陳 軍，關(guān) 欣，范翠枝，趙海燕，吳馨怡，韓 鷹，顧志壯，鄭青松，4?，鄭春芳

鹽脅迫對番茄種子萌發(fā)中多胺形態(tài)變化和抗氧化的影響*

陳 軍1，關(guān) 欣2，3，范翠枝3，趙海燕3，吳馨怡3，韓 鷹1，顧志壯3，鄭青松3，4?，鄭春芳2??

（1. 蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝科技學(xué)院，江蘇蘇州 215008；2. 溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325035；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095；4. 綿陽師范學(xué)院四川縣域經(jīng)濟(jì)發(fā)展研究中心，四川綿陽 621000）

以番茄“合作903”為材料，研究25～200 mmol·L–1NaCl脅迫對其種子發(fā)芽、種子活力指數(shù)（SVI）、丙二醛（MDA）含量、保護(hù)酶活性、溶質(zhì)積累和不同形態(tài)多胺含量的影響。結(jié)果表明：25、50 mmol·L–1NaCl處理7 d，不影響番茄種子發(fā)芽率，但顯著降低SVI；隨著鹽處理濃度上升，發(fā)芽率和SVI均顯著下降。分別以種子發(fā)芽率和SVI為因變量，NaCl處理濃度為自變量，種子萌發(fā)和萌發(fā)后幼苗建成的耐鹽閾值分別為106.1 mmol·L–1NaCl（0.62%）和43.38 mmol·L–1NaCl（0.25%）。隨著NaCl處理濃度上升，萌發(fā)種子MDA含量顯著上升，保護(hù)酶活性、可溶性蛋白（SP）和可溶性糖（SS）均上升，游離態(tài)腐胺（fPut）、游離態(tài)亞精胺（fSpd）和游離態(tài)精胺（fSpm）、（fSpd+fSpm）/fPut均顯著上升，束縛態(tài)腐胺（bPut）、束縛態(tài)亞精胺（bSpd）、束縛態(tài)精胺（bSpm）均顯著增加，而（bSpd+bSpm）/bPut變化不明顯。與對照相比，50 mmol·L–1NaCl處理下，番茄萌發(fā)種子結(jié)合態(tài)亞精胺（cSpd）、結(jié)合態(tài)精胺（cSpm）含量及（cSpd+cSpm）/cPut均極顯著上升，隨著NaCl處理濃度上升，cPut、cSpd、cSpm含量及（cSpd+cSpm）/cPut均逐漸下降。綜上所述，鹽脅迫延緩、抑制番茄種子萌發(fā)，對于萌發(fā)后幼苗的建成抑制作用更強(qiáng)。番茄種子萌發(fā)階段對鹽分具有一定的抗性，主要由于番茄萌發(fā)種子中多胺代謝在鹽脅迫下呈現(xiàn)（fSpd+fSpm）/fPut比值的急劇上升、cSpd和cSpm含量的顯著上升和束縛態(tài)各多胺的顯著積累，同時(shí)SS和SP的積累隨鹽脅迫加劇顯著積累，從而提高了萌發(fā)種子的抗氧化和滲透調(diào)節(jié)能力；但是在高鹽（150 mmol·L–1NaCl）下，cSpd和cSpm的上升調(diào)控作用明顯減弱，而束縛態(tài)各多胺、fSpd和fSpm的上升以及SS和SP積累調(diào)控作用仍在增強(qiáng)。

番茄；NaCl脅迫；萌發(fā)；抗氧化；溶質(zhì)積累；多胺代謝

土壤鹽漬化是典型的非生物逆境之一。中國鹽漬化土壤面積約366 500 km2，在全球各國排第3位，嚴(yán)重抑制植物生長，導(dǎo)致作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降，威脅著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展，也限制了經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活質(zhì)量的提升[1]。鹽漬產(chǎn)生的滲透脅迫和離子毒害，導(dǎo)致種子很低的發(fā)芽率，從而顯著降低植物生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)產(chǎn)量[2]。番茄（）是一種世界性果蔬，具有很好的氣候適應(yīng)性，從熱帶到溫帶，甚至北極圈的一些區(qū)域均可栽培種植[3]。番茄也是露地和設(shè)施栽培產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富和經(jīng)濟(jì)效益最高的果蔬之一[4]。而番茄為對鹽中度敏感的作物[5]，且又主要種植在世界溫暖和干旱地區(qū)，這些地區(qū)的土壤通常鹽度較高。因此，了解番茄等作物對鹽漬的響應(yīng)和忍受機(jī)制，深入挖掘土壤生物學(xué)潛力，就顯得迫切而有現(xiàn)實(shí)意義[4，6]。

