石海杰，趙振東

地中海貧血（thalassemia，以下簡(jiǎn)稱(chēng)地貧）又稱(chēng)為海洋性貧血，是最常見(jiàn)的單基因常染色體隱性遺傳病，主要包括α地貧和β地貧兩種類(lèi)型。其共同特點(diǎn)是由于機(jī)體血紅蛋白α鏈或β鏈合成減少，使紅細(xì)胞不能攜帶足夠的氧氣，導(dǎo)致患者幼兒時(shí)期便有貧血相關(guān)癥狀出現(xiàn)并持續(xù)終生[1]，多數(shù)患者病癥為慢性進(jìn)行性溶性貧血[2]。部分特定人群少樣本量研究[3-5]已經(jīng)證實(shí)海南省是地貧的高發(fā)地區(qū)，但縣級(jí)以上規(guī)模人群地貧基因篩查相關(guān)的報(bào)道較少，因此，現(xiàn)將涵蓋白沙黎族自治縣（以下簡(jiǎn)稱(chēng)白沙縣）新生兒地貧基因攜帶情況及其特點(diǎn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取在海南省白沙縣各助產(chǎn)單位2020年出生的新生兒作為研究對(duì)象，采取知情同意自愿原則，即所有新生兒監(jiān)護(hù)人簽署了知情同意書(shū)后再進(jìn)行樣本采集。在932例新生兒當(dāng)中共收集到912例樣本，其中男507例、女405例。本研究經(jīng)海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)〔倫申第（028）號(hào)〕。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集 按照《新生兒疾病篩查血片采集技術(shù)規(guī)范》（WS376.3-2013）要求，采集出生滿(mǎn)3～20 d 的新生兒足跟血，垂直滴于新生兒篩查采集卡上制成直徑>5 mm的3～4個(gè)血斑，自然晾干后的干血斑密閉封口袋內(nèi)置于2～8 ℃冰箱暫存，定期送至海南省新生兒疾病篩查中心待檢。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器 SLAN-96S全自動(dòng)定量PCR儀（上海宏石醫(yī)療科技有限公司），Lab-Aid824s全自動(dòng)DNA提取儀（廈門(mén)致善生物科技股份有限公司），HB-2012A醫(yī)用核酸分子雜交儀（廣州凱普醫(yī)藥生物科技有限公司），2081Panthera-PuncherTM9型打孔儀（芬蘭鉑金埃爾默有限公司），721G分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑 （1）地貧基因檢測(cè)試劑：熔解曲線(xiàn)法α地貧試劑盒、非缺失α地貧試劑盒、β地貧基因試劑盒及Lab-Aid824s核酸提取Micro試劑盒（廈門(mén)致善生物科技股份有限公司）。（2）地貧基因驗(yàn)證試劑：血液基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）和α、β地貧基因檢測(cè)試劑盒（PCR+導(dǎo)流雜交法）（廣州凱普醫(yī)藥生物科技有限公司），α地貧試劑盒（PCR法）、非缺失α地貧和β地貧基因試劑盒（PCR+反向雜交法）（深圳亞能生物技術(shù)有限公司）。

1.2.3 基因檢測(cè)方法

1.2.3.1 基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 打孔儀打下6～8個(gè)直徑3 mm的干血斑置于離心管中，使用磁珠法提取干血斑DNA，然后使用熔解曲線(xiàn)法對(duì)所提取到的DNA進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)范圍涵蓋試劑盒所能檢出的地貧基因型。

1.2.3.2 基因驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 再次使用打孔儀打下6～8個(gè)直徑3 mm的干血斑置于離心管中，柱狀法提取DNA，然后使用凱普地貧基因試劑盒和亞能基因試劑盒進(jìn)行地貧基因驗(yàn)證。

1.2.3.3 新基因型驗(yàn)證 熔解曲線(xiàn)法地貧基因試劑盒提示的未知突變樣本外送基因公司進(jìn)行基因型分析。

1.2.3.4 結(jié)果判讀 嚴(yán)格按照每種地貧基因試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化判讀。

1.3 質(zhì)量控制 （1）干血斑樣本驗(yàn)收：合格的干血斑要雙面滲透均勻，不能受到化學(xué)制劑的污染，不能風(fēng)干或曬干。信息記錄完整，血斑不能有血凝塊。（2）提取DNA濃度純度驗(yàn)證：依據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)，DNA樣本的OD260nm/OD280nm應(yīng)在1.6～2.0。（3）實(shí)驗(yàn)操作：每個(gè)步驟嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)和設(shè)備使用程序進(jìn)行，每批實(shí)驗(yàn)各設(shè)立陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 觀察指標(biāo) 出生人數(shù)、篩查人數(shù)、檢出地貧人數(shù)、篩查率、檢出率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述。計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示。

