孟凡花，李臻，王慶國(guó)，劉煒

（1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濕地農(nóng)業(yè)與生態(tài)研究所，山東 濟(jì)南 250100）

脂質(zhì)作為生物膜的主要組成成分，可通過(guò)形成疏水屏障將細(xì)胞與外界隔離，參與植物碳源和能量的儲(chǔ)存、保護(hù)組織的形成、信號(hào)傳導(dǎo)以及抵御病菌侵入等生理過(guò)程［1］。植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（lipid transfer protein，LTP）是高等植物中大量存在的一種小型堿性蛋白，能夠在體外可逆地結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸、磷脂、糖脂等多種疏水分子。LTP家族在植物中普遍存在，在擬南芥、水稻、小麥、玉米、油菜等中均已鑒定到大量LTP編碼基因，其中在擬南芥和水稻全基因組中分別發(fā)現(xiàn)了79個(gè)和53個(gè)LTPs基因［2］，在玉米和油菜中分別發(fā)現(xiàn)了77個(gè)和63個(gè)LTPs基因［3，4］。最初，根據(jù)蛋白分子量的大小，主要將植物中的LTP分為兩類：LTPⅠ型和LTPⅡ型［5］。LTPⅠ型蛋白分子量大約為8～10 kDa，LTPⅡ型蛋白分子量約為7 kDa［6］。隨著在植物中鑒定的LTP蛋白增多，已有的按蛋白分子量分類的方法已經(jīng)滿足不了區(qū)分不同種類LTP蛋白的需求。因此，Boutrot等［2］基于對(duì)水稻、小麥、擬南芥的全基因組分析，根據(jù)8個(gè)半胱氨酸序列的同源性將LTP蛋白分為9類（Ⅰ～Ⅸ）［2］。LTP成員具有多種生物學(xué)功能，主要涉及磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物生殖發(fā)育、病原菌防御和非生物脅迫反應(yīng)等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。已知在煙草中超表達(dá)小麥LTP3F1基因，轉(zhuǎn)基因植株抗真菌病害能力得到增強(qiáng)［7］；在山新楊中超表達(dá)ThLTP，轉(zhuǎn)基因植株在逆境脅迫下相對(duì)野生株具有更強(qiáng)的抗脅迫能力［8，9］。表明LTP在植物適應(yīng)各種逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用。

谷子（Setaria italicaL.）俗稱小米，又稱為粟，是起源于我國(guó)的傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)作物及糧飼兼用作物，在我國(guó)、印度、日本等廣泛種植［10］。在禾本科植物中，谷子具有發(fā)達(dá)的根系、水分利用率高、蒸騰系數(shù)小、適應(yīng)性強(qiáng)、抗旱抗鹽堿能力突出、化肥農(nóng)藥用量少，是典型的抗旱節(jié)水作物及環(huán)境友好型作物。隨著全球氣候變化和我國(guó)工業(yè)化進(jìn)程加快，我國(guó)水資源缺乏形勢(shì)日益嚴(yán)峻，土壤鹽漬化加重，鹽堿地面積日益擴(kuò)大。提高抗旱耐鹽作物的種植比例是節(jié)約水資源、高效利用耕地的有效途徑。而谷子作為一種節(jié)水耐旱耐鹽堿作物，其在節(jié)水農(nóng)業(yè)及可持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)中的優(yōu)勢(shì)一目了然，也必將在應(yīng)對(duì)世界水資源短缺中作為重要的戰(zhàn)略儲(chǔ)備作物發(fā)揮作用。

鑒于谷子LTP基因的功能研究還較少，本研究室前期通過(guò)TMT（tandem mass tags）蛋白定量方法解析了干旱脅迫下谷子的差異蛋白組，并鑒定到一個(gè)響應(yīng)干旱脅迫的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（K3YAY4），干旱下其編碼基因表達(dá)明顯上調(diào)，進(jìn)一步克隆到該基因并命名為SiLTP1（XM-004977323），并對(duì)SiLTP1進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和不同脅迫下的表達(dá)特性檢測(cè)，為深入研究谷子LTP的生物學(xué)功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)與處理

挑選籽粒飽滿的“豫谷一號(hào)”種子播種于96孔培養(yǎng)盒中，28℃恒溫培養(yǎng)箱（光照16 h、黑暗8 h）水培兩周至三葉期，分別用15%PEG6000處理，于0、2、6、12 h取幼苗葉片迅速放入液氮中-80℃保存?zhèn)溆?；分別用200 mmol/L NaCl、50 μmol/L ABA、50μmol/L MeJA處理，于0、1、2、4、6、12、24 h取幼苗葉片迅速放入液氮中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 使用TransZol Plant試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取幼苗葉片的RNA，單鏈cDNA合成根據(jù)Prime-ScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）操作。