高鹽分延遲番茄種子萌發(fā)、降低其發(fā)芽率、降低其幼苗素質(zhì)[7-9]，而其相關(guān)的機(jī)理探討甚少，且已有的研究主要集中在抗氧化[7，10-11]、離子平衡[12-13]，也有探討其內(nèi)在的激素平衡的變化[14-15]。目前有關(guān)番茄抵抗鹽脅迫中內(nèi)源多胺（PAs）的作用研究甚少，主要集中于番茄植株中內(nèi)源游離多胺代謝的研究，而番茄多胺代謝中不同形態(tài)與抗鹽關(guān)系的研究極為匱缺，番茄種子萌發(fā)中不同形態(tài)多胺變化的研究目前尚未觸及。PAs被確定為新型的植物生長物質(zhì)，屬于脂肪族含氮堿類，廣泛存在于植物界，也具有很廣泛的生理作用。PAs不僅具有植物激素的一些特性，而且它們本身還是抗氧化非酶物質(zhì)[16]。此外，PAs還可作為小分子的有機(jī)溶質(zhì)直接起滲透調(diào)節(jié)作用。PAs代謝或平衡緩解植物鹽害的文獻(xiàn)較多。最近幾年有關(guān)鹽脅迫下植物PAs代謝，如PAs的不同水平和不同化學(xué)形態(tài)、PAs合成酶活力及其基因表達(dá)等文獻(xiàn)報(bào)告也日漸增多。諸多研究表明，植物在鹽適應(yīng)中PAs水平是上升的，但也有文獻(xiàn)表明在鹽適應(yīng)過程中一些植物PAs水平是下降的[17]。甚至有研究[5]發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下番茄生長的幼苗期和坐果期PAs水平上升，而其開花期PAs水平卻又下降的現(xiàn)象。無論是上升還是下降，PAs的諸多生理作用并未被清楚解釋或闡述。一些研究表明滲透脅迫下游離態(tài)腐胺（fPut）上升是傷害性反應(yīng)，而游離態(tài)亞精胺（fSpd）和游離態(tài)精胺（fSpm）含量的上升能提高植物的抗逆性[5，16]?？鼓嫘詮?qiáng)的植物為了解除fPut的毒害，一方面能通過S-腺苷蛋氨酸脫羧酶作用使腐胺（Put）向亞精胺（Spd）和精胺（Spm）轉(zhuǎn)化，另一方面使游離態(tài)腐胺（fPut）向結(jié)合態(tài)Put（cPut）或/和束縛態(tài)Put（bPut）轉(zhuǎn)化。通過這兩方面的轉(zhuǎn)化，從而提高了植物體內(nèi)（fSpd +fSpm）/fPut的比值[18]。結(jié)合態(tài)PAs（cPAs）是指高氯酸可溶性結(jié)合態(tài)的PAs，即fPAs以酞胺鍵與一些小分子物質(zhì)如肉桂酸、阿魏酸及香豆酸等以共價(jià)鍵結(jié)合的PAs。cPAs有兩種類型：堿性酞胺和中性酞胺。前者為水溶性，具有初級胺的功能，主要由脂肪族二胺和多胺如Put、Spd、Spm等與輕基肉桂酸等共價(jià)結(jié)合而成；后者為水不溶性，無電離性質(zhì)，由脂肪族和芳香族胺如酪胺、多巴胺、色胺等作為胺底物構(gòu)成。cPAs形成分子屏障，抵御外界不良因素侵染。cSpd和cSpm可有效清除ROS，具有較其游離態(tài)更高的抗氧化能力[18-19]。束縛態(tài)PAs（bPAs）是指高氯酸不溶性結(jié)合態(tài)PAs，即fPAs與生物大分子如蛋白質(zhì)、糖醛酸或木質(zhì)素等以共價(jià)鍵結(jié)合而成的多胺。這些結(jié)合態(tài)多胺參與了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的交聯(lián)，對蛋白合成過程中的結(jié)構(gòu)修飾，具有穩(wěn)定細(xì)胞中蛋白成分的作用。束縛態(tài)多胺通過大分子的交聯(lián)穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)成分[18，20]。本研究采用目前在江蘇各地推廣使用較好的雜交番茄“合作 903”為材料，研究了不同濃度NaCl 脅迫對番茄種子萌發(fā)、幼苗生長、溶質(zhì)積累、抗氧化及不同形態(tài)和種類多胺含量的變化，揭示番茄種子萌發(fā)對鹽分的響應(yīng)機(jī)制，尤其多胺的代謝變化，以期為番茄的耐鹽栽培和育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以番茄（）品種“合作903”為試驗(yàn)材料。番茄種子表面消毒并用蒸餾水清洗干凈后，選取健壯、飽滿、大小一致的種子轉(zhuǎn)入直徑12 cm、高度5 cm的發(fā)芽盒中，進(jìn)行不同鹽處理，即向發(fā)芽盒中加入分別為0、25、50、100、150、175、200 mmol·L–1NaCl溶液，分別表示為CK、S25、S50、S100、S150、S175、S200處理，每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)期間始終保持濾紙濕潤，即傾斜時(shí)盒底無溶液集聚。種子以露白為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，每天統(tǒng)計(jì)各處理的發(fā)芽數(shù)，7 d后收樣，將萌發(fā)種子（去殼）用蒸餾水清洗干凈，用吸水紙吸干表面水分，進(jìn)行下列指標(biāo)的測定和計(jì)算。

1.2 發(fā)芽率和種子活力指數(shù)測定

每天統(tǒng)計(jì)各處理的番茄種子發(fā)芽率。用萬分之一電子天平（Sartorius，美國）稱量萌發(fā)種子的鮮物質(zhì)量（FW）。參考Ahammed等[21]文獻(xiàn)計(jì)算發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)（GI），參考Wu等[22]文獻(xiàn)計(jì)算種子活力指數(shù)（SVI）。

發(fā)芽勢/%＝（規(guī)定3 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供檢測的種子數(shù)）×100

發(fā)芽率/%＝（規(guī)定7d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供檢測的種子數(shù)）×100

GI＝ΣGt/Dt（Gt指第天的發(fā)芽率，Dt指相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)）

SVI＝單個(gè)萌發(fā)種子鮮物質(zhì)量×發(fā)芽指數(shù)

1.3 丙二醛、可溶性糖和可溶性蛋白含量測定

參考王學(xué)奎和黃見良[23]文獻(xiàn)，采用硫代巴比妥酸法測定萌發(fā)種子丙二醛（MDA）含量，蒽酮比色法測定萌發(fā)種子可溶性糖（SS）含量，F(xiàn)olin-酚試劑法測定萌發(fā)種子可溶性蛋白（SP）含量。

