黃循斌 葉淑珍 鄔吉偉 符青松 劉碧華 丘惠嫻 程國(guó)強(qiáng)

（1.深圳市龍崗中心醫(yī)院新生兒科，廣東深圳518116；2.復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院新生兒科，上海201102）

新生兒膿毒癥在新生兒中的發(fā)病率為4.5‰～9.7‰，是威脅新生兒生命的重大疾病，也是全球公共衛(wèi)生面臨的主要挑戰(zhàn)之一［1-2］。新生兒容易發(fā)生嚴(yán)重感染，這與新生兒免疫力低下，不能有效抵抗和清除入侵的病原體有關(guān)［3］。目前，膿毒癥具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，但隨著對(duì)膿毒癥的不斷了解，研究發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用［4］。在T細(xì)胞發(fā)育過程中，通過T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）基因片段的隨機(jī)拼接，產(chǎn)生TCR Vα、Jα、Vβ、Dβ和Jβ片段，并由V區(qū)基因片段編碼的高度可變的互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity-determining region，CDR）賦予抗原特異性。CDR3是由V、D、J 3個(gè)基因編碼，在淋巴細(xì)胞的成熟過程中，通過V、D、J基因的重排形成了各種重組序列片段，再加上DNA堿基的單核苷酸多態(tài)性、插入缺失突變形成了T細(xì)胞的多樣性［5］。2013年一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在成人膿毒癥患者中，TCR β鏈多樣性明顯降低，并與病死率明顯相關(guān)［6］。然而，新生兒與成人的T細(xì)胞受體庫具有巨大的差異，TCR多樣性在新生兒抗感染免疫中的作用尚不清楚。本研究以新生兒膿毒癥患者為研究對(duì)象，采集外周靜脈血，利用免疫組庫測(cè)序技術(shù)進(jìn)行TCR多樣性分析，初步探討新生兒膿毒癥的免疫發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2020年3月至2021年3月在深圳市龍崗中心醫(yī)院新生兒科住院的膿毒癥新生兒作為病例組。新生兒膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］：具有臨床表現(xiàn)并符合下列任意一條：（1）血培養(yǎng)或無菌體腔液培養(yǎng)出致病菌；（2）如果血培養(yǎng)培養(yǎng)出機(jī)會(huì)致病菌，則必須于另份血或無菌體腔內(nèi)培養(yǎng)出同種細(xì)菌。選擇同期深圳市龍崗中心醫(yī)院兒保科與病例組胎齡、出生體重及日齡相匹配的健康足月兒為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)（符合下列任意一條予以排除）：（1）圍生期窒息；（2）先天性畸形；（3）存在染色體異?；蜻z傳代謝性疾??；（4）免疫缺陷??；（5）試驗(yàn)前使用免疫球蛋白或激素。本研究已通過深圳市龍崗中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：2020ECYJ026），并獲得患兒監(jiān)護(hù)人知情同意。

1.2 T細(xì)胞分離和DNA提取

健康足月兒和膿毒癥新生兒（在診斷24 h內(nèi)）各抽取2 mL外周靜脈血，采用超順磁性聚苯乙烯珠包被T細(xì)胞特異性單克隆抗體進(jìn)行T細(xì)胞分離。T細(xì)胞DNA提取采用Omega公司核酸純化試劑盒（SQ Blood DNA Kit II），提取的DNA保存在TE緩沖液中，置于無污染容器內(nèi)，管口使用封口膜封好，并標(biāo)記。

1.3 TCR β鏈CDR3區(qū)域的多重PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序

根據(jù)國(guó)際免疫遺傳學(xué)聯(lián)盟對(duì)TCR β鏈CDR3區(qū)域的定義，從V基因片段第39部分編碼的第2個(gè)保守半胱氨酸開始，至J基因片段第59部分編碼的保守苯丙氨酸結(jié)束。采用TCR β鏈擴(kuò)增引物（深圳華大基因科技有限公司）建立PCR反應(yīng)體系，通過多重PCR法實(shí)現(xiàn)TCR β鏈CDR3區(qū)的半定量擴(kuò)增，45條針對(duì)TCR Vβ功能性基因片段的正向引物；13條針對(duì)TCR Jβ基因片段的反向引物。每條引物在其5'末端都相應(yīng)包含了與GA2簇固相PCR兼容的通用引物序列。在擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳后，采用QIA快速PCR純化試劑盒對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，使用第2代測(cè)序平臺(tái)Illumina HiSeq 2000對(duì)TCR β鏈CDR3區(qū)測(cè)序。