1.2.2 谷子SiLTP1基因的克隆 檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得SiLTP1核苷酸序列，使用Primer Premier 5設(shè)計(jì)基因特異引物SiLTP1-S1：5′-ACCAGCAAAGCAAAGCAC-3′和SiLTP1-A1：5′-GTATGTAGCGACGGTGGAG-3′，由青島擎科生物工程有限公司合成。以谷子單鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為：TransStart FastPfuDNA Polymerase 0.5μL，5×TransStart FastPfubuffer 4μL，dNTP 2μL，SiLTP1-S1 1μL，SiLTP1-A1 1μL，單鏈cDNA 1μL，ddH2O補(bǔ)齊到20μL。反應(yīng)程序：94℃5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃40 s，34個(gè)循環(huán)；72℃10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，使用Easy-Pure Quick Gel Extraction Kit切膠回收目的基因片段，連接至pEASY?-Blunt3載體上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，在含Amp（ampicillin，氨芐青霉素）抗性的LB平板上過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌斑，進(jìn)行菌液PCR。將驗(yàn)證后的陽(yáng)性克隆送到青島擎科生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 使用ExPASy網(wǎng)站（http：//www.expasy.org/#）計(jì)算SiLTP1蛋白的理論分子量、等電點(diǎn)等基本參數(shù)，使用在線網(wǎng)站SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，使用在線工具SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析蛋白信號(hào)肽序列，通過(guò)TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對(duì)蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析，利用SOPMA（https：//www.expasy.org/proteomics）預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，運(yùn)用SWISS MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）在線預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，利用DNAMAN軟件對(duì)來(lái)自不同植物的LTP氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，利用MEGA 7.0軟件中的Neighbor-Joining（鄰位相連法，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)SiLTP1在不同處理下的表達(dá)模式 根據(jù)SiLTP1基因全長(zhǎng)序列，使用Beacon Designer 8設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物SiLTP1-S2：5′-ATGGCTCGCGCTCAGGTGGTG-3′和SiLTP1-A2：5′-CACTTGGATGGGATGCTGGC-3′，以谷子持家基因SiActin（NCBI登錄號(hào)：XM-004978702）為內(nèi)參，在ABI PRISM 7900HT（Applied Biosystems）熒光定量PCR儀上進(jìn)行目的片段擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為20μL，包括：稀釋10倍的cDNA模板1μL，SiLTP1-S2 1μL，SiLTP1-A2 1μL，2×Rox 10μL，ddH2O 7μL。擴(kuò)增條件：95℃10 min；之后95℃15 s，60℃1 min，40個(gè)循環(huán)；95℃15 s；60℃1 min；95℃15 s；60℃15 s。使用2-ΔΔCt算法計(jì)算SiLTP1基因在不同處理下的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子SiLTP1基因的克隆

以谷子單鏈cDNA為模板，以SiLTP1-S1、SiLTP1-A1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條354 bp的條帶（圖1）。將目的條帶切膠回收后與克隆載體pEASY?-Blunt3連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過(guò)菌液PCR驗(yàn)證，且測(cè)序結(jié)果正確，證明其為目的基因，并命名為SiLTP1。

圖1 SiLTP1 cDNA的PCR克隆

2.2 SiLTP1編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 SiLTP1編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析 使用Ex-PASy網(wǎng)站對(duì)SiLTP1核苷酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該基因編碼117個(gè)氨基酸殘基，其編碼蛋白分子量為11.5 kDa，等電點(diǎn)為9.24，不穩(wěn)定指數(shù)33.94，推測(cè)SiLTP1蛋白屬于堿性穩(wěn)定蛋白。

使用在線網(wǎng)站SMART對(duì)SiLTP1基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖2）顯示，在第7～26個(gè)氨基酸之間含有一個(gè)跨膜螺旋區(qū)域。另外，在第28～113個(gè)氨基酸之間還有一個(gè)AAI結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域存在于植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、種子貯藏蛋白及α-淀粉酶抑制劑結(jié)構(gòu)域家族蛋白中。