1.4 番茄萌發(fā)種子保護(hù)酶系統(tǒng)活性測定

參考王學(xué)奎和黃見良[23]文獻(xiàn)，稱取0.5 g萌發(fā)種子鮮樣用5 mL 0.05 mol·L–1磷酸緩沖液（pH 7.8）進(jìn)行冰浴研磨，離心（4 000 r·min–1，4℃）15 min，取上清液進(jìn)行相應(yīng)抗氧化酶活性測定。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）還原法測定，SOD活性單以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位（U）表示；過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法測定，以每分鐘光密度240（OD240）減少0.1的酶量為1個(gè)酶活性單位（U）；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測定，以每分鐘OD470變化0.01為1個(gè)過氧化物酶活性單位（U）。

1.5 番茄萌發(fā)種子不同形態(tài)多胺含量測定

參照劉金隆[24]方法提取游離態(tài)、結(jié)合態(tài)和束縛態(tài)多胺，并稍加修改。稱取萌發(fā)種子鮮樣2 g，加入預(yù)冷的5%高氯酸2 mL冰浴研磨成勻漿后，再加入4 mL 5%高氯酸混勻后轉(zhuǎn)入離心管中，4℃浸提過夜后離心（14 000 ×，20 min，4℃）。分別收集上清液和沉淀，上清液用于測定游離態(tài)多胺和結(jié)合態(tài)多胺含量，沉淀則用于測定束縛態(tài)多胺含量。

游離態(tài)多胺（free polyamines，fPAs）含量的測定：吸取1 mL上清液，加入1 mL丹磺酰氯（10 mg·mL–1，溶于丙酮）和1 mL飽和Na2CO3，混勻后于60℃水浴15 min，然后加入0.5 mL 脯氨酸（100 mg·mL–1）終止反應(yīng)。室溫下冷卻后用2 mL甲苯萃取，吸取有機(jī)相甲苯后于40℃下用氮?dú)獯蹈?，溶? mL乙腈，過濾后取20 μL樣品用高效液相色譜儀（HPLC，Agilent Technologies 1200，美國）進(jìn)行檢測分析，柱子為C18柱，洗脫采用梯度洗脫方法[24]，流速為1.5 mL·min–1，柱溫為30℃，檢測波長為254 nm，用熒光檢測器檢測。以Put、Spd、Spm（購于Sigma公司）作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

結(jié)合態(tài)多胺（conjugated polyamines，cPAs）含量測定：吸取2 mL上清液于安瓿瓶中，加入2 mL 12 mol·L–1HCl，將安瓿瓶封口于110℃下酸解18 h，使結(jié)合態(tài)多胺轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)多胺，然后在80℃下水浴蒸干多余的HCl，向其中加入3 mL 5%高氯酸重懸，離心（14 000 ×，10 min，4℃），之后測定步驟同游離態(tài)多胺含量的測定，然后進(jìn)行HPLC分析，酸解中總多胺含量減去游離態(tài)多胺含量獲得結(jié)合態(tài)多胺含量。

束縛態(tài)多胺（bound polyamines，bPAs）含量測定：沉淀用5%高氯酸清洗4次，然后加入4 mL NaOH用力渦旋震蕩溶解，離心（14 000 ×，20 min，4℃），吸取2 mL上清液，按照結(jié)合態(tài)Put、Spd、Spm含量測定方法，HPLC分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

利用Microsoft Excel2013、IBM SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理、統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”格式，采用鄧肯（Duncan）新復(fù)極差測驗(yàn)法（<0.05）進(jìn)行單因素顯著性方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度NaCl處理對番茄種子發(fā)芽和種子活力指數(shù)的影響

圖1a所示，25 mmol·L–1NaCl處理下，番茄種子有輕微的延遲發(fā)芽現(xiàn)象，但是發(fā)芽勢和發(fā)芽率均不受影響（>0.05）；50 mmol·L–1NaCl處理下，明顯延遲發(fā)芽，發(fā)芽勢顯著下降（<0.05），但發(fā)芽率不受顯著影響；75 mmol·L–1NaCl處理下，明顯延遲發(fā)芽，顯著降低發(fā)芽勢和發(fā)芽率，分別較對照降低40%和17%；100 mmol·L–1NaCl處理發(fā)芽勢和發(fā)芽率分別較對照降低61%和58%；鹽處理濃度進(jìn)一步上升，番茄種子發(fā)芽率極顯著下降，在200 mmol·L–1NaCl處理下7 d，均無種子萌發(fā)。25 mmol·L–1NaCl處理下，番茄種子活力指數(shù)（SVI）顯著下降，隨著NaCl濃度上升，SVI顯著下降。當(dāng)處理鹽度達(dá)到150 mmol·L–1NaCl，SVI降至5.91；當(dāng)鹽濃度高達(dá)175和200 mmol·L–1NaCl，SVI進(jìn)一步分別降至0.49和0。

2.2 番茄種子萌發(fā)的耐鹽閾值確定

以番茄種子發(fā)芽率為因變量，NaCl處理濃度為自變量，通過擬合曲線估計(jì)，建立回歸方程（圖2）發(fā)現(xiàn)，種子發(fā)芽率、種子活力指數(shù)與NaCl處理濃度的回歸方程分別為：=（4×10–7）4–0.000 13+ 0.006 12– 0.171 3+ 93.73（2= 0.996 1）和=（–2×10–6）4+ 0.000 83–0.071 42–6.037+ 803.6（2= 0.986 8）。以種子發(fā)芽率或種子活力指數(shù)較對照下降50%為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，得出番茄“合作903”種子萌發(fā)和萌發(fā)后生長的耐鹽閾值分別為106.1 mmol·L–1NaCl（0.62%）和43.38 mmol·L–1NaCl（0.25%）。

