黃治曙，周立新，蘇繼欽，嚴(yán)輝弟，林艷麗

1.廈門醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院肝膽外科，福建 廈門 361021；2.廈門醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院病理科，福建 廈門 361021

出血是戰(zhàn)傷、外科手術(shù)和日常意外事故中常常遇到的問題，甚至危及人們的生命。因此，如何有效的止血、研究和選擇快速、有效的止血材料一直是個重要課題。目前臨床常用的可吸收止血材料主要為纖維素類、明膠蛋白、明膠類、淀粉類、殼聚糖。近年，殼聚糖作為止血材料因具有良好的生物相容性、高透氣和高親水性、抑菌抗炎和促進(jìn)傷口愈合等特點(diǎn)而成為研究熱點(diǎn)［1］；氧化再生纖維素是近年廣泛用于臨床的一種止血材料，來源廣泛，止血效果良好，體內(nèi)完全降解，但水溶性較差、止血機(jī)制單一。如能將氧化再生纖維素與殼聚糖相結(jié)合制成復(fù)合物，既增加氧化再生纖維素水溶性、完善止血機(jī)制以提高止血效果，又兼殼聚糖之良好抑菌、抗炎、促進(jìn)組織愈合作用，可能對臨床及外傷止血更有意義。本實(shí)驗(yàn)以殼聚糖為基礎(chǔ)，制備氧化再生纖維素-殼聚糖基復(fù)合物（oxidized regenerated cellulose/chitosan complex，ORC-CTS），并研究其理化性質(zhì)、止血功能、生物安全性，以期達(dá)到迅速吸血、快速止血、降低感染的目的。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1.1 主要儀器

磁力攪拌器：德國IKA儀器有限公司；冷凍離心機(jī)：德國HERMLE公司；循環(huán)水真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；分析天平：北京賽多利斯儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀：美國熱電有限公司；熱重分析儀：德國耐馳儀器有限公司；酸度計(jì)：德國賽多利斯儀器有限公司。

1.1.2 試劑

再生纖維素：保定天鵝新型制造有限公司（DP=320）；殼聚糖：上海麥克林試劑有限公司（黏度<200 mPa）；次氯酸鈉：上海國藥試劑有限公司；溴化鈉：上海國藥試劑有限公司；2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基自由基（TEMPO）：上海麥克林試劑有限公司；溴化鉀：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冰醋酸：上海國藥試劑有限公司；透析袋：北京索萊寶科技有限公司（透析分子量3 500 D）；氫氧化鈉：上海國藥試劑有限公司；乙醇：上海國藥試劑有限公司。

1.1.3 材料

SD大鼠：上海杰斯捷動物實(shí)驗(yàn)有限公司；速即紗：美國強(qiáng)生公司；復(fù)合微孔多聚糖止血粉：山東塞克賽斯藥業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氧化再生纖維素合成

將氧化再生纖維素樣品（4 g）分散在水（190 mL）、NaBr（0.20 g）和TEMPO（0.02 g）溶液中，在磁力攪拌下加入12%NaCl O溶液（18 mL）開始反應(yīng)；用pH值計(jì)測定保持pH值10～10.5，并用2%NaOH液進(jìn)行調(diào)節(jié)。反應(yīng)32 h后，加入5 mL乙醇溶液終止反應(yīng)。10000 r/min離心10 min，收集沉淀，再加入去離子水洗滌至中性。取氧化的再生纖維素（2.0 g）加入100 mL水，用高速分散器在13 000 r/min下分散5 min，10 000 r/min離心10 min后收集沉淀，冷凍干燥24 h后變?yōu)檠趸偕w維素凍干粉。

1.2.2 氧化再生纖維素負(fù)載殼聚糖

將殼聚糖溶解在1%醋酸溶液中得到0.5%殼聚糖溶液。將1 g氧化再生纖維素加入到200 mL殼聚糖溶液中，室溫下磁力攪拌6 h，10 000 r/min離心10 min后取沉淀，去離子水洗滌6次，最后將洗滌干凈的負(fù)載殼聚糖的氧化再生纖維素冷凍干燥24 h。