1.4 生物信息分析

將測(cè)序的原始數(shù)據(jù)上傳，利用美國(guó)IR公司生物信息學(xué)軟件IRmap在除去數(shù)據(jù)總的冗余序列、短片段序列及測(cè)序質(zhì)量差的序列后，將數(shù)據(jù)與公共數(shù)據(jù)庫IMGT（http://www.imgt.org）進(jìn)行比對(duì)查詢，根據(jù)IGH-CDR3區(qū)V、J、D各區(qū)段的特點(diǎn)鑒定出每個(gè)樣本的CDR3多肽序列，最后通過3D熱力圖、CDR3列表、D50、V取用分布、CDR3長(zhǎng)度分布等參數(shù)來描述樣本的免疫學(xué)特征。D50是通過Arm-PCR技術(shù)擴(kuò)增免疫組庫后測(cè)序，把半定量擴(kuò)增出的免疫組庫和測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分類整理，按表達(dá)量最高到表達(dá)量最低排列，然后從高到低相加，加到50%（reads）的時(shí)候觀察共包括多少個(gè)不同的CDR3系列，即細(xì)胞克隆數(shù)，克隆數(shù)占總數(shù)的百分比就是D50值。采用該軟件可在初步建立TCR受體庫的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行序列分析：（1）計(jì)算每個(gè)核苷酸的數(shù)目和每個(gè)部位的比例；（2）根據(jù)V基因的最后位點(diǎn)、D基因的起始點(diǎn)和結(jié)束位點(diǎn)、J基因的起始位點(diǎn)，檢索在V-D-J重組期間的插入缺失；（3）核苷酸被翻譯成氨基酸。計(jì)算每個(gè)獨(dú)特的DNA系列、氨基酸序列表達(dá)情況。采用香農(nóng)-威納指數(shù)（Shannon-Wiener index）和D50評(píng)估樣本的多樣性［8］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（范圍）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

12例膿毒癥新生兒納入研究，其中男7例，女5例；胎齡37+3～39+5周，出生體重2 560～3 800 g，日齡7～27 d。對(duì)照組9例中，男5例，女4例，胎齡38+1～39+3周，出生體重2 585～3 835 g，日齡9～26 d。兩組患兒性別、胎齡、出生體重、日齡的比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 病例組與對(duì)照組新生兒的基本情況比較

12例膿毒癥新生兒血培養(yǎng)致病菌情況：大腸埃希菌3例，無乳鏈球菌2例，溶血葡萄球菌2例，肺炎克雷伯菌2例，產(chǎn)氣腸桿菌1例，黏質(zhì)沙雷菌1例，銅綠假單胞菌1例。

2.2 基本測(cè)序信息

采集病例組（12份）和對(duì)照組（9份）外周血樣本，運(yùn)用Illumina平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，從每一個(gè)樣本獲取的測(cè)序數(shù)據(jù)平均值為2 500萬次。測(cè)序結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，病例組CDR3總序列數(shù)、CDR3獨(dú)有nt序列數(shù)、CDR3獨(dú)有aa序列數(shù)均較少，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；病例組香農(nóng)-威納指數(shù)亦低于對(duì)照組（P＜0.05）。見表2。

表2 病例組和對(duì)照組CDR3序列相關(guān)系數(shù)比較（xˉ±s）

2.3 CDR3序列長(zhǎng)度分析

本研究對(duì)病例組和對(duì)照組的外周血TCR β鏈CDR3序列長(zhǎng)度進(jìn)行了分析。共獲得1 213 665個(gè)獨(dú)特的CDR3 nt序列，為高斯分布，其長(zhǎng)度分布在病例組和對(duì)照組之間相似，CDR3長(zhǎng)度從30～57 nt變化，峰值在42 nt，即14個(gè)氨基酸長(zhǎng)的片段。

用WebLogo網(wǎng)站分析所有長(zhǎng)度為42 nt序列的核苷酸組成，結(jié)果顯示：病例組和對(duì)照組新生兒的CDR3序列V區(qū)基因中均是鳥嘌呤（G）利用率相對(duì)較高（圖1）；J區(qū)基因中均是胞嘧啶（C）利用率相對(duì)較高（圖2）。

圖1 對(duì)照組和病例組V區(qū)基因堿基系列結(jié)構(gòu)圖 每一個(gè)位點(diǎn)都由ATCG 4個(gè)字母組成，每個(gè)字母由一種顏色代表，字母的高低代表該堿基的比例大小。橫坐標(biāo)代表基因5'到3'的每一個(gè)位點(diǎn)，縱坐標(biāo)代表某位點(diǎn)幾種堿基的比例。對(duì)照組（圖A）和病例組（圖B）均是鳥嘌呤（G）的比例較大。