2.3 不同濃度NaCl處理對番茄萌發(fā)種子抗氧化酶系統(tǒng)和溶質(zhì)累積的影響

與對照相比，50 mmol·L–1NaCl處理下7 d，番茄萌發(fā)種子MDA含量顯著上升（圖3a），而其SOD、POD、CAT活性變化不顯著（圖3b、圖3c、圖3d）；100 mmol·L–1NaCl處理下，種子MDA含量、SOD、POD、CAT活性均顯著上升，分別上升41%、49%、86%、31%；隨著NaCl濃度上升，其增幅也進(jìn)一步增加（圖3b、圖3c、圖3d）。50 mmol·L–1NaCl處理下7 d，萌發(fā)番茄種子可溶性蛋白（SP）含量無顯著變化，但可溶性糖（SS）含量顯著下降，100 mmol·L–1NaCl處理下，SP和SS含量顯著高于對照，分別較對照增加117%和27%；150 mmol·L–1NaCl處理下，SP和SS含量分別較對照增加274%和53%（圖3e和圖3f）。

2.4 不同濃度NaCl處理對番茄萌發(fā)種子不同形態(tài)多胺含量及構(gòu)成的影響

與對照相比，50 mmol·L–1NaCl處理7 d，番茄萌發(fā)種子游離態(tài)腐胺（fPut）顯著下降，隨著NaCl濃度上升，fPut含量隨之上升，但均顯著低于對照。而50 mmol·L–1NaCl處理下萌發(fā)種子游離態(tài)亞精胺（fSpd）和游離態(tài)精胺（fSpm）與對照均無顯著差異，隨著NaCl處理濃度的增加，fSpd和fSpm含量均顯著上升。100 mmol·L–1NaCl處理下，fSpd和fSpm分別較對照增加109%和399%，150 mmol·L–1NaCl處理下，fSpd和fSpm分別較對照增加201%和578%。與對照相比，50 mmol·L–1NaCl處理下，（fSpd+fSpm）/fPut顯著上升，隨著NaCl處理濃度的增加，這一比值上升愈顯著。與對照相比，50、100、150 mmol·L–1NaCl處理下，（fSpd+fSpm）/fPut分別增加382%、829%和1135%（表1）。

與對照相比，50 mmol·L–1NaCl處理7 d，番茄萌發(fā)種子結(jié)合態(tài)腐胺（cPut）無顯著變化，隨著NaCl處理濃度的增加，cPut含量顯著下降；而50 mmol·L–1NaCl處理下萌發(fā)種子結(jié)合態(tài)亞精胺（fSpd）、結(jié)合態(tài)精胺（fSpm）含量及（cSpd+cSpm）/cPut均顯著高于對照，隨著NaCl處理濃度的增加，cSpd、cSpm含量及（cSpd+cSpm）/cPut均逐漸顯著下降。與對照相比，50 mmol·L–1NaCl處理7 d，番茄萌發(fā)種子束縛態(tài)腐胺（bPut）、束縛態(tài)亞精胺（bSpd）、束縛態(tài)精胺（bSpm）含量分別增加4%、8%和33%；100 mmol·L–1NaCl處理下，bPut、bSpd和bSpm分別較對照增加120%、129%和253%；150 mmol·L–1NaCl處理下，bPut、bSpd和bSpm分別較對照增加263%、288%和427%（表1）。

表1 不同濃度NaCl處理下番茄萌發(fā)種子不同形態(tài)多胺含量和構(gòu)成

注：不同的小寫字母表示處理間差異顯著（<0.05）。Note：The different lower-case letters after same horizontal data mean significant difference at the level of 0.05.

表1還顯示，與對照相比，番茄萌發(fā)種子總多胺（TPAs）在不同濃度NaCl脅迫下均顯著下降，但隨著NaCl處理濃度的上升，其TPAs含量逐漸上升。鹽脅迫下番茄萌發(fā)種子游離態(tài)多胺（fPAs）及其在總多胺中的份額（fPAs/TPAs）顯著下降，但是隨著NaCl處理濃度的上升，番茄萌發(fā)種子fPAs含量和fPAs/TPAs 顯著上升。而種子結(jié)合態(tài)多胺（cPAs）在50 mmol·L–1NaCl處理下顯著上升，而NaCl處理濃度上升至100 mmol·L–1，其cPAs下降，與對照差異不顯著，上升至150 mmol·L–1NaCl，其cPAs進(jìn)一步下降，顯著低于對照。鹽脅迫下番茄萌發(fā)種子束縛態(tài)多胺（bPAs）及其在總多胺中的份額（bPAs/TPAs）顯著上升，隨著NaCl處理濃度的上升，番茄萌發(fā)種子bPAs含量和bPAs/TPAs 顯著上升。

