定粗酶液的殘余酶活力大小，分析該纖維素酶的耐熱性。

1.6.5 耐堿性分析 分別將粗酶液在pH 10的條件下處理10、20、30、40、50、60 min，然后測定粗酶液殘余酶活力大小，分析堿性環(huán)境對該纖維素酶活力的影響。

1.6.6 不同金屬離子對酶活力的影響 向粗酶液中加入終濃度為0.1 mol/L的Na+、Mg2+、Ca2+、K+和Mn2+金屬離子鹽溶液，測定纖維素酶活力，分析不同金屬離子對酶活力的影響。

1.6.7 菌株生長規(guī)律和產(chǎn)酶情況的分析 挑取單菌落接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min過夜培養(yǎng)，制備種子液，將種子液以1%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣一次，分別測定菌液在波長600 nm下的吸光度和上清液的纖維素酶活力，分析該菌的生長情況和產(chǎn)酶規(guī)律。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

挑取篩選培養(yǎng)基平板上長出的單菌落再次接種篩選固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至菌落長出，經(jīng)過剛果紅染色并脫色后，如圖1所示，可見菌落XT2周圍產(chǎn)生明顯透明圈，判斷該菌可產(chǎn)纖維素酶，而且XT2菌株為細菌，因此對其進行后續(xù)分析研究。

圖1 剛果紅染色后菌落周圍的透明圈

2.2 菌株的鑒定

如圖2A所示，該菌在固體平板上的菌落呈白色或微黃色，近圓形，帶有少許光澤；如圖2B所示，該菌為革蘭氏陽性菌，菌體呈桿狀，單桿或長鏈，芽孢卵圓形或柱形，位于菌體中央或稍偏一端。

圖2 菌株XT2的形態(tài)學觀察

將測序獲得的16S rDNA序列信息在NCBI網(wǎng)站上進行比對并使用MEGA X軟件通過鄰接法(Neighbor-Joining Method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示，該菌與巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium(MH762123.1)聚為一支，故將其鑒定為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。

圖3 菌株XT2的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株所產(chǎn)纖維素酶的酶學特性分析

2.3.1 溫度對酶活力的影響 如圖4所示，該菌所產(chǎn)纖維素酶的最適反應溫度為50℃，在40～70℃之間能夠發(fā)揮75%以上的酶活，有望作為飼料添加劑，在動物胃腸道中發(fā)揮作用。

圖4 溫度對酶活力的影響

2.3.2 pH對酶活力的影響 如圖5所示，該纖維素酶的最適反應為pH 6，在pH 7時，能夠發(fā)揮88%以上的酶活，在弱酸或中性條件下能夠發(fā)揮較大的酶活，這也有利于其作為一種飼料添加劑在動物胃腸道內(nèi)發(fā)揮作用。

圖5 pH對酶活力的影響

2.3.3 纖維素酶的耐熱性 如圖6所示，該纖維素酶在80℃條件下處理10 min后，能夠剩余70%以上的酶活，處理20 min后能夠剩余50%以上的酶活，隨著處理時間的增加，殘余酶活減少，處理30 min后殘余酶活不足50%，高溫處理會造成蛋白質(zhì)的變性，從而使酶活力降低，而該酶表現(xiàn)出一定的耐熱性。

圖6 纖維素酶的耐熱性

2.3.4 纖維素酶的耐堿性 如圖7所示，該纖維素酶在pH 10條件下處理10 min后，殘余50%以上酶活，處理20 min后，殘余不足40%的酶活，說明該酶在堿性條件下易失活。

圖7 纖維素酶的耐堿性

2.3.5 不同金屬離子對酶活力的影響 如圖8所示，不同金屬離子對酶活能夠產(chǎn)生抑制或激活的作用，K+對該纖維素酶活力具有激活作用，Ca2+、Mg2+、Mn2+對酶活具有抑制作用。

圖8 不同金屬離子對纖維素酶活力的影響

2.3.6 該菌的生長情況和產(chǎn)酶規(guī)律 如圖9所示，0～2 h是該菌生長的遲緩期，2～10 h進入對數(shù)生長期，菌體增殖迅速，10～20 h進入生長穩(wěn)定期，菌體增殖的同時，部分菌體因生長環(huán)境的限制發(fā)生死亡，因此菌體數(shù)目變化不大，20～24 h進入衰亡期，由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，大量代謝產(chǎn)物的積累，導致菌體死亡數(shù)目高于增殖數(shù)目，菌體濃度有所下降。由圖9中酶活曲線可看出，該菌所產(chǎn)纖維素酶從生長初期開始分泌，到穩(wěn)定期末時累積的酶量達到最高值，隨后，由于環(huán)境中代謝產(chǎn)物的影響以及菌體數(shù)目的下降，酶活發(fā)生下降。

