劉 紅，江敬紅，段志娟，徐仕軍，黃福建，夏 帆

（1.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)材料與化學(xué)學(xué)院，武漢430074；2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢430071）

成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）和CRISPR相關(guān)（CRISPR associated，Cas）蛋白系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)［1~4］，因其引導(dǎo)RNA的可編程性和Cas核酸酶的生物活性而在基礎(chǔ)生物學(xué)研究和醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用.該系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)是只需要簡(jiǎn)單地改變引導(dǎo)RNA的序列就能靶向不同的基因組位點(diǎn)［5，6］.引導(dǎo)RNA和Cas蛋白都可以通過(guò)化學(xué)或生物改造來(lái)提高穩(wěn)定性和增加系統(tǒng)功能［5，7，8］.對(duì)基因編輯和調(diào)控情況進(jìn)行精確外部控制的需求，推動(dòng)了可誘導(dǎo)CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)展.只在特定的時(shí)間針對(duì)特定的靶標(biāo)將是CRISPR-Cas系統(tǒng)的理想改進(jìn)，控制性的基因編輯可由于細(xì)胞中CRISPR-Cas活性受限而降低脫靶效應(yīng).小分子、磁場(chǎng)或光等外部控制元件已經(jīng)被用于開(kāi)發(fā)可誘導(dǎo)的CRISPR-Cas系統(tǒng)［9~11］.其中，光是一種極好的外部觸發(fā)，具有非侵入性、低毒性、快速的開(kāi)/關(guān)響應(yīng)、高時(shí)間及空間分辨率等優(yōu)點(diǎn)［7，11］.利用光，研究者們已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了一系列精準(zhǔn)、時(shí)空可控的基因編輯技術(shù)平臺(tái)，提供了一種新型可控的基因編輯工具，擴(kuò)展了當(dāng)前CRISPR-Cas基因編輯工具箱.

1 基因編輯技術(shù)

基因編輯（Genome editing）是一種對(duì)基因組中特定目標(biāo)基因進(jìn)行針對(duì)性修飾的技術(shù)，通過(guò)插入、刪除或替換某個(gè)基因片段來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體某一特性或性狀的改變.高效的基因組編輯是在感興趣的染色體序列中產(chǎn)生靶向DNA雙鏈斷裂（Double strand breaks，DSB），觸發(fā)DNA損傷反應(yīng)（DNA damage response，DDR），啟動(dòng)非同源末端連接（Nonhomologous end joining，NHEJ）或同源定向修復(fù)（Homologydirected repair，HDR）程序［12，13］，最終實(shí)現(xiàn)基因敲除（Gene knockout）與敲入（Gene knockin）.迄今為止，基因編輯技術(shù)主要包括3類功能強(qiáng)大的核酸酶：鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和CRISPR-Cas系統(tǒng)［4，6，14］，它們可以在基因組指定位點(diǎn)創(chuàng)造DSB.

1.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)

ZFNs和TALENs由于存在構(gòu)建成本高、操作繁瑣耗時(shí)、靶向能力有限和靶向特異性低等問(wèn)題，使其應(yīng)用受到限制［14~16］.與前兩種技術(shù)相比，CRISPR-Cas系統(tǒng)以其經(jīng)濟(jì)性、易用性、高效率和廣泛適用性等優(yōu)點(diǎn)［17］目前在研究實(shí)驗(yàn)室中占主導(dǎo)地位.

CRISPR-Cas系統(tǒng)是新一代基因組工程工具的關(guān)鍵組成部分，在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)揮適應(yīng)性免疫機(jī)制的作用，保護(hù)其免受外來(lái)基因的侵害.CRISPR-Cas免疫應(yīng)答包括3個(gè)主要階段：適應(yīng)性階段、crRNA（CRISPR RNA，crRNA）生物發(fā)生和干擾階段［3，4］.適應(yīng)性需要獲取外源DNA序列到CRISPR陣列中，Cas蛋白復(fù)合物通常在識(shí)別一個(gè)獨(dú)特的短基序-原間隔相鄰基序（Protospacer-adjacent motif，PAM）后與靶DNA結(jié)合，并切割出靶DNA的一部分，稱為原間隔基序（Protospacer）.在CRISPR陣列復(fù)制重復(fù)序列后，適應(yīng)復(fù)合物將原間隔區(qū)DNA插入陣列，使其成為間隔區(qū)（Spacer）.在表達(dá)階段，CRISPR陣列被轉(zhuǎn)錄形成前CRISPR RNA（pre-crRNA），經(jīng)Cas蛋白質(zhì)或宿主因子處理后產(chǎn)生單個(gè)成熟的crRNA.在干擾階段，crRNA與系統(tǒng)的Cas蛋白質(zhì)子集形成“效應(yīng)”復(fù)合物，crRNA識(shí)別并靶向外源入侵核酸序列，然后由Cas效應(yīng)物復(fù)合物切割并失活靶向的核酸序列，從而防止進(jìn)一步的感染［3，4，18］.

