李 根，任國艷,2,3, ，李 倩，周 明，張軼馨，肖 楓

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽 471023；2.河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南洛陽 471023；3.國家食品加工與安全教育實驗示范中心，河南洛陽 471023）

膠原主要存在于動物的各種結(jié)締組織中，起支撐和保護(hù)作用，約占動物總蛋白的30%。膠原蛋白具有生物相容性好、抗原性低、凝膠乳化、降解、保水、促進(jìn)細(xì)胞定向黏附生長等特點，已廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、生物醫(yī)用材料等領(lǐng)域[1]。膠原蛋白的主要來源是陸生動物，如牛、豬、馬和其他死后動物的廢棄物[2]，但考慮到宗教信仰對一些動物有禁忌，以及存在瘋牛病等人畜共患傳染病的隱患，目前常采用水生動物，如海參、尼羅羅非魚魚皮等加工廢棄物為原料提取膠原蛋白[3-4]。然而，關(guān)于從兩棲類動物及其廢棄物中提取膠原蛋白研究相對較少。目前已報道的兩棲類研究僅有蛙[5-6]、甲魚[7]和大鯢[8]。

人工養(yǎng)殖的大鯢是中國特有的大型兩棲動物，可以加工食用。鯢皮中膠原蛋白含量較高，可以通過不同的提取方法從鯢皮中提取膠原蛋白[9]。由于鯢皮表皮結(jié)構(gòu)致密，膠原溶出困難，常規(guī)提取方法提取率較低，故一般通過輔助方法提高其提取率。超聲輔助提取技術(shù)由于其空化效應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的快速釋放、擴(kuò)散和溶解[7]。與傳統(tǒng)提取方法相比，超聲輔助提取技術(shù)具有提取時間短、效率高、對有效成分結(jié)構(gòu)破壞小、提取溫度可控等優(yōu)點，在食品工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。故本研究采用超聲輔助處理鯢皮，通過單因素實驗探究固液比、超聲時間、超聲功率對膠原蛋白產(chǎn)量的影響。采用響應(yīng)面分析法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得鯢皮膠原蛋白提取的最佳工藝參數(shù)。對比分析了超聲輔助提取率和超聲輔助提取的鯢皮膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特性，以期為膠原蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)和后續(xù)的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮大鯢 洛陽華鯢生物科技股份有限公司；L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 北京盛世康普化工技術(shù)研究院；胃蛋白酶（1:3000 IU） 上海藍(lán)季生物公司；本研究使用的其他化學(xué)試劑 均為分析級。

KQ-600VDV超聲清洗儀 昆山超聲儀器有限公司；TM3030Plus掃描電鏡 日本日立高新技術(shù)公司；VERTEX70傅里葉變換中遠(yuǎn)紅外光譜儀 德國BRUKER公司；A300氨基酸自動分析儀 德國曼默博爾公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鯢皮膠原提取工藝流程 本法采用酶法提取膠原蛋白，選用胃蛋白酶做酶解劑，胃蛋白酶提取可保留膠原蛋白相對完整的三螺旋結(jié)構(gòu)[10]。

鯢皮經(jīng)預(yù)處理、除雜、脫脂、超聲處理（未處理）、酶解、離心、鹽析和透析流程后，再經(jīng)冷凍干燥，即可得到鯢皮膠原蛋白。具體工藝步驟如圖1所示。

圖1 鯢皮膠原蛋白提取工藝圖Fig.1 Extraction process of salamander skin collagen

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 超聲功率對膠原蛋白提取率影響 取預(yù)處理好鯢皮50 g，在液固比20 mL/g、超聲時間20 min時，探究超聲功率（60、120、180、240和300 W）對膠原蛋白提取率的影響。

1.2.2.2 超聲時間對膠原蛋白提取率影響 取預(yù)處理好鯢皮50 g，在液固比20 mL/g、超聲功率180 W時，探究超聲時間（10、15、20、25和30 min）對膠原蛋白提取率的影響。