1.2.3 表征

以傅立葉紅外光譜儀（美國熱電有限公司）檢測氧化再生纖維素殼聚糖復(fù)合物復(fù)合前后化學(xué)變化。

1.2.4 體內(nèi)止血實(shí)驗(yàn)和毒性分析

（1）肝臟滲血創(chuàng)面模型和股動脈出血模型制作和止血實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)選取80只SD大鼠，分別制作肝臟滲血創(chuàng)面模型和股動脈出血模型，每個模型分以下4組，每組10只大鼠。肝臟滲血創(chuàng)面模型：采用屋頂樣切口進(jìn)腹，逐層進(jìn)入腹腔，顯露并切除部分左葉，形成長20 mm、深2 mm出血（3 s）創(chuàng)面。股動脈出血模型：在大鼠一側(cè)腹股溝游離解剖出股動脈，用尖頭刀挑破、完全橫斷股動脈，使其出血3 s。然后，分別應(yīng)用相同質(zhì)量（100 mg）的氧化再生纖維素/殼聚糖復(fù)合物（ORC-CTS，ORC-CTS組）、殼聚糖（殼聚糖組）、速即紗（速即紗組）止血，其中1組大鼠僅加壓止血，不用任何止血材料（即空白對照組）。觀察各組的出血量和止血時間。

（2）毒性分析

采集大鼠止血后缺損處的肝組織和24、72、168 h血清，HE染色觀察肝組織生長，分析血清TNF、異前列腺素和血管性血友病因子（vWF）含量變化，以評價各組預(yù)后及對應(yīng)用材料的毒性反應(yīng)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 表征

圖1為氧化再生纖維素改性殼聚糖的傅立葉紅外光譜圖（FT-IR）。3430 cm-1附近寬而強(qiáng)的吸收峰是-OH的伸縮振動峰，2 875 cm-1附近吸收峰是C-H的伸縮振動峰，1 070 cm-1附近吸收峰是葡萄糖單元-O-的吸收峰。在1 634 cm-1附近的峰強(qiáng)出現(xiàn)不同程度增加，該峰對應(yīng)為酞胺基團(tuán)，表明殼聚糖的-NH2和ORC上的-COOH發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)。

圖1 氧化再生纖維素改性殼聚糖紅外光圖譜Fig.1 Infrared spectra of chitosan modified by oxidized regenerated cellulose

2.2 體內(nèi)止血效果比較

在SD大鼠肝臟創(chuàng)面出血模型，ORC-CTS組的紗布吸血量即出血量（1.339±0.072）g明顯少于殼聚糖［（2.148±0.152）g，P<0.05］、速 即 紗［（1.621±0.075）g，P<0.05］及空白對照組［（2.605±0.067）g，P<0.05］；ORC-CTS組的止血時間（67.700±3.401）s明顯短于殼聚糖組［（120.000±1.155）s，P<0.05］、速即紗組［（90.300±2.791）s，P<0.05］、空白對照組［（135.500±2.173）s，P<0.05）］（表1）。表明ORCCTS能減少大鼠肝創(chuàng)面出血的出血量并縮短止血時間。而且，在SD大鼠股動脈橫斷出血模型，ORCCTS組的紗布吸血量即出血量（1.242±0.088）g亦明顯少于殼聚糖組［（1.816±0.052）g，P<0.05］、速即紗組［（1.437±0.503）g，P<0.05］、空白對照組［（2.092±0.103）g，P<0.05］；止血時間（47.300±3.592）s亦明顯短于殼聚糖組［（89.000±2.828）s，P<0.05］、速即紗 組［（68.100±3.107）s，P<0.05］、空 白 對 照 組［（105.500±2.173）s，P<0.05］（表2）。表明，ORCCTS能減少大鼠股動脈出血的出血量并縮短止血時間?？傊?，相較殼聚糖、速即紗，ORC-CTS能減少大鼠模型的出血量，縮短止血時間。

表1 各組SD大鼠肝臟創(chuàng)面止血效果Tab.1 The hemostatic effect of liver wounds in SD rats in four groups

表2 各組SD大鼠股動脈出血止血效果Tab.2 The hemostatic effect of femoral artery hemorrhage in SD rats in four groups

2.3 體內(nèi)炎癥反應(yīng)及毒性比較

本實(shí)驗(yàn)通過采集SD大鼠術(shù)后1、3、7 d肝臟模型缺損處肝組織行HE染色觀察肝創(chuàng)面壞死區(qū)域面積及炎癥細(xì)胞浸潤程度以評價各組生物體內(nèi)炎癥反應(yīng)。圖2為術(shù)后1、3、7 d，各組肝創(chuàng)面均可見少量變性壞死，匯管區(qū)局灶淋巴細(xì)胞及少量中性粒細(xì)胞浸潤，術(shù)后第7天較第1、3天炎性細(xì)胞較多；炎癥程度依次對照組

圖2 肝創(chuàng)面止血術(shù)后1、3、7 d缺損處肝組織HE染色Fig.2 HE staining of liver tissues 1，3，and 7 days after liver wound hemostasis

