曾端香，袁 濤，王蓮英

（1國(guó)家林業(yè)和草原局管理干部學(xué)院，北京 102600；2北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，北京 100083）

0 引言

據(jù)報(bào)道80%以上的植物具有叢枝菌根(AM)共生體系，Cronquist統(tǒng)計(jì)90%的維管植物都能形成叢枝菌根。叢枝菌根真菌(AMF)不僅對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)狀況、抗逆性以及產(chǎn)量與品質(zhì)等具有重要作用，并且在一定程度上改良土壤質(zhì)地、減少土壤病害、減輕環(huán)境污染[1-7]。郭邵霞[8]通過(guò)對(duì)河南洛陽(yáng)和山東菏澤地區(qū)的栽培牡丹根圍的AMF資源調(diào)查，發(fā)現(xiàn)AMF是牡丹上普遍存在的現(xiàn)象。

組織培養(yǎng)已經(jīng)成為園藝園林植物產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)和快速繁殖苗木的主要形式。組織培養(yǎng)是在無(wú)菌條件下進(jìn)行的，因而種苗與菌根真菌接觸的機(jī)會(huì)大為減少，甚至到了苗圃馴化培育階段也還常得不到菌根真菌的幫助，導(dǎo)致苗木生長(zhǎng)狀況較差，抵抗力較弱，成活率較低[9]。張桂花[10]以牡丹品種‘黑花魁’、‘豆綠’等的休眠芽為外植體進(jìn)行組培研究，但沒(méi)有獲得生根苗；陳怡平等[11]以牡丹不同的器官為外植體，通過(guò)不同的途徑獲得了不定芽，但不定芽生根困難。牡丹組培中仍存在組培苗生根難、褐化和玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重、移栽階段植株感病嚴(yán)重和死亡率高等問(wèn)題[12-14]，成為了牡丹組培的瓶頸。曾端香等[15]對(duì)牡丹2個(gè)雜交系進(jìn)行胚培養(yǎng)得到胚根苗無(wú)菌體系，篩選出胚培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件組合，通過(guò)牡丹胚培養(yǎng)解決組培中褐化問(wèn)題，縮短繁育周期[16-18]。Pieriek[19]認(rèn)為菌根生物技術(shù)在克服組培苗逆境脅迫方面，向根際引入有益微生物是一種重要機(jī)制，由于組培植株生長(zhǎng)在一個(gè)完全無(wú)菌的環(huán)境中，因此盡早對(duì)組培苗進(jìn)行高效菌根真菌的人工接種，實(shí)現(xiàn)種苗菌根化，可減輕移栽對(duì)組培苗造成的脅迫并能在移栽或定植后發(fā)揮功能[20]，成為人們研究的熱點(diǎn)。接種AMF還可以抑制組培苗在未消毒土壤中被土傳病原菌侵染，所以在種苗生產(chǎn)上，培育菌根化脫毒苗將會(huì)成為發(fā)展趨勢(shì)[21-22]。Fortuna[23]對(duì)紅葉李組培苗、李敏等[24]對(duì)芋組織培養(yǎng)苗、任萌圃等[25]對(duì)金葉連翹組培苗在移栽階段接種AMF，可提高組培苗的移栽成活率；曾端香等[26-27]發(fā)現(xiàn)接種AMF可以顯著改善牡丹菌根化容器苗對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收和促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育。

本研究對(duì)牡丹組培苗在瓶?jī)?nèi)和移栽時(shí)接種不同種類的AMF，探索AMF對(duì)組培苗菌根化侵染過(guò)程和對(duì)組培苗移栽成活率和生長(zhǎng)發(fā)育等的影響，以期為培養(yǎng)牡丹菌根化組培苗提供實(shí)踐途徑和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試AMF菌種 由北京市農(nóng)林科學(xué)院中國(guó)叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫(kù)(BGC)提供，菌種1#為Glomus geosporum，BGC 507(GZ-01)；菌 種 2#為Glomus mosseae，BGC(XJ-01)。