3 討 論

3.1 鹽脅迫對番茄種子萌發(fā)的抑制及其耐鹽閾值

種子萌發(fā)是植物生命起始的首要過程，也是植物最早接觸鹽漬的階段。闡述種子萌發(fā)對鹽脅迫的響應(yīng)，是系統(tǒng)認(rèn)識鹽害和植物耐鹽性的較好途徑。發(fā)芽率首當(dāng)其沖反映種子質(zhì)量優(yōu)劣的主要指標(biāo)之一。劉慶華等[25]以山西主栽品種“白果強(qiáng)豐”和“德冠1號”為研究材料，研究表明30 mmol·L–1NaCl脅迫10 d，番茄品種“白果強(qiáng)豐”發(fā)芽率顯著下降，而“德冠1號”發(fā)芽率無顯著變化，60 mmol·L–1NaCl脅迫下，“白果強(qiáng)豐”和“德冠1號”發(fā)芽率分別下降32%和17%。蘇實(shí)等[13]在“合作908”上研究表明，50、100 mmol·L–1NaCl脅迫10 d，番茄發(fā)芽率較對照無顯著變化，125 mmol·L–1NaCl脅迫下，“合作908”發(fā)芽率顯著下降。本研究表明，25、50 mmol L–1NaCl脅迫7 d，“合作903”發(fā)芽率與對照相比差異不顯著，75 mmol·L–1NaCl脅迫下，“合作903”發(fā)芽率顯著下降，125和150 mmol·L–1NaCl脅迫下，“合作903”發(fā)芽率極顯著下降，發(fā)芽率分別較對照下降58%和90%（圖1a）。而“白果強(qiáng)豐”在120和150 mmol·L–1NaCl脅迫下，發(fā)芽率分別較對照下降75%和87%；“德冠1號”在120和150 mmol·L–1NaCl脅迫下，發(fā)芽率分別較對照下降54%和90%[25]。上述結(jié)果表明，低鹽下，“合作903”耐鹽性與“德冠1號”近似，均強(qiáng)于“白果強(qiáng)豐”，而遜于“合作908”；當(dāng)高鹽達(dá)到150 mmol·L–1NaCl脅迫下，由于吸水困難，上述的番茄品種發(fā)芽均嚴(yán)重被抑制，很難區(qū)分出耐鹽性的差異。本研究表明，當(dāng)鹽分達(dá)到200 mmol·L–1NaCl脅迫，“合作903”種子在7 d已經(jīng)不能露白萌發(fā)（圖1a）。而Huang等[26]用“Micro-Tom”栽培番茄為材料，發(fā)現(xiàn)200 mmol·L–1NaCl脅迫7 d，依然可保持對照56%的發(fā)芽率。Ahammed等[21]同樣以“合作903”為材料，發(fā)現(xiàn)150 mmol·L–1NaCl脅迫下5 d，發(fā)芽率僅較對照下降9%，表明“合作903”在萌發(fā)階段，具有很高的耐鹽性，與本研究多次重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果不一致，其原因有待于進(jìn)一步探討。

種子活力指數(shù)（SVI）是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，也是種用價(jià)值的主要組成部分，它與種子田間出苗密切相關(guān)，甚至有人將種子活力作為種子質(zhì)量的同義詞[27-28]。Maleki等[29]研究發(fā)現(xiàn)耐鹽藜麥在立苗期、花期和灌漿期的耐鹽閾值分別為8、20和15 dS·m–1，表明種子立苗階段對鹽脅迫最為敏感，立苗成功后對鹽環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)，可適應(yīng)較高濃度的鹽脅迫。劉曉威等[30]以泌鹽鹽生植物紅砂為試驗(yàn)材料，分析和計(jì)算表明，紅砂的最適萌發(fā)鹽濃度為45.78 mmol·L–1、最適幼苗生長鹽濃度為50.59 mmol·L–1；同時(shí)發(fā)現(xiàn)紅砂萌發(fā)耐鹽閾值濃度為273.0 mmol·L–1，而幼苗生長耐鹽閾值為388.2 mmol·L–1，顯然鹽生植物紅砂幼苗在鹽土上生長對鹽度的依賴或忍耐均要高，而種子萌發(fā)階段較為敏感，這也符合鹽生植物的基本特征。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下番茄SVI的降幅較發(fā)芽率的降幅更顯著（圖1），進(jìn)一步根據(jù)耐鹽閾值的比較分析可發(fā)現(xiàn)，以種子活力指數(shù)為因變量的萌發(fā)階段的耐鹽閾值要明顯低于以發(fā)芽率為因變量的（圖2）。這說明番茄種子萌發(fā)時(shí)遭遇鹽分脅迫不僅延緩，甚至抑制種子萌發(fā)，對于萌發(fā)后幼苗的建成抑制作用更強(qiáng)，與王霞霞等[31]在燕麥上的研究結(jié)果一致。這些研究均說明種子萌發(fā)階段是鹽生植物或淡土植物逆境條件下成活的關(guān)鍵階段。在這一階段，對其生長所在環(huán)境脅迫抗性最弱。種子萌發(fā)成功后鹽生植物幼苗對鹽環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)，可適應(yīng)較高濃度的脅迫，而相對耐鹽性弱的淡土植物幼苗在持續(xù)的鹽脅迫下通常受抑制更為嚴(yán)重。萌發(fā)閾值及生長閾值的確定，為鹽生植物或淡土植物研究提供了不同發(fā)育層面的數(shù)據(jù)支撐。