1.2.2.3 液固比對膠原蛋白提取率的影響 取預(yù)處理好鯢皮50 g，在超聲功率180 W、超聲時間25 min時，探究液固比（10:1、15:1、20:1、25:1及30:1 mL/g）對膠原蛋白提取率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面設(shè)計 通過單因素實驗，選取各因素對膠原蛋白提取率影響較大的三個水平，利用Design-Expert 8.0對三因素三水平BBD模型進(jìn)行設(shè)計和分析，確定超聲輔助提取的最佳條件。因素水平編碼表見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計中試驗因素水平代碼表Table 1 Codes and levels of test factors in Box-Behnken design

在17輪試驗中檢測了超聲功率（X1）、超聲時間（X2）和液固比（X3）三個自變量對膠原提取率（Y）的影響。對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，擬合二次多項式模型[11]：

式中，Y為響應(yīng)變量（膠原產(chǎn)率）；偏移項β0；一次項為βi；二次項為βii；相互作用項為βij；編碼自變量為Xi和Xj。

1.2.4 鯢皮膠原蛋白提取率測定 采用羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測膠原蛋白提取率。羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸，膠原蛋白的含量可由其所含的羥脯氨酸含量乘以換算系數(shù)得到。參照文獻(xiàn)[12-13]方法，以吸光值為縱坐標(biāo)，L-羥脯氨酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。可得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0662x+0.0007，R2=0.999。

樣品（圖1中上清液）消化后，過濾，蒸餾水定容，取1 mL濾液[8]，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定其吸光值，根據(jù)L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線算出待測樣品的羥脯氨酸含量，通過換算，計算出膠原蛋白提取率。

式中：W為膠原蛋白提取率，%；ω為待測液中羥脯氨酸含量，mg/mL；V為待測液體積，mL；11.1為羥脯氨酸換算系數(shù)；D為稀釋倍數(shù)；M為鯢皮中膠原蛋白含量，mg。

1.2.5 掃描電鏡 利用離子濺射儀對經(jīng)超聲處理和未經(jīng)超聲波處理的凍干小片大鯢皮進(jìn)行噴金處理，掃描電鏡真空狀態(tài)下觀察其微觀結(jié)構(gòu)[14]，放大倍數(shù)為50倍，用同樣的方法對UAEEC和EEC進(jìn)行了掃描電鏡觀察，放大倍數(shù)為100倍。

1.2.6 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE） 參照Laemmli[15]的方法，采用垂直板型電泳裝置，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的分離膠和5%的濃縮膠，電壓為100 V。電泳結(jié)束后，膠板使用0.5%的考馬斯亮藍(lán)（R250）染色2 h，然后使用脫色液（乙酸:乙醇:蒸餾水=3:5:35）使膠板脫色，直至條帶清晰。脫好色的膠板使用凝膠成像儀掃描凝膠成像。

1.2.7 傅里葉紅外光譜（FT-IR） 參照Ren等[16]，對凍干的樣品與干燥的溴化鉀研磨，壓成透明薄片，放入中遠(yuǎn)紅外光譜掃描儀，在4000～400 cm-1的范圍內(nèi)進(jìn)行測量。

將紅外波譜圖中1600～1700 cm-1的譜帶（酰胺I帶）進(jìn)行基線校正，用9點平滑后，進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)和傅里葉解卷積技術(shù)，確定每個子峰的峰位和半峰寬度。用高斯函數(shù)對光譜進(jìn)行擬合,通過多重擬合將最小殘差重疊的不同譜帶完全區(qū)分開來。確定各子峰與不同二級結(jié)構(gòu)之間的對應(yīng)關(guān)系，并根據(jù)其積分面積計算出各種二級結(jié)構(gòu)的相對含量百分比。

1.2.8 氨基酸分析 參照Garmen等[17]，樣品使用6 mol/L鹽酸溶解，真空狀態(tài)下在110 ℃水解24 h，水解完全后，過濾，定容。從容量瓶中移取1 mL置于5 mL離心管內(nèi)，氮吹儀處理至離心管內(nèi)剩余少量殘余，加入1 mL樣品緩沖液震蕩混勻后，用0.45 μm濾膜過濾到樣品瓶中做好標(biāo)記備用。將標(biāo)記好的樣品瓶放入全自動氨基酸分析儀中測定其氨基酸組成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗每個樣品重復(fù)測定3次，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用 Microsoft Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理，用SPSS 25對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（差異顯著，P＜0.05）并應(yīng)用Origin 2017軟件繪制作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果分析