本實(shí)驗(yàn)還采集肝臟創(chuàng)面模型SD大鼠術(shù)后1、3、7 d血清，通過分析血清TNF-α（炎癥指標(biāo)）、異前列腺素（氧分指標(biāo)壓）和vWF含量變化，以評價各組的體內(nèi)毒性反應(yīng)。圖3為ORC-CTS組血清三種蛋白變化與對照組無差異。表明，ORC-CTS幾無體內(nèi)毒性。

圖3 大鼠肝創(chuàng)面止血后1、3、7 d血清TNF-α、異前列腺素、vWF含量變化即體內(nèi)毒性反應(yīng)Fig.3 Serum TNF-α，isoprostanes，and v WF levels 1，3，and 7 days after liver wound hemostasis（i n vivo toxicity）

3 討論

殼聚糖，也稱甲殼胺，是甲殼素的脫乙?；苌?，因其在自然界中來源廣泛、無毒、可自然降解，且具良好的抗菌、強(qiáng)吸附和吸濕保水、生物相容性［2］，故和其衍生物廣泛運(yùn)用于吸附材料、過濾材料、保濕劑、食品保鮮劑等領(lǐng)域；還因具有抗菌、消炎、止血、減少創(chuàng)面滲液和促進(jìn)創(chuàng)面再生、修復(fù)、愈合［3］，廣泛用作醫(yī)用材料或與其他材料復(fù)合制備止血材料、創(chuàng)面敷料、人工支架，也可用作醫(yī)用材料改性劑及藥物緩釋劑［4］。有報道，殼聚糖可以薄膜、海綿、水溶膠等形態(tài)與其他具有治療價值的高分子聚合物材料如納米銀、海藻酸鹽等形成復(fù)合型殼聚糖敷料，用于不同部位的傷口治療；應(yīng)用殼聚糖改性人工韌帶，改善其性能［5］，或改性長絲聚乳酸，以獲斷裂強(qiáng)度適中、表面光滑、可減少縫合疼痛的殼聚糖改性手術(shù)縫線［6］；關(guān)節(jié)內(nèi)注射殼聚糖治療膝骨關(guān)節(jié)炎［7］。在止血材料領(lǐng)域，已有報道殼聚糖絲素蛋白多孔復(fù)合物［8］、殼聚糖/明膠海綿復(fù)合物［9］、殼聚糖/海藻酸鹽復(fù)合物［10］、介孔硅/殼聚糖復(fù)合物［11］等相關(guān)研究，但殼聚糖/氧化再生纖維素復(fù)合物用作止血材料則鮮有報道。

殼聚糖的止血機(jī)制主要包括以下方面：（1）殼聚糖表面正電荷與紅細(xì)胞帶負(fù)電荷的胞壁酸結(jié)合，產(chǎn)生靜電中和反應(yīng)，發(fā)生凝集，快速形成血凝塊止血；（2）殼聚糖表面正電荷可與活化血小板表面負(fù)電荷中和，通過ADP途徑對血小板起聚集作用，且聚集后產(chǎn)物能釋放更多活性物質(zhì)如P-選擇素（Pselectin）、血栓素B2（TXB2）等，激活周圍血小板、促進(jìn)血管收縮和纖維蛋白形成等，加強(qiáng)止血效果；（3）殼聚糖本身分子結(jié)構(gòu)與血漿蛋白、凝血因子相互反應(yīng)，使血凝塊更牢固［12］。氧化再生纖維素是通過與血液接觸后形成凝膠狀物質(zhì)，形成物理屏障，同時壓迫出血點(diǎn)；其中一定量的酸性梭基能吸附血液Fe3+，形成棕色凝膠狀物質(zhì)，既能封閉血管末端，形成物理止血，還能吸附、聚集、激活血小板，加速血液凝固［13-14］。本實(shí)驗(yàn)通過氧化再生纖維素負(fù)載殼聚糖制備ORC-CTS，使兩者凝血機(jī)制相互協(xié)同，故增強(qiáng)了止血效果。體內(nèi)止血實(shí)驗(yàn)亦表明，ORC-CTS能顯著減少出血量，縮短出血時間；且生物體內(nèi)炎癥反應(yīng)輕，擁有良好的體內(nèi)生物相容性，在生物體內(nèi)幾乎無毒。因此，本研究制備的ORC-CTS是一種較理想的新型止血材料。如能進(jìn)一步研究并氧化再生纖維素負(fù)載不同分子量的殼聚糖，選出止血效果最佳復(fù)合物，并完善復(fù)合物的抑菌、促進(jìn)傷口愈合等作用，將有助于成為新一代的高效、安全的止血材料。