圖9 菌株XT2的生長曲線和產(chǎn)酶規(guī)律

3 討論

土壤的成分非常復雜，包括水分、空氣、氧化的腐殖質(zhì)、巖石風化礦物質(zhì)、動植物和微生物殘骸分解產(chǎn)生的有機質(zhì)以及土壤微生物，其中土壤微生物推動土壤生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)，降解其中的有機質(zhì)，如纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等木質(zhì)纖維類物質(zhì)[16]。因此，土壤中的微生物多數(shù)能夠分泌纖維素酶、半纖維素酶等木質(zhì)纖維類物質(zhì)的降解酶，土壤也是篩選降解纖維物質(zhì)菌株的重要樣品。不同來源的土壤，由于植被生長的不同，其中微生物多樣性有很大差異，所含功能菌也有所差異，如干旱區(qū)不同鹽生植物群落微生物多樣性具有顯著差異，其中梭梭群落的土壤微生物群落具有較強的微生物總體活性和功能多樣性[17]，而極地陸域如南極、青藏高原和北極土壤中微生物多樣性由于低溫、養(yǎng)分貧乏而具有較大差異[18]。由于玉米植株中含量較高的纖維素和半纖維素，玉米田土壤中的纖維類有機質(zhì)含量較豐富，可能含有較多的纖維降解菌，因此，本研究使用玉米田土壤作為樣品，篩選產(chǎn)纖維素酶菌株。

纖維素酶在輕工業(yè)中具有較廣泛的應用，在飼料業(yè)和畜牧養(yǎng)殖業(yè)中，主要用來提高動物對粗纖維物質(zhì)的消化吸收率，維護動物胃腸道系統(tǒng)的健康，以及開發(fā)非常規(guī)飼料資源[19]。不同特點的纖維素酶有不同的應用，如堿性纖維素酶主要應用于增強洗滌劑的使用效果[20]，酸性纖維素酶可用于牛仔洗滌、青貯制備[21]，或者作為飼料添加劑，在動物腸道中發(fā)揮作用。本研究中篩選獲得的纖維素酶來源于巨大芽孢桿菌，為酸性纖維素酶，可在單胃動物的消化道和反芻動物的瘤胃中發(fā)揮作用，因此可作為飼料用酶進行開發(fā)。

芽孢桿菌是一種益生菌，與其他益生菌相比，其最大的特點就是具有非常好的抗逆性[22]。此外，芽孢桿菌還能夠產(chǎn)生多種酶類，可應用于發(fā)酵飼料的生產(chǎn)，有研究利用響應面法優(yōu)化巨大芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后纖維素酶的活力提高了2倍[23]。也有研究指出巨大芽孢桿菌能夠抑制黃曲霉毒素的生成，并發(fā)揮解磷的功能，安全性良好[24]。還有研究發(fā)現(xiàn)，在植物蛋白質(zhì)飼料中添加巨大芽孢桿菌能夠提高魚體抗氧化能力以及非特異性免疫能力[25]。巨大芽孢桿菌在生長過程中還能夠分泌一些抑菌物質(zhì)，抑制致病菌的生長[26]。本研究中篩選到的巨大芽孢桿菌能夠產(chǎn)生纖維素酶，后期可對其抑菌物質(zhì)的分泌進行檢測，為其作為新型飼料添加劑的開發(fā)和應用提供參考。

4 結(jié)論

本研究以玉米田土壤為篩菌材料，以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源，篩選獲得產(chǎn)纖維素酶菌株；利用分子生物學法結(jié)合形態(tài)學觀察將其鑒定為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。該菌所產(chǎn)纖維素酶的最適反應條件為50℃，pH 6.0，具有一定的熱穩(wěn)定性，K+對纖維素酶具有激活作用，Mg2+、Ca2+和Mn2+對酶活具有抑制作用。該菌生長至20 h時，所產(chǎn)纖維素酶活力較高，達到0.774 U/mL。本研究所篩選到的產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌未來可通過發(fā)酵法和酶解法處理高纖維含量的非常規(guī)飼料，可拓寬飼料原料來源并解決飼料資源短缺的問題，對非常規(guī)飼料資源的開發(fā)以及新型飼料添加劑的研制提供了菌種材料并奠定了堅實的基礎(chǔ)。