圖2 SiLTP1蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

2.2.2 SiLTP1蛋白信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域分析

通過(guò)SignalP 4.1對(duì)SiLTP1蛋白序列進(jìn)行信號(hào)肽分析，結(jié)果（圖3）顯示，第1～28個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽序列，第29個(gè)和第30個(gè)氨基酸殘基之間為信號(hào)肽裂解點(diǎn)。通過(guò)TMHMM對(duì)SiLTP1蛋白序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示，在第7～26個(gè)氨基酸處存在一個(gè)螺旋跨膜區(qū)（圖4），N端位于膜內(nèi)，C端位于膜外。

圖3 SiLTP1蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖4 SiLTP1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析

2.2.3 谷子SiLTP1蛋白的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用SOPMA進(jìn)行SiLTP1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果（圖5）顯示其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋（alpha helix，55.56%）、無(wú)規(guī)則卷曲（random coil，34.19%）、延伸鏈（extended strand，8.55%）組成。利用SWISS-MODEL對(duì)SiLTP1蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模，結(jié)果（圖6）顯示，SiLTP1蛋白主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成；螺旋結(jié)構(gòu)折疊形成一個(gè)中心疏水性裂隙，用于結(jié)合疏水性配體。

圖6 SiLTP1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.2.4 部分LTP蛋白的同源比對(duì)分析 利用DNAMAN對(duì)來(lái)自谷子、水稻（Oryza sativa，Os）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，At）、臘梅（Chimonanthus praecox，Cp）、陸地棉（Gossypium hirsutum，Gh）的代表性LTP蛋白序列進(jìn)行同源比對(duì)。結(jié)果顯示，SiLTP1含有典型的8個(gè)高度保守的Cys位點(diǎn)，其分布為28-C-38-C-53-C-54-C-74-C-76-C-99-C-113-C（其中C表示半胱氨酸，數(shù)字表示氨基酸殘基所在位置）；并且具有LTP保守的T/S-X-X-D-R/K五肽結(jié)構(gòu)域（圖7），該結(jié)構(gòu)域與脂質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。

圖7 部分LTP蛋白的同源比對(duì)分析

2.2.5 SiLTP1的進(jìn)化樹(shù)分析 利用MEGA 7.0對(duì)谷子中的SiLTP1蛋白與來(lái)自擬南芥、水稻的LTP蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖8）顯示，SiLTP1在進(jìn)化關(guān)系上與水稻的第一亞族LTP親緣關(guān)系較近，顯示SiLTP1屬于LTP家族中的TypeⅠ類。

2.3 SiLTP1基因表達(dá)模式分析

2.3.1 鹽脅迫、PEG模擬干旱脅迫下SiLTP1表達(dá)模式分析 如圖9所示，在200 mmol/L NaCl處理下，SiLTP1的表達(dá)出現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，且在鹽處理6 h基因表達(dá)量達(dá)到最高，其表達(dá)水平約為對(duì)照的160倍，之后其表達(dá)量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，但仍顯著高于對(duì)照。經(jīng)15%PEG6000模擬干旱處理后，SiLTP1表達(dá)量在處理6 h后顯著升高，表達(dá)量約是未處理的17倍，之后隨干旱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，基因表達(dá)量有所下降。

圖9 SiLTP1在不同脅迫處理下的表達(dá)模式分析

2.3.2 各激素處理下SiLTP1表達(dá)模式分析 如圖10所示，在不同激素處理下，SiLTP1具有不同的響應(yīng)模式。經(jīng)ABA處理24 h，SiLTP1表達(dá)表現(xiàn)為先上調(diào)后下降的趨勢(shì)，處理8 h，基因表達(dá)量達(dá)到最高，約為對(duì)照的33倍。MeJA處理4 h，SiLTP1表達(dá)量達(dá)到最大值，約為處理前的13倍，之后基因表達(dá)量逐漸降低。

圖10 SiLTP1在不同激素處理下的表達(dá)模式分析

3 討論

研究表明，植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白是一類由多拷貝基因家族編碼的堿性小分子蛋白，能夠在體外可逆地結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸、磷脂、糖脂等多種疏水分子［11］。植物L(fēng)TP的分子量較小，通常為6.5～10.5 kDa，等電點(diǎn)一般在8.5～12.0，其在植物中含量豐富，約占可溶性蛋白總量的4%［12-18］。LTP具有相似的結(jié)構(gòu)特征，包括N端由21～27個(gè)氨基酸殘基組成、能夠引導(dǎo)蛋白分泌到細(xì)胞外參與細(xì)胞外親脂性物質(zhì)（如角質(zhì)）沉積的信號(hào)肽，以及由8個(gè)高度保守的半胱氨酸組成的4個(gè)二硫鍵，其結(jié)構(gòu)模型為Cys1-Xn-Cys2-Xh-Cys3Cys4-Xn-Cys5-Cys6-Xn-Cys7-Xn-Cys8；同時(shí)在C端有一非螺旋區(qū)用來(lái)結(jié)合并穩(wěn)定脂質(zhì)［19，20］。

