張旭裕，鐘誠，蒲有為，楊中偉，鮑依稀

重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，重慶 400010

肺癌是世界范圍內發(fā)病率最高的癌癥之一[1]。肺癌在男性中發(fā)病率居世界首位，僅次于女性乳腺癌的發(fā)病率[2]。目前除手術外，放療、化療和靶向治療也是肺癌患者的常見治療方法[3]。然而，這些療法常伴有嚴重不良反應，嚴重影響患者的生活質量。研究發(fā)現(xiàn)，中藥多糖具有抗腫瘤、抗氧化和免疫調節(jié)的作用[4-8]。其中，茯苓多糖（Poria polysaccharide）具有多種生物活性，包括免疫調節(jié)及抗腫瘤作用[9-11]，但其機制尚未闡明。

microRNAs（miRNAs）是一類小的單鏈、進化保守的非蛋白質編碼RNA，在調控基因表達、細胞周期、生物發(fā)育時序等方面起重要作用[12]。miRNA微陣列技術具有靈敏度高、特異性強、線性范圍寬等優(yōu)點，使用通用的實時定量反應條件進行高通量miRNA表達譜分析，檢測miRNA表達譜改變對于破譯差異表達基因的生物學背景極其重要。本研究通過miRNA微陣列技術，尋找茯苓多糖干預后小鼠脾臟免疫相關miRNA差異并預測靶點基因，探索關鍵基因的生物學功能和信號通路，為茯苓多糖的免疫治療提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

C57BL/6雌性小鼠10只，4～6周齡，體質量18～22 g，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證號SYXK（渝）2018-0003。飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級動物房，溫度（23±1）℃，相對濕度40%～70%，12 h光照，自由攝食飲水。

1.2 藥物

茯苓，購自重慶萬鑫藥房連鎖有限公司，批號20191008，由重慶醫(yī)科大學中藥學院王剛教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核。

1.3 主要試劑與儀器

TriPure分離試劑（貨號11667157001）、DNA酶（貨號M0303S）、All-in-OneTMmiRNA第一鏈cDNA合成試劑盒（貨號QP013）、All-in-OneTMqPCR混合液（貨號QP001）、All-in-OneTMqPCR引物，美國GeneCopoeia公司。Light cycler480ⅡRT-PCR System（瑞士Roche公司），UV-NanoDrop?8000分光光度計（美國Thermo公司），TP650普通PCR儀（日本Takara公司），5810R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），SHZ-Ⅲ旋轉蒸發(fā)儀（中國Chongye公司），F(xiàn)D-1A-50真空冷凍干燥機（中國Bilon公司）。

2 實驗方法

2.1 茯苓多糖制備

精確稱取200 g茯苓于燒杯中，加入2 000 mL蒸餾水，80 ℃水浴提取2 h，過濾，重復2次，合并提取液，離心去沉淀，減壓濃縮。冷卻后加4倍體積無水乙醇，置于4 ℃冰箱中沉淀24 h。離心取沉淀，用少量蒸餾水溶解，加入1/5體積的sevag試劑（氯仿∶正丁醇＝4∶1），電動攪拌器快速攪拌10 min，4 000 r/min離心3 min，取上清液，不斷重復除蛋白數(shù)次，直到除盡。取上清液在純水中透析36～48 h，濃縮，冷凍干燥，即得茯苓多糖。

2.2 造模、分組及給藥

Lewis肺癌細胞（LLC）由陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院方軍教授提供。細胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將LLC消化處理，配制成4.0×106個/mL細胞懸液，每只小鼠右腋皮下注射100 μL細胞懸液。將10只小鼠隨機分為生理鹽水組和茯苓多糖組，每組5只。待腫瘤體積增長至1 cm3后，生理鹽水組予生理鹽水灌胃，茯苓多糖組予茯苓多糖（200 mg/kg）藥液灌胃。每日1次，連續(xù)灌胃4 d停1 d為1個周期，連續(xù)4個周期。觀察小鼠精神狀態(tài)，每2 d監(jiān)測小鼠體質量及腫瘤體積。20 d后，脫頸處死小鼠，收集腫瘤、脾臟和胸腺組織稱重，計算腫瘤抑制率[（1－茯苓多糖組平均腫瘤質量÷生理鹽水組平均腫瘤質量）×100%]、脾臟指數(shù)[脾質量（g）÷體質量（g）×100%]、胸腺指數(shù)[胸腺質量（g）÷體質量（g）×100%]。