2 結(jié)果

2.1 海南省白沙縣2020年新生兒地貧基因篩查基本情況白沙縣2020年地貧基因篩查率為97.9%；共檢出地貧基因異常608例，海南省白沙縣地貧基因攜帶率為66.7%。在340例漢族檢測(cè)人群中檢出地貧175例，漢族地貧基因攜帶率為51.5%；在540例黎族檢測(cè)人群中檢出地貧414例，黎族地貧基因攜帶率高達(dá)76.7%；在32例其他少數(shù)民族檢測(cè)人群中檢出地貧19例，其他少數(shù)民族地貧基因攜帶率為59.4%，不同民族地貧基因篩查情況詳見(jiàn)表1。

表1 海南省白沙縣2020年新生兒地中海貧血基因篩查情況Table 1 Basic situation of neonatal thalassemia gene screening in Baisha County，Hainan Province in 2020

2.2 海南省白沙縣新生兒地貧基因類(lèi)型及檢出率 本次針對(duì)地貧基因的篩查中，共檢出試劑盒中包含的34種類(lèi)型，其中α地貧基因型為最多，共檢出521例；其次是α地貧復(fù)合β地貧基因型，共檢出62例；β地貧基因型最少，共檢出 25例。其中-α3.7/αα、-α4.2/αα 和 αWSα/αα 基因型排在所有檢出基因型的前三位，分別占26.3%、23.8%和12.7%，并檢出-α4.2/HKαα、c.118C>T和c.309C>T三種少見(jiàn)地貧基因型。詳見(jiàn)表2～4。

表2 海南省白沙縣新生兒α地貧基因型及檢出率Table 2 Genetic types and detection rates of neonatal α thalassemia in Baisha County，Hainan Province

表3 海南省白沙縣新生兒β地貧基因型及檢出率Table 3 Gene types and detection rate of βthalassemia in newborn population of Baisha County，Hainan Province

表4 海南省白沙縣新生兒α地貧復(fù)合β地貧基因型及檢出率Table 4 Genetic types and detection rates of α thalassemia combined with β thalassemia in newborn population of Baisha County，Hainan Province

3 討論

有研究數(shù)據(jù)表明，全世界每年有超過(guò)33萬(wàn)的新生兒血紅蛋白異常，其中就有17%是地貧患兒[6]。而且地貧癥狀一般隱匿性強(qiáng)，患兒出生3～6個(gè)月才逐漸出現(xiàn)嚴(yán)重貧血的典型地貧癥狀，并常伴有發(fā)育遲緩、骨骼異常等癥狀，嚴(yán)重者甚至可能出現(xiàn)心力衰竭等并發(fā)癥，重型患者如不盡早進(jìn)行干預(yù)治療，多于5歲前死亡[7]。海南省已見(jiàn)地貧相關(guān)的多篇成人文獻(xiàn)[3-5]，但還未見(jiàn)針對(duì)新生兒群體的地貧報(bào)道。

2020 年白沙縣內(nèi)各助產(chǎn)單位活產(chǎn)新生兒932例，因部分家長(zhǎng)拒絕參與篩檢，實(shí)際收集到樣本912例，篩查率達(dá)97.9%（912/932），因此受檢人群能代表全體白沙縣新生兒人群。本次篩查共檢出608例地貧基因異常新生兒，海南省白沙縣地貧基因攜帶率高達(dá)66.7%，分析原因可能與民族構(gòu)成有關(guān)，本次篩查樣本中黎族540例，而漢族僅為340例，黎族比例高，黎族地貧基因高攜帶率[9]已是不爭(zhēng)事實(shí)，白沙縣地處海南省中部山區(qū)，交通極為不便，外輸人口少，推測(cè)民族之間通婚發(fā)生了基因融合，導(dǎo)致了該地區(qū)新生兒地貧基因的高攜帶率。目前國(guó)內(nèi)尚未有文章報(bào)道如此高的地貧基因攜帶率。因此本研究抽取前81例樣本采用凱普基因試劑盒驗(yàn)證，抽取中間35例樣本使用亞能地貧基因試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與熔解曲線(xiàn)法檢測(cè)的地貧結(jié)果完全一致。這證明海南省白沙縣新生兒群體地貧基因攜帶率確實(shí)高，需要引起有關(guān)部門(mén)的注意，白沙縣并非海南省唯一少數(shù)民族自治縣，黎族地貧基因高攜帶率已被認(rèn)知，大量的黎族同胞聚居昌江、樂(lè)東、瓊中等七個(gè)少數(shù)民族市縣的情況下，建議海南省政府應(yīng)在白沙縣等少數(shù)民族聚居地進(jìn)行新生兒地貧基因篩查，以提高少數(shù)民族地區(qū)出生人口素質(zhì)和生活質(zhì)量、降低新生兒的死亡率。