CRISPR-Cas系統(tǒng)根據(jù)其Cas效應(yīng)復(fù)合物的蛋白質(zhì)成分分為兩大類［18，19］：（1）多亞基效應(yīng)子復(fù)合體，即由一個(gè)crRNA和多個(gè)蛋白質(zhì)亞單位組裝而成，通常由3~6個(gè)不同的Cas基因編碼；（2）單個(gè)蛋白效應(yīng)子模塊，即由crRNA和單個(gè)Cas蛋白組裝而成.第一類和第二類CRISPR-Cas系統(tǒng)可根據(jù)其Cas蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分為不同類型：Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型（第一類）以及Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型（第二類）.第一類CRIS?PR-Cas系統(tǒng)因成分相對(duì)復(fù)雜不適于作為研究工具而未被廣泛研究和應(yīng)用，第二類系統(tǒng)因其構(gòu)成簡(jiǎn)單而更適合應(yīng)用，已被廣泛開(kāi)發(fā)和改造成基因編輯工具和分子診斷工具.目前，第二類系統(tǒng)研究較多的是Ⅱ型系統(tǒng)中的Cas9、Ⅴ型系統(tǒng)中的Cas12和Ⅵ型系統(tǒng)中的Cas13（圖1）.

Fig.1 CRISPR?Cas systems:key features(A)and modular organization(B)[19]

1.2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因組工程

原核生物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)CRISPR-Cas9已被作為一個(gè)通用的、適應(yīng)性強(qiáng)和靶向特異的基因組編輯工具［5，17，20，21］.CRISPR-Cas9介導(dǎo)的DNA切割所需的組分是Cas9蛋白及其結(jié)合的RNA組分.RNA組分由crRNA和反式激活crRNA（Trans-activating crRNA，tracrRNA）部分配對(duì)形成，其中crRNA包含識(shí)別靶DNA序列的位點(diǎn)，tracrRNA促進(jìn)crRNA成熟和將crRNA裝載到Cas9上［21］.現(xiàn)已將成熟的crRNA和tracrRNA融合成一個(gè)嵌合的單引導(dǎo)RNA（Single guide RNA，sgRNA）來(lái)達(dá)到更高的效率.sgRNA的引導(dǎo)序列用于精確靶向目標(biāo)序列.Cas9的PAM位點(diǎn)為“NGG”三核苷酸基序，切割位點(diǎn)位于PAM 5'端上游約3 bp處.Cas9酶通常包含兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域：RuvC樣結(jié)構(gòu)域和HNH結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割雙鏈DNA分子中的一條鏈［22］.對(duì)RuvC或HNH結(jié)構(gòu)域進(jìn)行D10A或H840A突變，以構(gòu)建Cas9功能缺失突變體，該突變體只對(duì)雙鏈DNA中的一條鏈進(jìn)行切割，命名為切口酶（Nickase）［23］.當(dāng)使用兩個(gè)Cas9 nickase時(shí)，兩個(gè)切口的端部都會(huì)產(chǎn)生較長(zhǎng)的突出部分，而不是鈍端，這為精確的基因整合和插入提供了更大的操作空間.如果將兩個(gè)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的催化殘基同時(shí)突變，則可構(gòu)建失活Cas9（deadCas9，dCas9）［20，24］，這種Cas9的非切割版本可以作為一種通用的RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白來(lái)啟動(dòng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的其它應(yīng)用.

目前，CRISPR-Cas9系統(tǒng)（圖2）主要應(yīng)用于基因功能篩選、基因治療的細(xì)胞和動(dòng)物模型的建立、融合蛋白的轉(zhuǎn)錄研究、基因組熒光成像、植物的基因組編輯等方面［25~29］.Kleinstiver等［25］開(kāi)發(fā)了一種高保真的Cas9蛋白變體spCas9-HF1，在保證靶向活性與野生型spCas9相當(dāng)?shù)那疤嵯?，能夠降低與靶DNA的非特異性作用，使脫靶效應(yīng)降低到無(wú)法檢測(cè)的水平，擴(kuò)大了基因編輯技術(shù)的應(yīng)用可能性，為其它CRISPR RNA引導(dǎo)核酸酶的優(yōu)化提供了參考.在基于CRISPR的研究基礎(chǔ)上，Gao等［26］開(kāi)發(fā)了一種新基因編輯工具Prime editing，擴(kuò)展了現(xiàn)有的“遺傳學(xué)工具箱”，可更精確構(gòu)建疾病模型和糾正遺傳學(xué)問(wèn)題.與顛覆性的基因編輯工具CRISPR相比，Prime editing更簡(jiǎn)單、更精確.Moghadam等［27］創(chuàng)建了一種以不同方式使用CRISPR技術(shù)的系統(tǒng)，既可用CRISPR進(jìn)行基因治療，也可用CRISPR來(lái)控制免疫反應(yīng).基于CRISPR的免疫抑制可預(yù)防或治療小鼠敗血癥，突出了該工具在一系列炎癥疾病中的廣泛應(yīng)用潛力.