2.3 miRNA微陣列分析及靶標預測

取80～100 mg脾臟組織，加入液氮研磨至粉末狀，轉移至裝有1 mL TriPure的1.5 mL離心管，振蕩混勻后室溫靜置5 min。加入0.2 mL氯仿，振蕩混勻15 s，室溫靜置3 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。棄上清，空氣干燥RNA沉淀約5 min，加入適量DEPC溶解RNA沉淀。分光光度計測定RNA濃度和純度。配制1%TAE瓊脂糖凝膠進行RNA電泳，檢測RNA完整性。使用DNaseⅠ除去RNA樣品中污染的基因組DNA，進行miRNA反轉錄。配制miRNA反轉錄反應液，短暫離心后37 ℃孵育1 h，85 ℃滅活處理5 min，用滅菌水稀釋5倍，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩CR檢測采用標準三步法，以20 μL反應體積進行qPCR引物陣列分析，每個陣列都是一組針對89個與肺癌免疫進展密切相關的經優(yōu)化驗證的qPCR引物。此外，MsnoRNA U6、MsnoRNA U68、MsnoRNA U70、MsnoRNA U49A、MsnoRNA U72和陰性對照均用作標準化表達結果的參考因子。

使用ΔΔCt方法對不同樣品的基因進行相對定量。ΔΔCt＝AveΔCt（測試）－AveΔCt（對照）。2-ΔΔCt值是不同樣品之間目標基因表達水平的差異倍數(shù)。通過GeneCopoeia在線數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)（http://www.gene copoeia.com.cn/product/qpcr/analyse/）分析miRNA表達水平。使用生物信息學在線軟件（http://www.bio informatics.com.cn/）進行聚類分析。篩選｜Fold change｜＞1.5的miRNA。使用TargetScan 7.1（http://www.targetscan.org/）、miRDB（http://mirdb.org/）、miRWalk（http://mirwalk.umm.uniheidelberg.de/）數(shù)據(jù)庫預測各差異miRNA的靶點基因，并取交集匯總。

2.4 GO和KEGG富集分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）對下游靶點基因進行GO功能及KEGG通路富集分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.5 蛋白相互作用網絡構建及關鍵基因分析

通過STRING數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org/）構建PPI網絡，并使用Cytoscape 3.8.0軟件進一步分析。使用CytoHubba模塊通過不同排秩方法篩選Hub基因。

3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗結果以±s表示，多組比較用方差分析，兩兩比較用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 茯苓多糖對小鼠腫瘤和免疫器官指數(shù)的影響

與生理鹽水組比較，茯苓多糖組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)明顯升高（P＜0.05），腫瘤質量明顯減輕（P＜0.05），見表1，腫瘤抑制率為16.75%。腫瘤體積隨時間變化趨勢見圖1。

表1 2組小鼠腫瘤質量和免疫器官指數(shù)比較（±s）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 只數(shù) 腫瘤質量/g 脾臟指數(shù)/% 胸腺指數(shù)/%生理鹽水組 5 8.318 4±0.63 0.90±0.05 0.054±0.001茯苓多糖組 5 6.887 2±0.55* 1.11±0.09** 0.113±0.013**

圖1 2組小鼠腫瘤體積隨時間變化趨勢（±s，每組5只）

4.2 差異miRNA篩選及靶標預測結果

根據(jù)miRNA表達結果確定茯苓多糖組和生理鹽水組miRNA差異表達水平，見圖2。篩選｜Fold change｜＞1.5的miRNA。與生理鹽水組比較，茯苓多糖組有8個差異miRNA：mmu-miR-29b-3p、mmu-miR-139-5p、mmu-miR-21-5p、mmu-miR-18a-5p、mmu-miR-126-3p、mmu-miR-29a-3p、mmu-miR-451和mmu-miR-143-3p。此外，使用層次聚類法分析差異表達的miRNA，見圖3。使用TargetScan、miRDB和miRWalk在線數(shù)據(jù)庫預測8個差異miRNA的靶點mRNA。最終選擇3個數(shù)據(jù)庫的交集mRNA，見圖4。

圖2 2組小鼠miRNA倍數(shù)變化柱狀圖

圖3 2組小鼠miRNA表達層次聚類分析

圖4 TargetScan、miRDB和miRWalk數(shù)據(jù)庫靶標基因韋恩圖

4.3 GO和KEGG富集分析結果

GO分析發(fā)現(xiàn)，靶點基因參與多種生物過程（BP），如細胞生物過程、代謝過程、發(fā)育過程、生物調節(jié)和轉錄調控過程；一些基因與細胞成分（CC）的結構有關，如細胞質、細胞核、細胞骨架、細胞連接、蛋白質復合物和核質部分；涉及的分子功能（MF）有結合、催化活性、核酸結合和蛋白質結合功能。結果表明，茯苓多糖干預后可能引起細胞成分、生物過程和分子功能的改變。見圖5。