圖2 對(duì)照組和病例組J區(qū)基因堿基系列結(jié)構(gòu)圖 每一個(gè)位點(diǎn)都由ATCG 4個(gè)字母組成，每個(gè)字母由一種顏色代表，字母的高低代表該堿基的比例大小。橫坐標(biāo)代表基因5'到3'的每一個(gè)位點(diǎn)，縱坐標(biāo)代表某位點(diǎn)幾種堿基的比例。對(duì)照組（圖A）和病例組（圖B）均是胞嘧啶（C）的比例較大。

2.4 免疫組庫多樣性分析

比對(duì)分析鑒定出系列的VDJ基因后，通過統(tǒng)計(jì)重組基因的表達(dá)，獲得每一種reads的表達(dá)數(shù)，該表達(dá)數(shù)從統(tǒng)計(jì)學(xué)上可以代表一種細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。同時(shí)，根據(jù)V-J配對(duì)的情況，統(tǒng)計(jì)每一類V-J配對(duì)使用頻率的表達(dá)情況，并通過3D圖（圖3），直觀地看到表達(dá)多樣性的變化情況：對(duì)照組外周血TCR β鏈CDR3受體庫多樣性較為豐富，而病例組的CDR3受體多樣性較少，呈現(xiàn)寡克隆分布。采用D50作為TCR β鏈CDR3多樣性的評(píng)價(jià)指標(biāo)［9］，顯示病例組TCR β鏈CDR3序列多樣性低于對(duì)照組（D50：10.5±0.8 vs 17.3±1.5），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.433，P=0.011）。

2.5 各樣本V和J區(qū)基因片段使用頻率分析

對(duì)病例組和對(duì)照組新生兒外周血TCR β鏈CDR3免疫組庫3D圖（圖3）進(jìn)行分析顯示：48個(gè)V區(qū)和13個(gè)J區(qū)基因片段在病例組和對(duì)照組之間顯示出不同的使用頻率，使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)得出兩組間有意義的基因。全部J區(qū)基因片段中，病例組TRBJ2-3、TRBJ2-5和TRBJ2-7的基因使用頻率均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而其他基因在對(duì)照組更常見，見表3。全部V區(qū)基因片段中，病例組TRBV10-3、TRBV2和TRBV20-1的基因使用頻率均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而其他基因在對(duì)照組更常見，見表4。

表4 （續(xù)）

圖3 對(duì)照組和病例組TCR β鏈CDR3免疫組庫3D圖 X軸表示V基因亞型，Y軸表示J基因亞型，X-Y平面每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)V-J配對(duì)的克隆。Z軸則代表每一個(gè)克隆的表達(dá)豐度。圖A為對(duì)照組V-J匹配頻率熱點(diǎn)示例圖，其樣品的TCR β鏈CDR3受體庫多樣性較為豐富；圖B為病例組V-J匹配頻率熱點(diǎn)示例圖，其樣品的TCR β鏈CDR3受體庫多樣性較少。

表3 病例組和對(duì)照組J區(qū)基因使用頻率的比較［中位數(shù)（范圍）］

表4 病例組和對(duì)照組V區(qū)基因使用頻率的比較［中位數(shù)（范圍）］

3 討論

新生兒膿毒癥是新生兒期感染致死的主要原因，若識(shí)別和救治不及時(shí)可迅速導(dǎo)致多器官功能障礙［1］。最新證據(jù)表明免疫反應(yīng)在膿毒癥的發(fā)病過程中起到重要作用［10］。新生兒對(duì)病原體的易感性，不僅因免疫系統(tǒng)不成熟所致，近年來越來越多的研究表明，適應(yīng)性免疫在新生兒抗感染免疫中具有關(guān)鍵作用［11］。T細(xì)胞和B細(xì)胞是適應(yīng)性免疫的兩種主要細(xì)胞組分，其中T細(xì)胞是機(jī)體細(xì)胞免疫功能的執(zhí)行者。TCR既是T細(xì)胞特異性識(shí)別和結(jié)合特異性抗原表位觸發(fā)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵分子，其中TCR高變區(qū)的CDR3變異最大，是最能代表T細(xì)胞的應(yīng)答特征，其在外周形成了具有多樣性的T細(xì)胞CDR3受體庫［12］。TCR多樣性是保證個(gè)體在多變環(huán)境中對(duì)不同外來抗原發(fā)生有效免疫應(yīng)答的關(guān)鍵，但對(duì)于其在抗感染免疫中的作用及其機(jī)制尚不清楚。因此，本研究利用免疫組庫測(cè)序技術(shù)分析新生兒膿毒癥患者外周血TCR多樣性對(duì)其發(fā)病的免疫應(yīng)答機(jī)制顯得非常重要。