Fig.2 spCas9 interaction with the sgRNA and target DNA[25]

1.3 CRISPR-Cas12系統(tǒng)的基因組工程

CRISPR-Cas12屬于第二類、Ⅴ型CRISPR系統(tǒng)［19，30~33］，也是一種RNA引導(dǎo)的DNA核酸酶（圖3），由于其具有獨(dú)特的特性，進(jìn)一步擴(kuò)展了CRISPR技術(shù)的范圍和多功能性.與CRISPR-Cas9系統(tǒng)相比，Ⅴ型系統(tǒng)不需要tracrRNA和RNaseⅢ來(lái)協(xié)助crRNA的成熟.前crRNA向成熟crRNA的轉(zhuǎn)化是由Cas12a結(jié)構(gòu)域的內(nèi)在核糖核酸酶活性介導(dǎo)的，使其成為一種同時(shí)具有DNA內(nèi)切酶活性和RNA酶活性的獨(dú)特效應(yīng)蛋白［32，33］.Cas12a識(shí)別富含T的PAM，因此能夠定位Cas9不能定位的基因組區(qū)域.Cas12a的DNA切割位點(diǎn)在遠(yuǎn)離PAM的區(qū)域留下一個(gè)黏性端，而Cas9的切割則在靠近PAM的區(qū)域產(chǎn)生一個(gè)鈍端.Cas12a由于與Cas9的顯著差異，提出了一種新的分子基因組編輯工具［33~37］.它的前crRNA處理活性使其成為多重基因調(diào)控的一個(gè)有吸引力的候選者.除了高特異性的dsDNA切割外，Cas12a還被證明在與crRNA互補(bǔ)的ssDNA激活時(shí)表現(xiàn)出不加選擇的ssDNA降解活性.利用這一特性，Cas12a在分子診斷領(lǐng)域［38，39］表現(xiàn)出重要的應(yīng)用價(jià)值和巨大的應(yīng)用前景.Campa等［35］利用Acidaminococcus sp.Cas12a中雙重的RNase/DNase的功能開(kāi)發(fā)了SiT-Cas12a系統(tǒng)，可以編碼Cas12a和幾十個(gè)crRNAs在一個(gè)轉(zhuǎn)錄本中從而用于多個(gè)復(fù)雜基因組工程，提供了一個(gè)強(qiáng)大的平臺(tái)來(lái)研究和編排復(fù)雜細(xì)胞行為背后復(fù)雜的遺傳程序.Liu等［37］在嗜熱毀絲菌中建立了基于CRISPR-Cas12a的多基因編輯工具，開(kāi)發(fā)了一種使篩選標(biāo)記循環(huán)使用以及可以迭代基因的技術(shù)Camr.Camr技術(shù)是一個(gè)多功能、有效的工具，可以加速真菌中以生物技術(shù)為導(dǎo)向的工程過(guò)程.Ding等［38］開(kāi)發(fā)了一種稱為“一體式雙CRISPR-Cas12a”的技術(shù)，能夠?qū)ARS-CoV-2進(jìn)行簡(jiǎn)單、快速、超靈敏的視覺(jué)檢測(cè).

Fig.3 crRNA?DNA hybrid(A)and the displaced non?target strand(B)[31]

1.4 CRISPR-Cas13系統(tǒng)的基因組工程

CRISPR-Cas13屬于第二類Ⅵ型CRISPR-Cas系統(tǒng)［18，19］，CRISPR-Cas13系統(tǒng)（圖4）由效應(yīng)蛋白質(zhì)Cas13與crRNA構(gòu)成，二者組裝形成一個(gè)由crRNA引導(dǎo)的RNA靶向效應(yīng)復(fù)合物.Cas13蛋白是具有雙重作用的RNA酶，能自我加工前體crRNA和切割靶RNA.Casl3蛋白具有2個(gè)高度保守的HEPN結(jié)構(gòu)域，是Cas13效應(yīng)蛋白發(fā)揮活性的部位，行使切割功能時(shí)識(shí)別靶RNA序列兩側(cè)的PFS（Protospacer flanking sequence）位點(diǎn)［40~43］.在crRNA的介導(dǎo)下，結(jié)合靶標(biāo)ssRNA后蛋白構(gòu)象變化，不僅會(huì)切割靶標(biāo)ssRNA，同時(shí)會(huì)非特異性地切割蛋白附近任意ssRNA（圖4）［41，42，44］.

Fig.4 Molecular mechanisms of RNA?targeting by Cas13[42]

CRISPR-Casl3系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)為RNA編輯等領(lǐng)域提供了新思路，目前該系統(tǒng)多在病毒核酸檢測(cè)、RNA編輯和疾病治療等方面［43~47］有著廣泛應(yīng)用.Gootenberg等［44］將重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)與CRISPR-Cas13系統(tǒng)結(jié)合，開(kāi)發(fā)了SHERLOCK核酸檢測(cè)平臺(tái).不僅可以對(duì)患者樣本中的寨卡病毒和登革病毒進(jìn)行靈敏的檢測(cè)（靈敏度可達(dá)單拷貝），也可以對(duì)多種病毒種類和菌株進(jìn)行基因分型.Jing等［45］利用CRISPRCas13系統(tǒng)設(shè)計(jì)了一個(gè)RNA編輯系統(tǒng)，通過(guò)將非活性形式的Cas13a連接到人腺苷脫氨酶的催化結(jié)構(gòu)域上，該催化結(jié)構(gòu)域顯示可通過(guò)crRNA編程以靶向mRNA并精確編輯特定的核苷酸殘基.證明了該系統(tǒng)在編輯內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄本方面的實(shí)用性，為逆轉(zhuǎn)錄病毒操作和干擾提供了一個(gè)潛在的新工具.Zhao等［46］將CRISPR-Cas13a系統(tǒng)設(shè)計(jì)用于胰腺癌KRAS突變體的靶向治療.結(jié)果表明，Cas13a蛋白和crRNA顯著敲除突變體KRAS mRNA的表達(dá)，可誘導(dǎo)高達(dá)94%的敲除效率.CRISPR-Cas13a介導(dǎo)的KRAS-G12D mRNA敲低可有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起顯著的腫瘤縮小.