1.1.2 供試植物材料 牡丹組培苗為組培試驗(yàn)中‘烏龍捧盛’的休眠芽組培的根誘導(dǎo)苗和生根苗，以及‘Z1-10-3’、‘Z1-WM’的胚培養(yǎng)的胚根苗。2月下旬—3月初分別從北京植物園牡丹園和北京回龍觀牡丹園采集牡丹休眠芽進(jìn)行組培以獲得根誘導(dǎo)苗和生根苗，10—11月從牡丹芍藥育種基地（河南）采集雜交牡丹種子進(jìn)行胚培養(yǎng)以獲得胚培養(yǎng)的胚根苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌條件下牡丹組培苗瓶?jī)?nèi)接種AMF試驗(yàn)

（1）AMF孢子分離提取。用濕篩傾析法分離孢子，在體視解剖鏡下挑取大小一致、不帶連孢菌絲的孢子備用。

（2）AMF孢子的表面滅菌方法。參照董昌金[28]的差別滅菌法。①先用A液（2%氯胺-T+200 mg/L鏈霉素+100 mg/L慶大霉素）處理10 min，無(wú)菌水沖洗數(shù)次；②置于25～27℃培養(yǎng)3天，讓雜菌萌發(fā)；③再用A液滅菌10 min后無(wú)菌水沖洗，即重復(fù)步驟①。

（3）無(wú)菌條件下瓶?jī)?nèi)接種AMF孢子。將表面滅菌處理后的孢子進(jìn)行瓶?jī)?nèi)接種。休眠芽組培苗分成未進(jìn)行根誘導(dǎo)的休眠芽增殖芽、完成根誘導(dǎo)的休眠芽增殖芽、已經(jīng)生根的休眠芽增殖芽3種類型接種。胚培養(yǎng)苗根據(jù)根長(zhǎng)不同時(shí)期接種。將AMF孢子接種到瓶?jī)?nèi)組培苗莖段基部或根系附近，自然光培養(yǎng)。每株接種4～6個(gè)孢子，每處理15～20瓶，重復(fù)3次。每周觀察統(tǒng)計(jì)孢子侵染和萌發(fā)情況以及組培苗生長(zhǎng)情況1次。

1.2.2 牡丹組培苗移栽時(shí)接種AMF試驗(yàn) 移栽基質(zhì)用草炭:珍珠巖=1:1的混合基質(zhì)，有機(jī)質(zhì)含量0.82%、可溶性氮含量24.46%、速效磷含量15.97 mg/L、速效鉀含量47.91 mg/L，pH 7.15，基質(zhì)經(jīng)高溫高壓(121℃，2 h)蒸汽滅菌后晾干7天后使用。

瓶?jī)?nèi)未接種的組培苗在移栽上盆時(shí)，先在盆中裝入1/3～1/2的基質(zhì)，然后把AMF菌劑鋪上，放上植株，舒展根系使之與菌劑全面接觸，再填上基質(zhì)。接種AMF菌種 1#Glomusgeosporum（簡(jiǎn)稱 Gg）、菌種2#Glomusmosseae（簡(jiǎn)稱Gm）及菌種1#和2#等比例混合的Glomusgeosporum+Glomusmosseae（簡(jiǎn)稱Gg+Gm），其中不同接種劑用量以含相同孢子數(shù)量為原則來(lái)設(shè)計(jì)，每缽接種2～4 g菌劑，對(duì)照(CK)處理每缽加入等重的經(jīng)121℃滅菌2 h的相應(yīng)河沙。分別于移栽后1個(gè)月、2個(gè)月和6個(gè)月統(tǒng)計(jì)成活率。

1.2.3 菌根侵染指標(biāo)測(cè)定 按照文獻(xiàn)[29-30]的墨水醋染色法進(jìn)行根段染色制片，按Abbott[31]的方法測(cè)定菌絲長(zhǎng)度，在Olympus顯微鏡100～400倍下觀察各制片中根段菌根的侵染情況，根據(jù)每條根系菌根結(jié)構(gòu)的多少，按表1的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄并計(jì)算。

表1 菌根侵染分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

式中，n5表示5級(jí)侵染的根段數(shù)，n4表示4級(jí)侵染的根段數(shù)，n3表示3級(jí)侵染的根段數(shù)，以此類推。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用DPS專業(yè)版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，并采用Duncan進(jìn)行多重比較和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 組培苗的瓶?jī)?nèi)AMF接種時(shí)期選擇