3.2 番茄種子萌發(fā)中抗氧化和溶質(zhì)積累對鹽脅迫的應(yīng)答

鹽脅迫包括滲透脅迫和離子脅迫以及由此引起的次級鹽害如氧化脅迫等。產(chǎn)生的大量氧自由基和誘發(fā)的膜脂過氧化作用導(dǎo)致膜透性發(fā)生變化使結(jié)構(gòu)和功能受損[2]。Huang等[26]發(fā)現(xiàn)200 mmol·L–1NaCl脅迫“Micro-Tom”栽培番茄種子萌發(fā)7 d，其葉片CAT、SOD、POD、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）的基因表達(dá)均顯著上升，而脂肪氧化酶（LOX）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）的基因表達(dá)下降，同時(shí)其可溶性糖（SS）含量上升。劉丹等[10]在有機(jī)番茄上的研究表明，鹽處理使得番茄種子的MDA含量上升，其中耐鹽性強(qiáng)的“妙紅”MDA增幅低于相對不耐鹽的品種“佳人”，鹽處理也使得幼苗SOD、POD、CAT活性增加，且隨著鹽處理強(qiáng)度的增加，番茄的SOD、POD、CAT活性也不同程度上升，且耐鹽性越強(qiáng)的品種，這一上升現(xiàn)象越明顯?；粑挠甑萚32]以“合作906”和“合作909”番茄品種為試驗(yàn)材料，發(fā)現(xiàn)100 mmol·L–1NaCl脅迫10 d，SOD、POD、CAT和抗壞血酸過氧化物酶（APX）均不同程度地顯著下降；同時(shí)，其可溶性蛋白（SP）均下降，而耐鹽的“合作909”的SS含量下降，鹽敏感的“合作906”的SS含量上升。楊若鵬等[33]以“福寶”和“東方紅”番茄品種為材料，發(fā)現(xiàn)100 mmol·L–1NaCl脅迫7 d，萌發(fā)的早期幼苗SOD、POD、CAT活性均顯著上升，脅迫增加至200 mmol·L–1NaCl，顯示下降，但仍顯著高于對照。Moles等[34]研究了25 mmol·L–1NaCl脅迫下，耐鹽的番茄品種Ciettaicale的總抗氧化能力顯著上升，而鹽敏感品種San Marzano的總抗氧化能力下降，與抗氧化能力呼應(yīng)的是耐鹽Ciettaicale的SS含量在鹽處理下顯著上升，而鹽敏感San Marzano的SS含量下降。Ebrahim 和Saleem[11]以栽培番茄Super Strain-B的種子為材料，鹽處理12 d，發(fā)現(xiàn)50、100 mmol·L–1NaCl處理顯著提高幼苗葉片SS含量，而降低葉片SP含量，鹽度越高，這一變化趨勢越顯著。本研究顯示鹽脅迫導(dǎo)致番茄幼苗膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著上升，同時(shí)幼苗的SOD、POD、CAT活性也不同程度上升，且隨著鹽脅迫強(qiáng)度的上升，上述指標(biāo)上升愈顯著（圖3），與劉丹等[10]在有機(jī)番茄上的結(jié)果相一致。而溶質(zhì)如SS、SP含量的變化，則因品種、處理時(shí)間、處理強(qiáng)度等不同而呈現(xiàn)多樣性的變化。

3.3 番茄種子萌發(fā)中多胺含量和形態(tài)對鹽脅迫的應(yīng)答

Wang和Liu[35]研究表明，鹽脅迫下多胺氧化酶（PAO）基因的超表達(dá)雖然導(dǎo)致鹽脅迫下甜橙種子萌發(fā)上升，但是抑制胚根伸長和幼苗生長，主要是因?yàn)閒Spd和fSpm含量顯著下降和大量H2O2產(chǎn)生導(dǎo)致次生脅迫；下調(diào)PAO基因，從而上調(diào)游離態(tài)Spd和Spm含量，是有效增強(qiáng)植物耐鹽性的方法。Afzal等[36]分別采用50 mg·L–1Put、Spm和Spd浸種24 h，發(fā)現(xiàn)Spm或Spd處理可促進(jìn)番茄種子萌發(fā)、提高種子活力，增強(qiáng)其抗氧化能力，而Put處理降低了番茄種子的抗氧化能力，從而推遲番茄種子萌發(fā)和降低種子活力。Bueno等[37]研究了鹽脅迫對戟葉濱藜和芹葉車前草的萌發(fā)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)鹽處理明顯降低鹽生植物戟葉濱藜萌發(fā)種子中游離總多胺（fPAs）的含量，而明顯增加不耐鹽的芹葉車前草的fPAs含量，鹽脅迫強(qiáng)度越大，上述趨勢越明顯；進(jìn)一步分析表明，鹽脅迫下耐鹽的戟葉濱藜萌發(fā)種子中fPut下降極顯著，fSpd的下降不如fPut明顯，而fSpm顯著上升，從而其（fSpd + fSpm）/fPut比值顯著上升；鹽脅迫下不耐鹽的芹葉車前草萌發(fā)種子中fPut下降，但其降幅遠(yuǎn)不如戟葉濱藜，fSpd和fSpm均顯著上升，尤其是fSpm上升明顯，從而其（fSpd + fSpm）/fPut比值也顯著上升；比較分析顯示，200 mmol·L–1NaCl處理10 d，戟葉濱藜和芹葉車前草萌發(fā)種子（fSpd + fSpm）/fPut比值分別為各自對照的5.7倍和3.8倍。本研究表明，50 mmol·L–1NaCl處理7 d，fPAs顯著下降，這很可能是因?yàn)辂}脅迫啟動了番茄萌發(fā)種子的積極應(yīng)答；但是隨著鹽處理濃度的上升，fPAs又逐漸顯著上升，但是依然低于對照的（表1），這表明隨著鹽脅迫強(qiáng)度的增加，其積極響應(yīng)程度在下降。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下fPAs的下降主要是由于fPut的下降導(dǎo)致的，而fSpd和fSpm均顯著上升，尤其是fSpm的增幅更為顯著，從而其（fSpd +f Spm）/fPut比值也急劇上升，并隨著鹽脅迫強(qiáng)度的增加而上升愈顯著（表1）?？傮w而言，種子萌發(fā)要適應(yīng)鹽脅迫，其游離態(tài)多胺積累趨勢是從fPut向fSpd和fSpm的變化，且通常伴隨游離態(tài)總多胺的下降，這一下降意味著游離態(tài)向結(jié)合態(tài)或束縛態(tài)多胺的變化。有關(guān)在植株生長階段這樣變化的文獻(xiàn)報(bào)告更多。fPut的下降通常被解釋為腐胺通過二胺氧化酶（DAO）分解，最后形成Pro。鹽脅迫下植物fPAs總量大多顯示下降主要是由于其fPut含量明顯高于其他多胺，fPut的變化代表了多胺總量的變化。（fSpd +fSpm）/fPut比值的上升，體現(xiàn)了鹽脅迫下fSpd和fSpm對植物的保護(hù)作用，尤其是對細(xì)胞膜的保護(hù)作用，而fPut通常被表明是不起作用的，因而（fSpd+fSpm）/fPut比值的上升有利于增強(qiáng)植物細(xì)胞的再生能力[35-36]。如Chen等[19]研究表明，高鹽下野生大麥遭到脅迫，伴隨著fPut顯著上升及fSpd和fSpm的顯著下降，而接種內(nèi)生真菌可明顯逆轉(zhuǎn)這一過程，從而提高野生大麥的耐鹽性。Ke等[20]研究表明，100 mmol·L–1NaCl處理小麥幼苗16 d，其植株遭到嚴(yán)重脅迫，伴隨著fPut顯著上升及fSpd和fSpm的顯著下降，而1 μmol·L–1褪黑素預(yù)處理，明顯緩解植株鹽害，伴隨著fPut顯著下降及fSpd和fSpm的顯著上升。