2 光控工具

對(duì)生物功能的精確條件控制是研究細(xì)胞過(guò)程機(jī)制的重要工具.在自然狀態(tài)下，這些過(guò)程在細(xì)胞和生物體水平上受到高度的空間和時(shí)間控制.光是一種快速、無(wú)創(chuàng)的刺激，代表了一種極好的外部觸發(fā)，其可以以非常高的空間和時(shí)間精度來(lái)實(shí)現(xiàn)生物過(guò)程的光調(diào)控，在小分子、多肽、蛋白質(zhì)和核酸的激活和失活方面均有著廣泛應(yīng)用［48~50］.此外，光激活誘導(dǎo)策略在探索特定的基因功能和設(shè)計(jì)刺激敏感的前體藥物方面均具有廣闊的應(yīng)用前景.

2.1 光敏感基團(tuán)

為了在基礎(chǔ)水平上正確理解生物和細(xì)胞過(guò)程，對(duì)這些過(guò)程進(jìn)行精確的外部控制是十分必要的.因此，使用光作為外部控制因素的光籠方法引起了廣大科研工作者的極大興趣.用光調(diào)節(jié)分子過(guò)程的一種方法是在關(guān)鍵位置使用不耐光的“光籠”基團(tuán).光籠基團(tuán)是光敏官能團(tuán)，也稱光敏感基團(tuán)［50］.光籠基團(tuán)和活性分子之間的耦合方式為：理想情況下光籠基團(tuán)的修飾使后者暫時(shí)不活躍，在稱為“籠化”的過(guò)程中掩蓋了它們的活性；之后，活性分子的活性在光照射后恢復(fù)，這一過(guò)程稱為“去籠化”［48］.目前，研究者普遍認(rèn)為光籠基團(tuán)可以使生物活性分子的功能保持在休眠狀態(tài)，在光照和去除籠化后，其功能得以恢復(fù)［51，52］.籠化方法允許使用各種光籠基團(tuán)和離去基團(tuán)，已經(jīng)將光籠基團(tuán)的應(yīng)用從有機(jī)合成擴(kuò)展到了多種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用.籠化方法的關(guān)鍵步驟是確定感興趣分子的官能團(tuán)，這些官能團(tuán)通常是氨基、羥基、羧酸根和磷酸根基團(tuán)［53，54］.良好的光籠基團(tuán)需要滿足：容易引入，在生理?xiàng)l件下（有時(shí)是細(xì)胞內(nèi)）高度溶解和穩(wěn)定.由于光保護(hù)基團(tuán)光解后總是產(chǎn)生副產(chǎn)物，因此重要的是該副產(chǎn)物無(wú)毒.此外，這些副產(chǎn)品不應(yīng)吸收用于光解的光［50，52］.常見(jiàn)的光敏感基團(tuán)對(duì)紫外光或可見(jiàn)光敏感（圖5），包括2-硝基芐基（2-Nitrobenzyl，NB）、4，5-二甲氧基-2-硝基芐基（4，5-Dimethoxy-2-nitrobenzyl，DMNB）、1-（2-硝基苯基）丙基［1-（2-Nitrophenyl）propyl，NPP］、1-（2-硝基苯基）乙基［1-（2-Nitrophenyl）ethyl，NPE］、6-硝基-3，4-亞甲二氧芐氧甲基（6-Nitropiperonyloxymethyl，NPOM）、安息香和香豆素基等（圖5）［50，55，56］.

Fig.5 Several common cage compounds[55]