本研究中白沙縣黎族新生兒人群地貧基因攜帶率最高，達(dá)76.7%，高于漢族的51.5%和其他少數(shù)民族的59.4%，這驗(yàn)證了“黎族是地貧基因攜帶率高的民族”的結(jié)論[9]。

海南省白沙縣地貧基因型豐富，本次共檢出34種基因型，地貧基因型分類(lèi)以α地貧基因型為主，這符合地貧在中國(guó)南方的分布特征[10-11]，而不同于重慶地區(qū)以β地貧基因型為主的狀況[12]。白沙縣α地貧基因型以-α3.7/αα、-α4.2/αα和αWSα/αα最常見(jiàn)，這與海南陵水縣[13]具有相似之處，可能原因?yàn)榱晁h和白沙縣均屬于黎族自治縣，但因?yàn)槔枳迦丝谒急壤煌杂袇^(qū)別。白沙縣β地貧基因型以βCD41-D42/βN多見(jiàn)，這與四川地區(qū)[14]一致，而與貴州[15]有別，進(jìn)一步驗(yàn)證了地貧基因分布存在地域特征[16-17]。在發(fā)現(xiàn)的3種少見(jiàn)基因型中有2例少見(jiàn)基因型c.309C>T，這是試劑盒未涵蓋的位點(diǎn)，經(jīng)熔解曲線(xiàn)圖外送基因測(cè)序得到了證實(shí)，該突變是一種錯(cuò)義突變，目前還無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。其余兩種少見(jiàn)基因型已有報(bào)道[18]。

鑒于海南省是地貧的高發(fā)地區(qū)，海南省政府特別重視地貧防控，從2012年開(kāi)始便將地貧納入婚檢項(xiàng)目，在婚檢和孕檢人群中開(kāi)展地貧篩查，建立地貧防控工作與免費(fèi)婚檢工作相結(jié)合的新機(jī)制。雖然兒童地貧患病率有減低趨勢(shì)[19]，但有報(bào)道稱(chēng)海南省海口市和三亞市新生兒人群中地貧發(fā)生率仍高達(dá)5%[20]和7.85%[19]，地貧患兒的營(yíng)養(yǎng)和發(fā)育狀況更差[21]，因此在婚檢和孕檢中進(jìn)行地貧防控的前期，應(yīng)該在新生兒人群進(jìn)行地貧基因篩檢，這將是對(duì)地貧防控網(wǎng)絡(luò)的必要而有益補(bǔ)充。

對(duì)于新生兒群體來(lái)講，傳統(tǒng)的血常規(guī)、電泳及基因檢測(cè)聯(lián)合篩查地貧方式存在著諸多不利因素，因此借助新生兒疾病篩查濾紙干血斑進(jìn)行地貧基因檢測(cè)，不用重復(fù)采血，有利于群體性篩查，而且該方法也得到了臨床驗(yàn)證[22-23]。

總之，海南省白沙縣新生兒人群中地貧基因攜帶率高，以α 地貧基因型最為常見(jiàn)。本研究對(duì)白沙地區(qū)地貧篩檢提供了參考，也為政府決策部門(mén)制定地貧防控策略提供了有力的數(shù)據(jù)支持。

本研究局限性：

（1）只統(tǒng)計(jì)了白沙縣新生兒地貧基因的高攜帶率，但限于目前對(duì)于地貧的認(rèn)知水平和隨訪(fǎng)中存在著家長(zhǎng)配合度等各種困難，并未在此論述地貧基因型與表型的關(guān)系；在臨床表型中，輕型和靜止型患者與常人無(wú)異，因此并未對(duì)此加以詳述，但此研究證明了白沙縣新生兒地貧的高攜帶率，這為政府決策部分地貧防控提供了方向；（2）本研究使用的基因試劑盒涵蓋的位點(diǎn)雖然較多，未檢出地貧樣本也不一定未攜帶地貧基因，也可能為其他罕見(jiàn)型，這需要不斷隨訪(fǎng)來(lái)證實(shí)；（3）地貧熔解曲線(xiàn)方法只是篩選核酸序列而不是氨基酸序列，但鑒于地貧的復(fù)雜性，仍有可能發(fā)生多態(tài)性或同義突變被判讀為突變型的情況。

作者貢獻(xiàn)：石海杰負(fù)責(zé)文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、文獻(xiàn)檢索與數(shù)據(jù)提取和統(tǒng)計(jì)分析、論文撰寫(xiě)；趙振東負(fù)責(zé)文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、研究實(shí)施、數(shù)據(jù)資料收集和分析、論文的修訂和審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)。

本文無(wú)利益沖突。