探討鹽脅迫下作物種子萌發(fā)過程中多胺形態(tài)代謝的文獻(xiàn)極為匱缺。本研究表明，隨著鹽脅迫的加劇，萌發(fā)的番茄種子中游離態(tài)多胺（fPAs）和束縛態(tài)多胺（bPAs）比重上升，而結(jié)合態(tài)多胺（cPAs）比重下降（表1），可見fPAs和bPAs在提高植物抗?jié)B透能力中的貢獻(xiàn)，在小麥、大豆和玉米等植物上均有這樣的結(jié)果[38]。Scaramagli等[39]對馬鈴薯懸浮細(xì)胞進(jìn)行了滲透脅迫試驗(yàn)，誘導(dǎo)出聚乙二醇（PEG）適應(yīng)性細(xì)胞系，即在受到滲透脅迫時(shí)，傾向于向高氯酸不溶性結(jié)合態(tài)多胺（bPAs）轉(zhuǎn)化，特別是bPut的含量較對照高達(dá)14倍。而在種子萌發(fā)中，鹽脅迫中的滲透脅迫是主要脅迫因素。本研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下bPAs，乃至bPut、bSpd、bSpm均呈現(xiàn)顯著上升，而且隨著鹽脅迫強(qiáng)度的增加，其上升越發(fā)顯著，尤以bSpm的上升更為明顯（表1）。Chen等[19]對野生大麥幼苗的研究表明，鹽脅迫下其fPAs比重下降，cPAs是先升再降后升的“波浪式”，而bPAs比重一直上升；而接種內(nèi)生真菌進(jìn)一步加劇fPAs比重的下降，并導(dǎo)致cPAs比重的下降，加大了bPAs的比重。由此可見，fPAs、cPAs向bPAs的轉(zhuǎn)化很可能是增強(qiáng)野生大麥幼苗耐鹽、番茄種子萌發(fā)耐鹽的重要原因。鹽脅迫誘導(dǎo)野生大麥植株TPut上升、TSpd下降，以及TSpm先降后升，但是接種內(nèi)生真菌導(dǎo)致植株耐鹽性顯著上升的同時(shí)，伴隨TPut的顯著下降以及TSpd和TSpm的顯著上升，體現(xiàn)了TPut/TPAs的顯著下降，以及（TSpd+TSpm）/TPut、TSpd/TPAs、TSpm/TPAs的顯著上升[19]。本研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下萌發(fā)番茄種子也正是體現(xiàn)了這種耐鹽特征的變化趨勢，且三種形態(tài)多胺及上述比值也體現(xiàn)了這一變化趨勢（表1），驗(yàn)證了三種多胺積累趨勢均是從Put向Spd和Spm變化，尤其是游離態(tài)和束縛態(tài)多胺的如是變化。

4 結(jié) 論

本研究比較全面地探討了鹽脅迫對番茄“合作903”種子萌發(fā)的效應(yīng)，鹽脅迫延緩番茄種子萌發(fā)，甚至抑制種子萌發(fā)，對于萌發(fā)后其幼苗的建成抑制作用更強(qiáng)。番茄種子萌發(fā)階段對高鹽分具有一定的抗性，主要由于萌發(fā)種子多胺代謝中的（游離態(tài)亞精胺+游離態(tài)精胺）/游離態(tài)腐胺[（fSpd+fSpm）/fPut]比值的急劇上升、結(jié)合態(tài)的亞精胺和精胺（cSpd和cSpm）含量的顯著上升以及束縛態(tài)各多胺的顯著積累，同時(shí)可溶性糖和可溶性蛋白隨著鹽脅迫的加劇顯著積累，從而顯著提高了萌發(fā)種子的抗氧化和滲透調(diào)節(jié)能力。但是在150 mmol·L–1NaCl這樣的高鹽脅迫下，cSpd和cSpm的上升調(diào)控作用明顯減弱，而束縛態(tài)各多胺、fSpd和fSpm的上升以及可溶性糖（SS）和可溶性（SP）積累調(diào)控作用仍在增強(qiáng)。當(dāng)然，要進(jìn)一步更好地理解番茄種子萌發(fā)中的多胺代謝、抗氧化、溶質(zhì)積累等與萌發(fā)種子抗鹽性的關(guān)系，闡述萌發(fā)種子中抗氧化、溶質(zhì)積累和多胺的相互作用，需要就其相關(guān)關(guān)鍵酶的生理活性及其基因表達(dá)等分子生物學(xué)機(jī)理開展進(jìn)一步研究工作。

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Effects of Salt Stress on Form of Polyamine and Antioxidation in Germinating Tomato Seed

CHEN Jun1, GUAN Xin2, 3, FAN Cuizhi3, ZHAO Haiyan3, WU Xinyi3, HAN Ying1, GU Zhizhuang3, ZHENG Qingsong3, 4?, ZHENG Chunfang2?