2.2 核酸的光學(xué)控制

Fig.6 Photoswitchable oligonucleotides and nucleic acids

核酸功能.利用寡核苷酸的高模塊性和合成可及性，光籠基團(tuán)可以安裝在骨架磷酸鹽、2'-OH基團(tuán)和堿基上［56，58~60］，由于籠狀基團(tuán)阻斷了Watson-Crick氫鍵，寡核苷酸是無(wú)活性的，直到籠狀基團(tuán)的光解恢復(fù)寡核苷酸活性［59~61］.或者互補(bǔ)的反義鏈通過(guò)可光降解的連接體與功能鏈相連［62~69］，在無(wú)光照條件下，籠狀雙鏈體是非活性的；光照后，連接體被裂解，活性的功能鏈被釋放.大多數(shù)可光降解的連接體是基于鄰硝基芐基的［70，71］.調(diào)控性寡核苷酸的光化學(xué)控制被設(shè)計(jì)用于干擾遺傳信息的流動(dòng)，具有在單細(xì)胞和多細(xì)胞生物中調(diào)節(jié)和研究基因功能的潛力.可以通過(guò)光激活的反義劑、小干擾RNA、拮抗劑、籠狀三鏈形式的寡核苷酸、適體和DNA誘餌來(lái)實(shí)現(xiàn)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)活性的調(diào)控［70，72，73］.Young等［59］將含有籠狀核堿基的引物用于PCR的光化學(xué)控制，修飾光籠基團(tuán)的引物無(wú)法與DNA模板雜交，只有光籠基團(tuán)光解后才能引發(fā)DNA聚合.為了使PCR引物失活，進(jìn)一步設(shè)計(jì)了一種籠式發(fā)夾引物，在核堿基去籠化后引物形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)使其自身失活［圖6（A）］.通過(guò)RNA干擾（RNA interference，RNAi）實(shí)核酸作為生物探針已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，在治療方面也具有很好的發(fā)展前景［57］.寡核苷酸是研究生物途徑的理想選擇，因?yàn)樗鼈兛梢砸孕蛄刑禺愋院屯耆删幊痰姆绞絹?lái)影響DNA、RNA和蛋白質(zhì)的功能.核酸功能的光學(xué)控制使得RNA干擾、轉(zhuǎn)錄、翻譯、基因編輯和核酸檢測(cè)的時(shí)空控制成為可能［50，52，55，56］現(xiàn)序列特異性基因沉默已被用作一種研究工具，其中的關(guān)鍵因素是小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）.Mikat等［60］選擇用籠狀脫氧核苷酸修飾siRNAs，使RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）的siRNA：mRNA雙鏈中產(chǎn)生一個(gè)臨時(shí)的突起區(qū)域，此時(shí)的siRNA表現(xiàn)為非活性狀態(tài).通過(guò)紫外光照射后被激活，并顯示出與未修飾siRNA相同的活性［圖6（B）］.Huang等［62］創(chuàng)建了一種光控制的Toehold形成方法，該方法基于2-硝基芐基連接體連接的DNA發(fā)夾前體結(jié)構(gòu)的光裂解.紫外線的照射導(dǎo)致硝基芐基接頭裂解，隨后形成具有Toehold結(jié)構(gòu)的DNA雙鏈體.結(jié)果表明，可以通過(guò)簡(jiǎn)單地改變紫外線照射的劑量來(lái)控制Toehold的數(shù)量，并且所得的Toehold結(jié)構(gòu)可以用于隨后的Toehold介導(dǎo)的DNA分支遷移反應(yīng)［圖6（C）］.目前，他們已經(jīng)在該技術(shù)的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了一系列應(yīng)用，包括光控mRNA檢測(cè)與成像［圖6（D）］［63，64］、光響應(yīng)性和pH響應(yīng)性的DNA微膠囊用于控制“貨物”釋放［65］、光活化的膜融合用于癌細(xì)胞治療［66］以及多種基于2-硝基芐基接頭修飾的DNA光刻方法的研究［67~69］.Govan等［74］利用含籠狀堿基的三鏈形式寡核苷酸（Triplex-forming oligonucleotides，TFOs）對(duì)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行光學(xué)控制，TFOs是單鏈寡核苷酸，通過(guò)氫鍵與DNA啟動(dòng)子區(qū)域的主溝結(jié)合，從而阻止轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄無(wú)法進(jìn)行［圖6（E）］.Hemphill等［75］為了實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的空間和時(shí)間激活，將籠狀胸腺嘧啶核堿基定點(diǎn)引入TATA盒，籠化后的質(zhì)粒處于非活性狀態(tài)，直到短暫的紫外線照射去除光籠基團(tuán)，形成野生型CMV啟動(dòng)子，基因表達(dá)才得以完全恢復(fù)［圖6（F）］.

2.3 蛋白質(zhì)的光學(xué)控制

蛋白質(zhì)和肽在許多細(xì)胞過(guò)程的功能中起著重要作用，這些過(guò)程對(duì)維持分子、細(xì)胞和生物體水平的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，因此開(kāi)發(fā)用于研究蛋白質(zhì)和肽功能的光控工具是非常有價(jià)值的［76］.蛋白質(zhì)和肽功能的光學(xué)控制已通過(guò)非天然氨基酸的發(fā)展實(shí)現(xiàn)，使光激活的光籠基團(tuán)與其進(jìn)行位點(diǎn)特異性結(jié)合成為可能［77，78］.這些進(jìn)展為許多生物過(guò)程的探索和各種藥物遞送系統(tǒng)的研究提供了巨大潛力.光學(xué)控制蛋白功能通常通過(guò)引入基于光控蛋白-蛋白相互作用的光遺傳學(xué)工具［77，79~82］或光不穩(wěn)定的光籠基團(tuán)［54~56，78］來(lái)實(shí)現(xiàn).