本研究采用董昌金[28]的差別滅菌法進(jìn)行AMF孢子表面滅菌，然后分別對(duì)牡丹組培苗進(jìn)行瓶?jī)?nèi)接種AMF。由表2得出，‘烏龍捧盛’根長(zhǎng)2 cm以上的組培苗接種AMF，其侵染率、侵染強(qiáng)度、生根率、平均根長(zhǎng)和平均根數(shù)均極顯著地高于其他處理，根長(zhǎng)和根數(shù)分別比對(duì)照增長(zhǎng)了49.29%和46.99%；對(duì)已經(jīng)完成根誘導(dǎo)的組培苗的生根率和根的生長(zhǎng)量有顯著的增效作用，其生根率比對(duì)照提高了18.27個(gè)百分點(diǎn)、根長(zhǎng)增加了26.67%、根數(shù)增加了26.16%；對(duì)未完成根誘導(dǎo)的組培苗的生根無(wú)效，AMF不能促進(jìn)不定根的誘導(dǎo)。

表2 ‘烏龍捧盛’休眠芽組培苗瓶?jī)?nèi)接種AMF時(shí)期選擇

由表3可看出，給‘Z1-10-3’不同生長(zhǎng)階段的胚根苗接種AMF，其侵染率和侵染強(qiáng)度均極顯著(P=0.01)高于對(duì)照，各階段的胚根苗未接種AMF的對(duì)照均沒(méi)有侵染，胚根苗Ⅰ、胚根苗Ⅱ、胚根苗Ⅲ接種AMF的侵染率分別為35.23%、67.20%和90.25%，侵染強(qiáng)度分別為9.21、18.05和30.33，它們之間存在極顯著差異，其中根長(zhǎng)≥2.0 cm的胚根苗Ⅲ此時(shí)期接種AMF的侵染率和侵染強(qiáng)度最高，極顯著優(yōu)于其他處理。因此，選擇該時(shí)期接種效果最好。

表3 ‘Z1-10-3’胚培養(yǎng)苗瓶?jī)?nèi)接種AMF時(shí)期選擇

2.2 瓶?jī)?nèi)接種不同種類AMF對(duì)牡丹組培苗菌根侵染的影響

菌根真菌對(duì)宿主植物雖然沒(méi)有表現(xiàn)出嚴(yán)格的專一性，但卻對(duì)宿主植物具有一定的選擇性[6]。由表4得出，‘Z1-10-3’、‘Z1-WM’組培苗瓶?jī)?nèi)接種AMF均能實(shí)現(xiàn)侵染，而未接種的對(duì)照均沒(méi)有侵染；另外，不同品種的組培苗瓶?jī)?nèi)接種同一種AMF，其侵染率和侵染強(qiáng)度不同，而同一品種接種不同種類的AMF，其侵染率和侵染強(qiáng)度也不同。對(duì)于‘Z1-10-3’，Gg+Gm的混合孢子接種的侵染率最高，達(dá)93.12%，極顯著(P=0.01)高于單一接種劑Gg和Gm，同時(shí)Gm的侵染率也極顯著地高于Gg的侵染率(65.45%)；Gg+Gm的侵染強(qiáng)度最高為31.23，與Gm之間沒(méi)有顯著性差異，但均極顯著高于Gg和對(duì)照。

表4 AMF種類對(duì)牡丹組培苗菌根侵染的影響

對(duì)于‘Z1-WM’，Gg+Gm的侵染率和侵染強(qiáng)度最高，分別為95.96%和33.33，均極顯著(P=0.01)高于單一接種劑Gg和Gm，Gg的侵染率和侵染強(qiáng)度均極顯著地大于Gm。與‘Z1-10-3’的表現(xiàn)相反?！疄觚埮跏ⅰ臃NGg的侵染率和侵染強(qiáng)度均最高，與Gg+Gm之間沒(méi)有顯著性差異，但極顯著大于Gm處理和對(duì)照；Gm的處理極顯著優(yōu)于對(duì)照。