(1. College of Horticulture and Technology, Suzhou Polytechnic Institute of Agriculture, Suzhou, Jiangsu 215008, China; 2. College of life and Environmental Sciences, Wenzhou University, Wenzhou, Zhejiang 325035, China; 3. College of Resources and Environmental Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 4. Research Center of Sichuan County Economy Development, Mianyang Normal University, Mianyang, Sichuan 621000, China)

【Objective】Tomato is one of the fruit and vegetable crops cultivated with the highest economic benefits in open fields and greenhouses. It is of great necessity to explore salt tolerance of germinating tomato seeds and its mechanism, especially changes in polyamine metabolism in the seeds. 【Method】In this study, Impacts of NaCl stress on seed germination percentage (SGP) and development of radical and hypocotyl, seed water content (SWC), seed vigor index (SVI), Malondialdehyde (MDA) content, protective enzyme activity, solute accumulation and contents of various forms of polyamine of/in the seeds of tomato, "Hezuo 903" in variety were studied. 【Result】When the soil was treated with 25 or 50 mmol·L–1NaCl for seven days, germination of tomato seeds was slightly delayed, but SGP was not affected, however, SVI of the tomato decreased significantly. With rising salt concentration in the treatment, both the SGP and SVI decreased significantly. With SGP and SVI cited as dependent variables, and NaCl concentration in the treatment as independent variable, salt tolerance threshold for seed germination and seedling establishment was 106.1 mmol·L–1NaCl (0.62%) and 43.38 mmol·L–1NaCl (0.25%), respectively. With rising NaCl concentration, MDA content, soluble protein (SP) content and the activities of enzymes like SOD, POD and CAT in germinating seeds were increased significantly, also, the contents of fPut, fSpd, fSpm, (fSpd+fSpm)/fPut, bPut, bSpd, and bSpm in the germinating tomato seeds all increased significantly, but (bSpd+bSpm)/bPut did not change much. Compared with the seeds in CK, the seeds treated with 50 mmol·L–1NaCl did not change much in conjugated Put (cPut), but increased significantly in the contents of cSpd, and cSpm and the ratio of (cSpd+cSpm)/cPut. With increasing NaCl concentration, the seeds declined gradually in cPut, cSpd, cSpm and (cSpd+cSpm)/cPut. It was also found that salt stress significantly reduced the content of total polyamines (TPAs) and free total polyamines (fPAs) in germinating tomato seeds, but increased the content of free total polyamines with rising NaCl concentration. 【Conclusion】Salinity delays and even inhibits germination of tomato seeds, and has a much stronger inhibitory effect on establishment of the seedlings after germination. Tomato seeds per se have certain salt tolerance during their germination phase mainly due to the drastic increase in (fSpd+fSpm)/fPut, cSpd, cSpm, and significant accumulation of all the forms of bound polyamines, SS and SP in the seeds under salt stress, thus raising the seeds’ antioxdation and osmotic adjustment capacities. However, when salt reaches as high as 150 mmol · L–1NaCl, the effects of salt stress raising cSpd and cSpm weaken, while the effects raising bound polyamine of all forms, fSpd and fSpm, and regulating SS and SP accumulation are still intensify.

Tomato; Salt stress; Germination; Antioxadation; Solute accumulation; Polyamine form

Q945.78

A

10.11766/trxb202002180051

陳軍，關(guān)欣，范翠枝，趙海燕，吳馨怡，韓鷹，顧志壯，鄭青松，鄭春芳. 鹽脅迫對番茄種子萌發(fā)中多胺形態(tài)變化和抗氧化的影響[J]. 土壤學(xué)報(bào)，2021，58（6）：1598–1609.

CHEN Jun，GUAN Xin，F(xiàn)AN Cuizhi，ZHAO Haiyan，WU Xinyi，HAN Ying，GU Zhizhuang，ZHENG Qingsong，ZHENG Chunfang. Effects of Salt Stress on Form of Polyamine and Antioxidation in Germinating Tomato Seed [J]. Acta Pedologica Sinica，2021，58（6）：1598–1609.

*國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31672141）、江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（蔬菜）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系-蘇州推廣示范基地項(xiàng)目（JATS[2019]364）和溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（N20180001）共同資助Supported by the National Natural Science Foundation of China（No. 31672141），the Modern Agriculture（vegetable）Industry Technology System of Jiangsu Province- the Extension Demonstration Base Program of Suzhou City of Jiangsu Province（No. JATS[2019]364）and the Science and Technology Program of Wenzhou City of Zhejiang Province（No. N20180001）

Corresponding author，E-mails：qszheng@njau.edu.cn；20195101@wzu.edu.cn

陳 軍（1976—），男，江蘇鹽城人，副教授，主要研究方向：蔬菜栽培生理與生產(chǎn)技術(shù)。E-mail：chenjun@szai.edu.cn

2020–02–18；

2020–06–08；

2020–09–08

（責(zé)任編輯：陳榮府）