唐文文 王丹丹 沈易華

(銅仁職業(yè)技術學院，貴州 銅仁 554300)

天麻(Gastrodia elata Bl.)，又名赤箭、離母、神草、定風草等，是蘭科多年生異養(yǎng)寄生型草本植物，具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡的功效[1]，為我國傳統(tǒng)名貴大宗中藥材。在西南地區(qū)的天麻主產區(qū)均有鮮食天麻的歷史，主要食用方法為做菜、燉肉、煮火鍋等。天麻因其營養(yǎng)成分高，具有多種醫(yī)療保健功效，將越來越受到關注。天麻也將從炮制品應用模式轉化為鮮天麻與炮制品共同應用模式。本研究以天麻多糖、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛為指標成分，對鮮天麻及不同炮制品天麻進行差異性分析，為鮮天麻及不同炮制品的合理利用提供指導。

1 材料與試劑

1.1 材料

試驗用天麻于2020年11月中旬采之于貴州省德江縣天麻種植區(qū)，經銅仁職業(yè)技術學院梁玉勇教授鑒定為蘭科植物天麻(Gastrodia elata Bl.)。

1.2 儀器與試劑

Agilent1260高效液相色譜儀(安捷倫有限公司)；UV-1801紫外可見分光光度計(北京瑞麗分析儀器有限公司)；Kromasil-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；天麻素(批號：110807-202010，純度以95.5%計)購自于中國食品藥品檢定研究院；對羥基苯甲醇(批號：H21D6Q7813，純度≥98%)、對羥基苯甲醛(批號：Y02J7C15574，純度≥99%)均購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈(色譜純，美國TEDIA)；葡萄糖對照品(國藥集團化學試劑有限公司)。

2 方法

2.1 樣品處理方法

選擇大小均一的鮮天麻(100 g～150 g)，鮮天麻及其不同炮制品制備工藝見表1，制備后，抽真空包裝，儲存于4 ℃冰箱，直至分析。

表1 試驗處理設置表

2.2 天麻多糖的含量測定

天麻多糖：采用硫酸-苯酚法，參考楊天友等[2]的方法進行，以葡萄糖質量濃度為橫坐標(X)、吸光度值為縱坐標(Y)繪制葡萄糖標準曲線，標準曲線的線性回歸方程為 Y=0.0081X-0.0039，R2=0.9994。供試品溶液的制備方法修改如下：分別精密稱取各樣品，加入樣品重100倍體積的95%乙醇浸泡過夜，過濾，等濾渣揮發(fā)至無醇味時，加入液料比50：1的純化水，密塞搖勻，稱定重量，超聲30 min，稱重，用蒸餾水補足減失重量，90 ℃水浴回流提取1.5 h，4000 r·min-1離心10 min，精密吸取上清液5 mL至10 mL于容量瓶，加水定容，搖勻即得。

2.3 酚類成分的含量測定[3-5]

2.3.1 色譜條件 Kromasil-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為 0.05%乙酸水(A)-乙腈(B)；梯度洗脫(0 min～25 min，97%～90%A；25 min～35 min，90%～80% A；35 min～46 min，80%～0 A；46 min～50 min，0～97% A)；體積流量1.0 mL·min-1；檢測波長 220 nm；柱溫 30 ℃；進樣量10 μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取各對照品適量，加10%甲醇配制成含天麻素4.725 mg·mL-1、對羥基苯甲醇1.994 mg·mL-1、對羥基苯甲醛2.502 mg·mL-1的混合對照品儲備溶液。將混合對照品貯備溶液用10%甲醇稀釋25倍，得混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 FG樣品先切塊，然后利用勻漿機充分勻漿，使顆粒大小均勻；G1-G5各樣品粉碎后過3號篩，置精密稱取各樣品適量，置于具塞的錐形瓶中，按20：1的液料比加入稀乙醇溶液，搖勻稱重，超聲處理(200 W，40 kHz)40 min，放冷，再稱量質量，用稀乙醇補足重量，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，濃縮至近干無醇味，殘渣加 10%甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中，用10%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 線性關系考察 精密吸取混合對照品儲備溶液0.25 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL置于25 mL容量瓶中，用10%甲醇溶液稀釋至刻度，制成一系列對照品溶液，按2.3.1 項下色譜條件，進樣量10 μL，測定各對照品峰面積。以峰面積(Y)對應對照品的濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程，天麻素Y=18107X-32.676 R2=0.9999，線性范圍：0.04725 mg·mL-1～0.756 mg·mL-1；對羥基苯甲醇Y=36854X-14.288 R2=0.9998，線性范圍：0.01994 mg·mL-1～0.319 mg·mL-1；對羥基苯甲醛Y=49776x + 170.57 R2=0.9997，線性范圍：0.02502 mg·mL-1～0.4003 mg·mL-1。