基于光控蛋白-蛋白相互作用的光遺傳學(xué)工具主要依賴于某些光敏蛋白在特定波長(zhǎng)的光照后發(fā)生二聚化，形成同源或異源二聚體來(lái)進(jìn)行基因表達(dá)、代謝工程和細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)燃?xì)胞活動(dòng)的精準(zhǔn)時(shí)空控制［79，80］.而利用化學(xué)手段對(duì)肽和蛋白質(zhì)功能進(jìn)行光學(xué)控制是通過(guò)引入光不穩(wěn)定的光籠基團(tuán)來(lái)實(shí)現(xiàn)的.已開(kāi)發(fā)出可摻入活細(xì)胞中蛋白質(zhì)和肽的光籠式遺傳編碼非天然氨基酸（Unnatural amino acids，UAA）［78］.將籠狀氨基酸策略性地插入到感興趣的蛋白質(zhì)的關(guān)鍵殘基上，通過(guò)掩蔽重要的化學(xué)功能或產(chǎn)生空間位阻來(lái)干擾其功能.隨著光籠基團(tuán)的光解，氨基酸恢復(fù)其天然狀態(tài)，從而恢復(fù)野生型蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能.利用UAA誘變技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)功能進(jìn)行光學(xué)控制的許多應(yīng)用已經(jīng)得到證實(shí)，包括蛋白質(zhì)定位控制、DNA轉(zhuǎn)錄、DNA重組、內(nèi)含肽剪接、蛋白質(zhì)磷酸化等細(xì)胞活動(dòng)［82~87］.Müller等［81］用PhyBPIF6這一對(duì)光敏蛋白控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄.紅光照射將PhyB轉(zhuǎn)化為FR型（PhyBFR），并通過(guò)TetR將PIF6連接到（tetO）n操作位點(diǎn)，從而誘導(dǎo)異二聚化.PhyB融合VP16結(jié)構(gòu)域招募轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物并觸發(fā)最小啟動(dòng)子PhCMVmin的激活.吸收遠(yuǎn)紅光子（740 nm）將PhyB轉(zhuǎn)化為R型（PhyBR）并觸發(fā)與PIF6的分離，從而導(dǎo)致靶啟動(dòng)子失活和轉(zhuǎn)錄沉默［圖7（A）］.Kennedy等［82］用CRY2-CIB1光遺傳系統(tǒng)，在藍(lán)光照射下以亞秒時(shí)間分辨率和亞細(xì)胞空間分辨率實(shí)現(xiàn)二聚化.并通過(guò)光誘導(dǎo)蛋白質(zhì)易位、轉(zhuǎn)錄和Cre重組酶介導(dǎo)的DNA重組來(lái)證明這個(gè)系統(tǒng)的實(shí)用性［圖7（B）］.Hemphill等［85］在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中將光籠化賴氨酸位點(diǎn)特異性地?fù)饺氲絋7 RNA polymerase活性位點(diǎn)中，使其失去活性，365 nm紫外光照射后，T7 RNA polymerase恢復(fù)活性，轉(zhuǎn)錄生成RNA.由此實(shí)現(xiàn)mRNA的光誘導(dǎo)蛋白表達(dá)或shRNA干擾的光誘導(dǎo)基因沉默［圖7（C）］.Luo等［86］將光籠化酪氨酸或光籠化賴氨酸摻入Cre重組酶中，導(dǎo)致Cre無(wú)法介導(dǎo)重組，此時(shí)報(bào)告質(zhì)粒只表達(dá)DsRed，產(chǎn)生紅色熒光細(xì)胞.365 nm光照使Cre去籠化，Cre重組酶活性恢復(fù)，切除loxP側(cè)翼的DsRed編碼區(qū)，DsRed的表達(dá)被關(guān)閉，EGFP的表達(dá)被打開(kāi)，從而產(chǎn)生綠色熒光細(xì)胞［圖7（D）］.

Fig.7 Photoswitchable Peptides and Proteins

3 光控CRISPR技術(shù)

CRISPR-Cas技術(shù)自誕生以來(lái)發(fā)展迅速，以其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作容易和多樣化的特點(diǎn)逐漸成為生命科學(xué)最熱門的技術(shù).目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因治療、農(nóng)作物改善、核酸定位及核酸檢測(cè)等領(lǐng)域.CRISPRCas基因編輯系統(tǒng)僅借助Cas蛋白和引導(dǎo)RNA即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)序列的基因編輯［17，88，89］.然而，CRISPRCas系統(tǒng)本身在時(shí)間上和空間上的可控性非常有限.在各種調(diào)控策略中，光調(diào)控已被證明是一種理想的非侵入性調(diào)控策略，其可以很容易地監(jiān)測(cè)生物活性分子的釋放，具有高時(shí)空精度.將光這種無(wú)創(chuàng)的外部手段引入CRISPR-Cas系統(tǒng)，能夠有效地改善CRISPR基因編輯系統(tǒng)中可能存在的脫靶性、病毒遞送載體的潛在致癌性等問(wèn)題［14，90~93］.這種通過(guò)光來(lái)可控性操縱的基因編輯技術(shù)打開(kāi)了時(shí)空調(diào)控基因編輯的大門，為基因編輯技術(shù)在生命活動(dòng)的調(diào)控和疾病治療方面的應(yīng)用提供了新思路［90~93］.