本研究通過采集病例組和對(duì)照組新生兒外周血樣本，運(yùn)用Illumina HiSeq 2000平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，從每一個(gè)樣本獲取的測(cè)序數(shù)據(jù)平均值為2 500萬次，遠(yuǎn)大于既往報(bào)道的100萬次［13］，因此，可認(rèn)為本研究測(cè)序的結(jié)果是穩(wěn)定和可信的。測(cè)序結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，病例組患兒CDR3總序列數(shù)、CDR3獨(dú)有nt序列數(shù)、CDR3獨(dú)有aa序列數(shù)都相對(duì)較少，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在抗原的刺激下可以引起具有特定的CDR3區(qū)T細(xì)胞擴(kuò)增。

本研究運(yùn)用免疫組庫測(cè)序技術(shù)共獲得1 213 665個(gè)獨(dú)特的CDR3 nt序列，病例組CDR3長(zhǎng)度與對(duì)照組比較差別不大，都呈高斯分布；用WebLogo網(wǎng)站分析所有長(zhǎng)度為42 nt序列的核苷酸組成，病例組和對(duì)照組的CDR3序列V區(qū)基因中均是鳥嘌呤（G）利用率相對(duì)較高，J區(qū)基因中均是胞嘧啶（C）利用率相對(duì)較高，研究結(jié)果顯示病例組和對(duì)照組新生兒CDR3的長(zhǎng)度和類型相似，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示免疫組庫建庫成功［13］。本研究采用D50和香農(nóng)-威納指數(shù)作為TCR β鏈CDR3多樣性的評(píng)價(jià)指標(biāo)，顯示病例組TCR β鏈CDR3序列多樣性低于對(duì)照組。江意春等［14］采用高通量測(cè)序分析成人膿毒癥患者早期T細(xì)胞TCR β鏈CDR3的多樣性，顯示明顯降低。本研究在初步建立TCR受體庫的基礎(chǔ)上采用多種方法評(píng)估膿毒癥新生兒外周血TCR β鏈CDR3多樣性，研究結(jié)果均顯示膿毒癥新生兒外周血TCR β鏈CDR3多樣性下降，提示膿毒癥新生兒T細(xì)胞亞群減少或消失，對(duì)抗原的應(yīng)答能力下降。其機(jī)制可能是在嚴(yán)重感染狀態(tài)下，特殊的抗原刺激可引起某一或某些亞家族的TCR特異性重排，出現(xiàn)某些TCR特異性的T細(xì)胞克隆性增殖的現(xiàn)象，破壞TCR多樣性。

本研究對(duì)病例組和對(duì)照組新生兒外周血TCR β鏈CDR3免疫組庫3D圖進(jìn)行了分析。對(duì)V片段48個(gè)基因的使用頻率進(jìn)行比較顯示，其中TRBV10-3、TRBV2和TRBV20-1的使用頻率病例組均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；J片段13個(gè)基因的使用頻率進(jìn)行比較，其中TRBJ2-3、TRBJ2-5和TRBJ2-7的使用頻率病例組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。既往研究已明確用測(cè)定特定CDR3順序出現(xiàn)的頻率，來觀察特定T細(xì)胞克隆增加的程度，并能反映T細(xì)胞的功能狀態(tài)［15］。因此，本研究結(jié)果提示新生兒膿毒癥患兒外周血TCR β鏈CDR3序列的TRBV20-1、TRBV2、TRBV10-3、TRBJ2-7、TRBJ2-5和TRBJ2-3可能參與疾病的免疫應(yīng)答，為以后進(jìn)一步研究新生兒膿毒癥發(fā)病機(jī)制提供了依據(jù)。

綜上所述，本研究顯示膿毒癥新生兒TCR β鏈CDR3多樣性降低，推測(cè)V、J區(qū)部分亞型的異常表達(dá)可能參與新生兒膿毒癥的免疫應(yīng)答，患兒基礎(chǔ)免疫狀態(tài)的復(fù)雜性可能是免疫功能失調(diào)導(dǎo)致膿毒血癥的原因之一。下一步的研究有待擴(kuò)大樣本量，對(duì)不同類型細(xì)菌感染致膿毒癥新生兒TCR β鏈CDR3多樣性及與預(yù)后的關(guān)系進(jìn)一步研究；分析整個(gè)病程各階段的T細(xì)胞功能，在免疫組庫的基礎(chǔ)上篩選出新生兒膿毒癥患者外周血TCR β鏈的優(yōu)勢(shì)取用CDR3序列，探尋這些包含特定CDR3序列的TCR所針對(duì)的抗原特征，期待在揭示新生兒膿毒癥免疫應(yīng)答機(jī)制的基礎(chǔ)上為其特異性T細(xì)胞免疫治療提供依據(jù)。