圖5 茯苓多糖調節(jié)Lewis肺癌小鼠脾臟免疫靶點基因GO分析

KEGG通路富集可用于評估有差異表達的信號轉導和代謝途徑。茯苓多糖組受影響的前33條主要通路（P＜0.01）見圖6。富集度較高的途徑包括癌癥通路、癌癥蛋白聚糖、PI3K-Akt、MAPK和Ras信號傳導途徑，這些途徑可能與茯苓多糖治療Lewis肺癌小鼠的免疫調節(jié)有關。

圖6 茯苓多糖調節(jié)Lewis肺癌小鼠脾臟免疫靶點基因KEGG通路富集分析（P＜0.01）

4.4 蛋白相互作用網絡構建及關鍵基因分析結果

關鍵基因是在生物過程中起重要作用的基因。在相關途徑中，其他基因的調控通常受Hub基因影響。因此，Hub基因是重要的研究靶點。通過STRING數(shù)據(jù)庫分析504個交集靶點基因，并使用Cytoscape 3.8.0繪制PPI網絡，見圖7。CytoHubba使用中介中心性（betweenness）排秩方法對前30個Hub基因進行分析，見圖8。通過使用不同排秩方法分析前10個Hub基因，并取交集獲得3個關鍵基因（Mapk8、Kras、Stat3），結果見表2。

表2 不同排秩方法的前10位Hub基因

圖7 茯苓多糖調節(jié)Lewis肺癌小鼠脾臟免疫靶點基因PPI網絡

圖8 前30個Hub基因PPI網絡

5 討論

茯苓含多糖、脂肪酸、三萜類化合物、酶及固醇等生物活性成分，其中茯苓多糖具有免疫調節(jié)和抗腫瘤作用。為進一步分析茯苓多糖的免疫調節(jié)潛力，本研究通過miRNA微陣列和生物信息學技術篩選并分析差異表達miRNA，并進一步分析其作用和參與的不同信號傳導途徑。與生理鹽水組比較，茯苓多糖組小鼠篩選出8種異常表達miRNA。前期研究表明，miR-29b-3p通過抑制COL1A1基因表達，上調PTEN和Bax蛋白表達，逆轉A549/DDP細胞順鉑耐藥性[13]。miR-139-5p在多種腫瘤組織中表達下調，并可作為潛在的腫瘤抑制因子發(fā)揮作用，已發(fā)現(xiàn)其表達與非小細胞肺癌（NSCLC）患者的腫瘤體積、臨床分期、病理類型和淋巴結轉移有關[14]。Huang等[15]研究顯示，miR-139-5p過表達可明顯抑制NSCLC細胞增殖。miR-126-3p在生長調節(jié)中起重要作用，且其水平在NSCLC組織和細胞中均顯著下調[16]。相反，miR-451a可通過調節(jié)激活轉錄因子2活性抑制NSCLC細胞的遷移和侵襲能力[17]。本實驗結果表明，茯苓多糖在改變小鼠miRNA表達方面發(fā)揮顯著作用。

PI3K/Akt通路在多種生物活性物質信號轉導中起重要作用。有研究表明，腫瘤相關巨噬細胞可通過PI3K/Akt信號通路對肺癌A549細胞產生作用[18]。miR-145通過調節(jié)EGFR/PI3K/Akt信號通路抑制NSCLC細胞遷移并誘導細胞凋亡[19]。Zhang等[20]研究表明，葉黃素通過抑制PI3K/Akt信號通路抑制細胞生長并激活細胞凋亡。miR-16可針對性地抑制MAPK激酶1調節(jié)信號轉導途徑，從而調節(jié)肺癌細胞增殖和侵襲[21]。

Stat3和Kras對NF-κB轉錄因子活性具有正向調控作用[22-23]，并參與細胞因子介導的信號通路[24]。此外，Kras參與Ras蛋白信號轉導，并對MAPK活性有正調控。Stat3的其他生物過程包括對白細胞介素-6產生的正向調控，其受體通過JAK/STAT和Th17型免疫應答信號通路發(fā)揮作用。此外，Mapk8能應激激活MAPK級聯(lián)反應，其生物過程涉及凋亡信號通路的正調控。

本研究利用差異基因預測出PI3K-Akt、MAPK和Ras 3個信號通路，成功構建了差異基因的PPI網絡，并篩選出網絡中可能參與免疫調節(jié)過程的3個關鍵基因（Stat3、Kras和Mapk8），表明其在茯苓多糖干預肺癌荷瘤小鼠中的關鍵作用。對該網絡的進一步研究將有利于理解茯苓多糖的免疫調節(jié)作用機制。