圖2 A顯示了超聲功率對膠原提取率的影響。隨著超聲功率從60 W增加到180 W，膠原蛋白的產(chǎn)率也隨之提高，在180 W時，膠原蛋白的提取率達(dá)到最大值，為37.19%，當(dāng)超聲功率再次增大時，提取率呈下降趨勢。這一現(xiàn)象的原因是超聲功率的不斷提高能有效地破壞鯢皮表皮的結(jié)構(gòu)，使其結(jié)構(gòu)疏松，促進(jìn)膠原的溶解；當(dāng)功率超過一定值時，由于超聲波的空化效應(yīng)，導(dǎo)致鯢皮組織產(chǎn)生交聯(lián)，不利于膠原的溶解[18]。所以，選擇180 W作為超聲輔助提取鯢皮膠原蛋白的最佳功率。

圖2 B顯示了超聲時間對膠原蛋白提取率的影響。隨著超聲時間的延長，膠原產(chǎn)量明顯增加。在25 min時，膠原產(chǎn)量最高可達(dá)37.27%。之后，隨著超聲處理時間的延長，膠原提取率略有下降，說明膠原已被完全提取。由于超聲時間過長會浪費能量和增加生產(chǎn)成本，故選擇25 min為最佳超聲時間[19]。

從圖2C可以看出，液固比從10:1 mL/g增加到30:1 mL/g時，膠原的提取率從29.28%增加到36.19%，這可能是由于溶液傳質(zhì)驅(qū)動力的增加[20]。但隨著比例的增加，提取液中超聲能量密度分布減小，膠原提取率略有下降。所以，在此條件下，液固比為20:1 mL/g是從鯢皮膠原蛋白提取的最佳配比。

圖2 不同提取條件對鯢皮膠原蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of different extraction conditions on the extraction rate of collagen from salamander skin

2.2 響應(yīng)面設(shè)計與方差分析

RSM試驗結(jié)果如表2所示，數(shù)據(jù)回歸分析結(jié)果如表3所示。F值是評價變量對響應(yīng)值的影響。一般來說，F(xiàn)值越大，對響應(yīng)值的影響越大。表3中模型的F值為61.94，P＜0.0001，表明該回歸模型極顯著，可靠性高?！笆M項F值”為1.79（P=0.2888＞0.05）意味著“失擬項”相對于純誤差而言不顯著，證實了模型的有效性[21]。

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results

軟件分析得到的二次回歸方程的擬合系數(shù)R2=0.9876＞0.9，表明回歸模型與試驗結(jié)果擬合程度較高，但R2最大，并不意味著模型的一致性最好。對于一個好的統(tǒng)計模型，模型調(diào)整確定系數(shù)（R2adj）應(yīng)該與R2相近，以更好地說明模型[22-23]的有效性。從表3可以看出，調(diào)整系數(shù)R2adj＝0.9717與R2=0.9876非常接近，表明實驗值與預(yù)測值吻合較好。此外，變異系數(shù)（C.V.＝0.74%）值很小，表明數(shù)據(jù)精度高，模型可靠性好[24]。通過對實驗數(shù)據(jù)的分析，響應(yīng)變量與自變量之間存在如下二次多項式關(guān)系：

表3 二次多項式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance (ANDVA) for the quadratic polynomial mode

式中，Y、X1、X2、X3分別表示膠原蛋白提取率（%）、超聲功率（W）、超聲時間（min）和液固比（mL/g）。

根據(jù)F和P值分析（表3），一次項X1和二次項有極顯著影響（P＜0.0001），X2、X3、X1X2、X2X3和影響顯著（P＜0.05），交互作用項X1X3影響不顯著（P＞0.05）。各因素對膠原提取率的影響大小順序為：超聲功率＞超聲時間＞液固比。