以上試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同的AMF對(duì)不同牡丹品種的侵染率和侵染強(qiáng)度存在顯著性差異。AM菌根是牡丹上普遍存在的現(xiàn)象，AM菌根的自然侵染率因品種、立地條件而異，在牡丹根圍發(fā)現(xiàn)Glomus屬大量存在，是牡丹的優(yōu)勢(shì)菌種，其中地球囊霉Glomusgeosporum和摩西球囊霉Glomusmosseae的寄主牡丹品種為‘鳳丹’、‘烏龍捧盛’、‘洛陽(yáng)紅’和‘趙粉’等[8]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雜交牡丹‘Z1-10-3’、‘Z1-WM’也表現(xiàn)出了對(duì)AMF較高的侵染率和侵染強(qiáng)度，它們與混合菌種的共生關(guān)系最強(qiáng)。

2.3 AMF對(duì)牡丹組培苗移栽成活率的影響

從表5得出，接種AMF可以提高牡丹組培苗的移栽成活率，尤其是提高移栽初期的成活率，在移栽1個(gè)月時(shí)，瓶?jī)?nèi)提前接種侵染的組培苗移栽成活率最高達(dá)91.08%，極顯著(P=0.01)高于移栽時(shí)接種處理的成活率66.28%，因?yàn)橐圃猿跗贏MF侵染根系需要一定時(shí)間，在此之前沒(méi)有菌根的幫助成活率降低；移栽時(shí)接種AMF的處理又極顯著高于對(duì)照；在2個(gè)月和6個(gè)月時(shí)其變化趨勢(shì)基本一致，但在后期對(duì)成活率的降低有所減緩，在移栽生長(zhǎng)6個(gè)月時(shí)，瓶?jī)?nèi)接種侵染之后移栽的、移栽時(shí)接種的和對(duì)照其成活率分別為86.16%、63.36%和40.28%，它們之間存在極顯著差異；瓶?jī)?nèi)接種AMF的組培苗移栽生長(zhǎng)6個(gè)月時(shí)其成活率比對(duì)照提高了45.88個(gè)百分點(diǎn)。

表5 接種AMF對(duì)牡丹組培苗移栽成活率的影響

3 結(jié)論

（1）瓶?jī)?nèi)接種AMF能有效地完成侵染過(guò)程，最佳接種時(shí)期是組培苗根長(zhǎng)≥2.0 cm時(shí)接種?！疄觚埮跏ⅰL(zhǎng)2 cm以上的組培苗接種AMF，其侵染率、侵染強(qiáng)度最高，極顯著高于其他處理，分別比對(duì)照增長(zhǎng)49.3%和39.4%；在未完成根誘導(dǎo)狀態(tài)下接種AMF無(wú)效，AMF不能促進(jìn)不定根的誘導(dǎo)，但對(duì)已經(jīng)完成根誘導(dǎo)的組培苗的生根率和根的生長(zhǎng)量有顯著的增效作用?！甖1-10-3’胚根苗Ⅲ（根長(zhǎng)≥2.0 cm）接種AMF(Gm)的侵染率均極顯著優(yōu)于胚根苗Ⅱ（0.5 cm≤根長(zhǎng)≤1.0 cm）、胚根苗Ⅰ（根長(zhǎng)≤0.5 cm）和對(duì)照。同時(shí)在試驗(yàn)中10天內(nèi)就觀測(cè)到了AM菌根的侵染。

（2）瓶?jī)?nèi)不同種類AMF接種對(duì)組培苗AMF侵染有顯著的影響。對(duì)于‘Z1-10-3’，Gg+Gm的混合孢子接種的侵染率最高，達(dá)93.12%，極顯著(P=0.01)高于單一接種劑Gg和Gm；其侵染強(qiáng)度也最高(31.23)，但與Gm之間沒(méi)有顯著差異，均極顯著高于Gg和對(duì)照。對(duì)于‘Z1-WM’，Gg+Gm的侵染率和侵染強(qiáng)度最高，均極顯著(P=0.01)高于單一接種劑Gg和Gm，Gg的侵染率和侵染強(qiáng)度均極顯著大于Gm，與‘Z1-10-3’的表現(xiàn)相反?！疄觚埮跏ⅰ臃NGg的侵染率和侵染強(qiáng)度均與Gg+Gm之間沒(méi)有顯著差異，但極顯著大于Gm處理和對(duì)照。