2.3.5 精密度、穩(wěn)定性和重復性試驗 精密吸取上述混合對照品溶液10 μL，按照上述色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，即得天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛峰面積的RSD均小于2.0%；取G5樣品供試品溶液，在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h時，按上述色譜條件進樣，按峰面積計算，天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛峰面積的RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定；取E樣品按照供試品溶液的制備方法平行制備6份，按上述色譜條件測定含量，得天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛含量的RSD均小于3.0%。

2.3.6 加樣回收率試驗 稱取已知含量G5樣品粉末約1.0 g，共6份，精密稱定，分別精密加入天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛對照品適量，按供試品溶液制備方法處理，再按上述色譜條件進樣測定，得天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛的回收率在98.6%～102.5%之間，RSD均小于3.0%。

2.3.7 樣品測定 分別精密吸取對照品溶液和不同處理的供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，分別記錄天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛的峰面積，按外標法計算供試品中3種物質的含量。HPLC色譜圖見圖1。

圖1 天麻HPLC色譜圖：(1)為對照品(2)為樣品注：1.天麻素2.對羥基苯甲醇3.對羥基苯甲醛

3 結果與分析

3.1 鮮天麻及其不同炮制品多糖含量比較

天麻多糖是天麻中重要的活性成分之一，具有降壓、抗氧化、改善腦血流量、增強免疫、抗氧化等作用。鮮天麻及其不同炮制品多糖含量見圖2，由圖2可知，采用蒸制后“發(fā)汗”加工的天麻炮制品多糖含量最高，為27.67%，顯著高于其他樣品，應該是由于天麻在“發(fā)汗”過程中其復雜苷類成分水解釋放出葡萄糖[6]；直接烘干和蒸后烘干多糖含量次之，分別為23.78%和24.59%；水煮后烘干和明礬水浸泡的樣品天麻多糖顯著低于其他樣品，僅為16.98%和18.29%，應該是天麻采用這兩種工藝炮制過程中與水接觸過多，從而造成了天麻多糖在天麻水煮和明礬水浸泡過程中部分溶解造成其含量降低；鮮天麻的多糖含量為21.33%，應該跟鮮天麻在等待測試過程中在4℃冰箱中保存時間過久有關。

圖2 鮮天麻及其不同炮制品多糖含量(x±s，n=6)注：小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

3.2 鮮天麻及其不同炮制品天麻素及其苷元含量對比

《中國藥典》[1]把天麻素和對羥基苯甲醇的含量作為判定天麻質量優(yōu)劣的主要指標，規(guī)定天麻中兩者的總含量不得少于0.25%。由表2可以看出不同炮制品之間天麻素及其苷元對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛差異顯著，天麻素含量最高的為蒸制后“發(fā)汗”樣品，為8.83 mg·g-1，應該是由于通過“發(fā)汗”過程中的一些酶促反應，一部分對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛和巴利森苷類再次轉化成了天麻素；直接烘干的天麻素含量顯著低于其他樣品，僅為0.78 mg·g-1，但其對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛含量顯著高于其他樣品，其中對羥基苯甲醇高達9.63 mg·g-1，推測由于天麻未經殺青，在低溫干燥過程中，酶活性一直較強，天麻體內發(fā)生著極活躍的酶解反應，天麻素被酶解成對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛，天麻素和對羥基苯甲醇的含量呈現基本相反的趨勢，即天麻素的含量高的話，對羥基苯甲醇含量將減少，反之亦然；由表2可知，鮮天麻的天麻素含量也較低，為1.156 mg·g-1，但其對羥基苯甲醇的含量達5.32 mg·g-1，經蒸制和煮制殺青處理后天麻素含量顯著升高，對羥基苯甲醇含量顯著降低；另外水煮炮制品和明礬浸泡處理后天麻素的含量也降低，跟天麻素是苷類化合物易溶于水的性質有關。

表2 鮮天麻及其不同炮制品天麻素及其苷元含量(ˉx±s，n=6)

4 結論

通過對比鮮天麻及其不同炮制品中多糖、天麻素及其苷元的含量，發(fā)現鮮天麻及其不同炮制品主要功效成分含量存在顯著差異，其中以采用蒸制后“發(fā)汗”再烘干的樣品天麻多糖和天麻素含量均為最高，說明“發(fā)汗”處理對天麻有效成分具有一定的良性影響，且“發(fā)汗”可以增加天麻體內部水分擴散速率，減少內部水分在天麻體中的滯留，加速天麻干燥速率，可根據需要應用于實際生產中。“發(fā)汗”過程中的溫度、次數、含水量等因素對藥材品質是否也有影響，圍繞“發(fā)汗”過程與天麻品質形成的關鍵科學問題將在后續(xù)試驗中進行，鮮天麻中和直接干燥天麻中對羥基苯甲醇含量最高，可根據所需目標成分有選擇性的使用，但要注意，鮮天麻因酶活性高，有效成分降解快，采挖后應及時加工炮制。