本研究通過(guò)對(duì)克隆獲得的SiLTP1基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SiLTP1基因編碼117個(gè)氨基酸，蛋白分子量為11.5 kDa，等電點(diǎn)為9.24。將谷子與不同植物中的LTP蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)SiLTP1屬于LTP家族中的TypeⅠ類。SiLTP1具有脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白家族典型的8 CM結(jié)構(gòu)、堿性等電點(diǎn)、N端信號(hào)肽序列、跨膜結(jié)構(gòu)域等，具備4個(gè)α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲組成的三級(jí)結(jié)構(gòu)。綜上所述，SiLTP1基因編碼蛋白符合LTP蛋白的結(jié)構(gòu)特征。

早期研究報(bào)道，植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白在植物抵抗生物脅迫和非生物脅迫過(guò)程中有著重要的作用，已知重金屬處理、冷脅迫、干旱脅迫、鹽脅迫、激素（如ABA）以及病原物侵染都會(huì)誘導(dǎo)LTP基因的表達(dá)［21］。對(duì)于生物脅迫，早在1997年，Molina等［22］通過(guò)將大麥LTP2基因轉(zhuǎn)入煙草，發(fā)現(xiàn)可以明顯抑制煙草丁香假單胞桿菌的生長(zhǎng)；Patkar等［23］研究表明，在玉米中過(guò)表達(dá)LTP基因能夠提高受體材料對(duì)稻瘟病、白葉枯病等的抗病性；Choi等［24］研究表明，過(guò)表達(dá)NtLTP1的轉(zhuǎn)基因煙草顯示出蚜蟲(chóng)抗性。對(duì)于非生物脅迫，近年來(lái)，劉勇［25］研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)在玉米中過(guò)表達(dá)ZmLTPL63可以提高植株抗氧化能力，從而提高植株對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性。徐揚(yáng)［26］研究發(fā)現(xiàn)NtLTP4基因可以作為正調(diào)控因子參與植物的非生物脅迫響應(yīng)。小麥TdLTP4基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)能夠提高其抗旱和抗鹽能力［27］。超表達(dá)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AZI能夠增強(qiáng)植物對(duì)鹽的耐受性，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，AZI可通過(guò)與有絲分裂原活化的蛋白激酶MPK3結(jié)合發(fā)揮作用［28］。鑒于LTP家族在植物逆境脅迫信號(hào)的響應(yīng)過(guò)程中的重要作用，推測(cè)同屬該家族的SiLTP1基因在谷子抗逆過(guò)程中也具有相似的生物學(xué)功能。

為了進(jìn)一步明確SiLTP1在各種環(huán)境脅迫下的表達(dá)特性，通過(guò)qRT-PCR方法分析了SiLTP1基因在干旱、高鹽、ABA以及MeJA處理下的表達(dá)情況。其中，鹽處理后，基因表達(dá)量顯著升高，說(shuō)明SiLTP1可響應(yīng)鹽脅迫，且在鹽處理6 h時(shí)其表達(dá)量約為未處理時(shí)的160倍，響應(yīng)程度較高，顯示該基因可能在谷子鹽脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。PEG模擬干旱處理也可誘導(dǎo)基因的表達(dá)，且在處理6 h時(shí)基因表達(dá)量出現(xiàn)明顯上調(diào)，顯示該基因可能參與了谷子的干旱脅迫響應(yīng)。激素處理?xiàng)l件下，谷子幼苗經(jīng)ABA處理后，SiLTP1基因的表達(dá)量在8 h時(shí)達(dá)到未處理時(shí)的33倍，表明SiLTP1的表達(dá)受ABA的影響，推測(cè)該基因可能參與ABA依賴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。經(jīng)MeJA處理后基因表達(dá)量也有明顯升高，已知MeJA是植物抗病防御過(guò)程中的重要信號(hào)分子，表明SiLTP1基因可能參與致病菌的防御過(guò)程。綜合分析該基因在各處理下響應(yīng)程度的不同，推測(cè)谷子SiLTP1基因作為L(zhǎng)TP家族成員，可能在谷子抗逆、抗病等過(guò)程中發(fā)揮作用，并主要參與鹽脅迫的響應(yīng)和應(yīng)答途徑及ABA調(diào)控的相關(guān)途徑。但其具體的生物學(xué)功能及作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。