（3）接種AMF且盡早接種更有利于提高移栽成活率，在移栽6個(gè)月時(shí)，瓶?jī)?nèi)接種AMF的比不接種AMF的對(duì)照提高成活率45.88個(gè)百分點(diǎn)。在移栽生長(zhǎng)6個(gè)月時(shí)統(tǒng)計(jì)，瓶?jī)?nèi)接種AMF侵染之后移栽的、移栽時(shí)接種AMF的和對(duì)照CK，其成活率分別為86.16%、63.36%和40.28%。

4 討論

組織培養(yǎng)是在無(wú)菌條件下進(jìn)行的，因而種苗與菌根真菌接觸的機(jī)會(huì)大為減少，甚至到了苗圃馴化培育階段也還常得不到菌根真菌的幫助，導(dǎo)致苗木生長(zhǎng)狀況較差，成活率較低[9]。同時(shí)，由于在人工控制的條件下長(zhǎng)期培養(yǎng)或由于培養(yǎng)基中外源激素的加入，組培苗喪失了調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素代謝的能力，這種代謝干擾在組培苗出瓶后繼續(xù)存在[32]。本試驗(yàn)對(duì)牡丹組培苗瓶?jī)?nèi)接種后移栽和移栽時(shí)接種AMF，發(fā)現(xiàn)其能順利實(shí)現(xiàn)侵染，接種AMF且盡早（瓶?jī)?nèi)）接種AMF更有利于提高移栽成活率，比不接種對(duì)照提高成活率45.88個(gè)百分點(diǎn)，與盡早對(duì)組培苗進(jìn)行高效菌根真菌的人工接種、實(shí)現(xiàn)種苗菌根化、減輕移栽對(duì)組培苗造成的脅迫、提高組織培養(yǎng)苗的移栽成活率[9,33]的結(jié)論一致。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，組培苗根長(zhǎng)2 cm以上時(shí)為AMF接種的最佳時(shí)機(jī)，這可能是根的發(fā)育狀態(tài)對(duì)AMF的侵染敏感性有影響。未完成根誘導(dǎo)狀態(tài)下接種AMF無(wú)效，AMF不能促進(jìn)不定根的誘導(dǎo)，但對(duì)已經(jīng)完成根誘導(dǎo)的組培苗的生根率和根的生長(zhǎng)量有顯著的增效作用，其生根率比對(duì)照提高了18.27個(gè)百分點(diǎn)，因?yàn)锳M菌根是根系與AMF建立的共生體，沒(méi)有根系缺少寄主，共生關(guān)系將無(wú)法建立。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同牡丹品種對(duì)AMF的專一性選擇不同，‘烏龍捧盛’接種Gg的侵染率和侵染強(qiáng)度均最高，‘Z1-10-3’、‘Z1-WM’的Gg+Gm處理侵染率和侵染強(qiáng)度最高，Gg對(duì)‘Z1-WM’比Gm強(qiáng)，而‘Z1-10-3’的表現(xiàn)相反。這可能與不同牡丹品種的優(yōu)勢(shì)菌種不同有關(guān)。同時(shí)，AMF侵染根系提高了組培苗的移栽成活率，促進(jìn)了生長(zhǎng)發(fā)育和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，縮短了育苗進(jìn)程，與前人研究[27,34-36]結(jié)論一致。

AM真菌在工廠化育苗、抗旱和抗病等抗性方面的功能和促進(jìn)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)等方面具有較大的發(fā)展優(yōu)勢(shì)[26,37]。AM真菌在牡丹菌根化組培苗育苗和生產(chǎn)栽培上的應(yīng)用大有潛力，希望擴(kuò)大牡丹供試品種范圍、優(yōu)化AM真菌接種劑組合，進(jìn)一步研究AM真菌對(duì)牡丹組培苗的生長(zhǎng)發(fā)育的影響及其作用機(jī)理。