3.1 基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的光學(xué)控制

CRISPR-Cas系統(tǒng)是廣泛用于基因編輯的有力工具.為了使其更加精準(zhǔn)地發(fā)揮作用，對(duì)CRISPRCas基因編輯系統(tǒng)在時(shí)空上進(jìn)行光調(diào)控一直是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)［90~92］.這是一個(gè)通過(guò)光來(lái)非常精確地控制基因編輯的有效新系統(tǒng).通過(guò)給傳統(tǒng)的CRISPR-Cas系統(tǒng)加上光控制“開(kāi)關(guān)”，只有光照射時(shí)，系統(tǒng)才可以工作，從而極大地降低脫靶效應(yīng)，并利用光控技術(shù)本身的優(yōu)勢(shì)實(shí)現(xiàn)時(shí)空特異性的精準(zhǔn)基因編輯［94~96］.目前，大多數(shù)工作主要圍繞Cas蛋白、引導(dǎo)RNA以及遞送系統(tǒng)的光誘導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)CRISPR-Cas系統(tǒng)的光操控.這些研究開(kāi)發(fā)出了一系列精準(zhǔn)、時(shí)空可控的基因編輯技術(shù)平臺(tái)，將CRISPR-Cas系統(tǒng)發(fā)展成為一種精確的時(shí)間和空間控制儀器，展現(xiàn)出了低脫靶效應(yīng)、低毒性、高時(shí)空特異性等優(yōu)勢(shì)，有望應(yīng)用于基因功能的研究，以及遺傳病、腫瘤等多種疾病的精準(zhǔn)可控治療［93~99］.如1.2節(jié)和1.3節(jié)所述，Cas蛋白的光學(xué)控制一般通過(guò)光控蛋白-蛋白相互作用的光遺傳學(xué)工具或摻入光籠化的氨基酸來(lái)實(shí)現(xiàn)［54~56，79~82，94~96，100］，而引導(dǎo)RNA的光學(xué)控制則主要通過(guò)修飾光籠核苷酸的方式來(lái)完成［52，55，97，98，101］.

Fig.8 Light?controlled CRISPR?Cas system

3.2 光誘導(dǎo)CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas13系統(tǒng)

近年來(lái)，隨著光遺傳學(xué)工具的發(fā)展和CRISPR-Cas系統(tǒng)研究的深入，已開(kāi)發(fā)出多個(gè)基于CRISPRCas9系統(tǒng)和CRISPR-Cas13系統(tǒng)的光調(diào)控工具，這些工具已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、生物工程、疾病治療等領(lǐng)域的探究.Pan等［90］研究設(shè)計(jì)了一種基于上轉(zhuǎn)換納米粒子（UCNPs）的CRISPR-Cas9遞送系統(tǒng)，CRISPR-Cas9通過(guò)光敏分子ONA錨定在UCNP上，然后用聚乙烯亞胺（PEI）包被，以形成納米顆粒.近紅外光照射后，經(jīng)過(guò)UCNPs的轉(zhuǎn)換，光敏分子被切斷，CRISPR-Cas9體系從納米顆粒中釋放出來(lái)，并將它們按需遞送給細(xì)胞.該系統(tǒng)在近紅外光的調(diào)控下，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均可實(shí)現(xiàn)靶基因的敲除，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［圖8（A）］.Nihongaki等［94］利用Magnet蛋白和分裂Cas9構(gòu)建了一種光激活Cas9核酸酶系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了可逆地光控基因組編輯.研究人員將Cas9蛋白分成2個(gè)失活的片段，每個(gè)片段連接1個(gè)Magnet蛋白.當(dāng)藍(lán)光照射時(shí)，2個(gè)Magnet蛋白結(jié)合到一起，分開(kāi)的Cas9片段隨之結(jié)合重建，Cas9核酸酶活性開(kāi)啟.當(dāng)切斷光線時(shí)，核酸酶會(huì)再度分裂，Cas9活性終止［圖8（B）］.Hemphill等［96］利用遺傳編碼的光籠技術(shù)，在Cas9蛋白上插入了一個(gè)可光去除的保護(hù)基團(tuán)光籠化賴氨酸（PCK），讓蛋白的切割能力更好地失活.雙報(bào)告基因熒光檢測(cè)表明，Cas9 K866PCK突變體無(wú)活性，而在紫外光照射后，顯示出與野生型Cas9同樣的切割活性.這種光誘導(dǎo)Cas9系統(tǒng)能夠讓內(nèi)源的基因表達(dá)沉默［圖8（C）］.Liu等［97］開(kāi)發(fā)了一種籠化RNA策略，研究者在引導(dǎo)RNA遠(yuǎn)端引入2～3個(gè)可光脫籠的非天然堿基來(lái)導(dǎo)致錯(cuò)配，并阻止了目標(biāo)DNA的完全解旋和HNH結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化.利用籠化引導(dǎo)RNA的策略，使Cas9蛋白首先結(jié)合DNA，直到光照激活后才發(fā)生切割.此方法被命名為very fast CRISPR，可在亞微米級(jí)別和秒的量級(jí)引起DNA雙鏈斷裂，能夠在空間、時(shí)間和基因組坐標(biāo)上進(jìn)行高分辨率的DNA修復(fù)研究［圖8（D）］.Zhao等［100］以靶向RNA的CRISPR-Cas13為基礎(chǔ)，成功構(gòu)建了以Cas13為基礎(chǔ)的光控RNA m6A編輯新工具PAMEC，該工具能夠時(shí)空特異性地進(jìn)行m6A編輯，與上轉(zhuǎn)換納米技術(shù)結(jié)合可進(jìn)一步擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，該方法可用于調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程且具有活體RNA編輯的潛力［圖8（E）］.Qi等［101］研究了一種基于CRISPR-Cas13a的新型光誘導(dǎo)合成系統(tǒng)，該系統(tǒng)可用于腫瘤細(xì)胞中的RNA敲除和結(jié)合.在合成分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一種光傳感器，在藍(lán)光照射下能夠有效誘導(dǎo)Cas13a蛋白的表達(dá).所開(kāi)發(fā)的合成光開(kāi)關(guān)系統(tǒng)能夠抑制MALAT1基因的表達(dá).他們的研究為研究基因網(wǎng)絡(luò)中的RNA功能和精確的腫瘤治療提供了一種新技術(shù).Fan等［102］開(kāi)發(fā)了一種基于CRISPR-Cas13a基因回路的多功能脂質(zhì)體系統(tǒng).該系統(tǒng)采用近紅外光釋放的近紅外光敏劑來(lái)控制給藥系統(tǒng)；用crRNA串聯(lián)序列構(gòu)建質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)多靶向性和更廣泛的治療效果.這種具有近紅外激光控制能力的腫瘤細(xì)胞靶向脂質(zhì)遞送系統(tǒng)為基于CRISPR-Cas13a的膀胱癌基因治療提供了一種多功能策略［圖8（F）］.

4 總結(jié)與展望

CRISPR-Cas技術(shù)在基因編輯、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、遺傳病等重大疾病的治療、農(nóng)作物改善和核酸檢測(cè)等領(lǐng)域均有重要應(yīng)用.該技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快捷、高效和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn).在各種調(diào)控策略中，光調(diào)控已被證明是一種理想的非侵入性調(diào)控元件，具有安全低毒、無(wú)創(chuàng)、快速響應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被用來(lái)控制高時(shí)空分辨率的生物過(guò)程.靈活地借助光開(kāi)發(fā)出了一系列精準(zhǔn)、時(shí)空可控的基因編輯技術(shù)平臺(tái)，展現(xiàn)出了低脫靶效應(yīng)，低毒性，高度時(shí)空特異性等優(yōu)勢(shì).利用光在特異的位點(diǎn)激活基因，可以更好地研究基因的功能，構(gòu)建出更理想的生物研究模型.

光控CRISPR技術(shù)目前仍存在許多尚未解決的問(wèn)題［23，25~27，103~111］：（1）光調(diào)控技術(shù)面臨著光毒性、光漂白等問(wèn)題，有待改進(jìn).由于光照波長(zhǎng)的限制面臨穿透能力受限的問(wèn)題，目前只能在細(xì)胞水平和某些模式生物水平上對(duì)細(xì)胞生命過(guò)程和特定基因調(diào)控過(guò)程進(jìn)行研究.對(duì)于深層組織的研究治療，波長(zhǎng)越長(zhǎng)越好，這樣可以穿透到深層部位，但是發(fā)熱效應(yīng)也會(huì)隨之增加.未來(lái)需要著眼于更多光遺傳學(xué)工具的開(kāi)發(fā)和創(chuàng)新以及更高等生物體系的研究.（2）CRISPR介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)存在一定的脫靶率，并沒(méi)有完美的特異性，若將其應(yīng)用于臨床，“脫靶效應(yīng)”可能會(huì)導(dǎo)致不必要的突變和潛在的毒性.雖然為降低CRISPR-Cas9技術(shù)的脫靶效應(yīng)進(jìn)行了很多研究，如切口酶的使用、合理設(shè)計(jì)和修飾引導(dǎo)RNA以及開(kāi)發(fā)Cas9突變體來(lái)篩選低脫靶的蛋白，這些研究能夠在一定程度上提高CRISPR基因編輯的專一性，但是該技術(shù)的脫靶效應(yīng)仍然需要進(jìn)一步優(yōu)化.（3）目前，病毒載體和質(zhì)粒仍是CRISPR-Cas系統(tǒng)最主要的遞送形式.這種遞送方式使得基因編輯工具在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)更持久，但持續(xù)表達(dá)會(huì)增加脫靶風(fēng)險(xiǎn).此外，外源DNA的引入會(huì)造成對(duì)內(nèi)源基因的潛在破壞，帶來(lái)未知的安全隱患.蛋白質(zhì)和核酸運(yùn)載體的發(fā)展為CRISPR-Cas系統(tǒng)的輸入提供了新思路，但胞內(nèi)蛋白酶及核酸酶的存在使其穩(wěn)定性受到影響，Cas蛋白在部分個(gè)體內(nèi)所引起的免疫反應(yīng)也不容忽視.如何進(jìn)一步提高遞送效率，降低免疫原性，從而實(shí)現(xiàn)高效而安全的基因組編輯，仍是CRISPR-Cas基因編輯技術(shù)未來(lái)需要解決的問(wèn)題.（4）CRISPR基因編輯技術(shù)所帶來(lái)的倫理問(wèn)題也不容忽視，相關(guān)規(guī)范制度需要不斷完善，以預(yù)防該技術(shù)的濫用所造成的不良后果.

這種光操縱的基因編輯技術(shù)打開(kāi)了時(shí)空調(diào)控基因編輯的大門，為基因編輯技術(shù)在眾多研究領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新思路.隨著CRISPR技術(shù)、光遺傳學(xué)和光化學(xué)生物等學(xué)科的發(fā)展和相關(guān)研究、開(kāi)發(fā)的深入，光控CRISPR技術(shù)將不斷成熟和完善，未來(lái)將會(huì)開(kāi)發(fā)出更多更廣泛的應(yīng)用.