2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

圖3 顯示了3D響應(yīng)曲面圖和各自的等高線圖。這些圖表直觀地評估兩個變量之間是否存在交互作用，并確定該變量的最優(yōu)值[25]。在這項研究中，通過響應(yīng)面得到膠原蛋白提取率和兩個連續(xù)變量，而另一個變量在零水平上保持不變。圖3（a、b、c）的三維圖像表面均為凸面，最高點落在選定區(qū)域，說明相關(guān)因素的選取是合理的。圖3（d、f）中變量的等高線圖趨于橢圓形，表示超聲功率與超聲時間、超聲時間與液固比之間有一個作用更為突出的因素；圖3e中變量的等高線趨于圓形，說明超聲功率和液固比的相互作用不明顯。這與表3的數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。

圖3 各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots of factor interactions

如圖3a所示，響應(yīng)面沿超聲功率方向的斜率大于超聲時間方向的斜率，說明超聲功率對膠原蛋白產(chǎn)量的影響較大。如圖3b所示，響應(yīng)面沿超聲功率方向的斜率大于液固比的斜率，說明超聲功率對膠原產(chǎn)量的影響較大。如圖3c所示，響應(yīng)面沿超聲時間方向的斜率大于液固比的斜率，說明超聲時間對膠原產(chǎn)量的影響較大。實驗結(jié)果與上述因素對膠原產(chǎn)量的影響是一致的。

2.4 預(yù)測模型驗證

選擇最佳條件對二次多項式方程進(jìn)行檢驗，預(yù)測膠原提取率最高為37.76%，但根據(jù)實際生產(chǎn)操作需要，需要對最佳工藝條件稍作修改：超聲功率為201 W，超聲時間為26 min，液固比為21:1 mL/g，并進(jìn)行了3次重復(fù)驗證實驗。UAEEC的平均提取率為37.36%±2.61%（n=3），與預(yù)測值吻合較好。以上結(jié)果證實了響應(yīng)面模型能夠充分、可靠地優(yōu)化鯢皮膠原蛋白的超聲輔助提取工藝[26]。在此條件下，EEC的產(chǎn)率為17.56%±1.77%，說明超聲輔助處理能明顯提高膠原的提取率。

2.5 掃描電鏡分析

根據(jù)掃描電鏡觀察，經(jīng)超聲處理的鯢皮表面有許多較大孔洞（圖4A），這可能是由于超聲波空化，導(dǎo)致表面的一些腺體開口擴(kuò)張[27]，增加了提取液與表皮之間的接觸面積和深度?？锥磧?nèi)部結(jié)構(gòu)清晰，呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。未經(jīng)處理的鯢皮（圖4B），表皮結(jié)構(gòu)相對完整，表皮上孔洞不明顯，完整性較好，不利于膠原蛋白從皮中溶出。此外，還有一些細(xì)小的氣孔，這可能是真空冷凍干燥過程中內(nèi)部失水造成的[28]。通過對比可以發(fā)現(xiàn)，超聲處理的鯢皮更有利于膠原蛋白的溶出提取。

圖4 鯢皮和鯢皮膠原的電鏡掃描Fig.4 Electron microscopy scan of Chinese giant salamander skin and Chinese giant salamander skin collagen

圖4 C和圖4D分別顯示了UAEEC和EEC的掃描電鏡結(jié)果。兩者均為松散無規(guī)則卷曲的纖維結(jié)構(gòu)，交聯(lián)度較好，有白色片狀的結(jié)構(gòu)與纖維狀膠原結(jié)構(gòu)相連，該片狀結(jié)構(gòu)可能是由于真空冷凍干燥的過程中，膠原蛋白因脫水而產(chǎn)生的聚合，出現(xiàn)部分凝結(jié)的聚合物所導(dǎo)致[29]；UAEEC密集程度高于EEC，表明超聲輔助處理使膠原蛋白發(fā)生了聚集[30]。

2.6 SDS-PAGE分析

UAEEC和EEC電泳圖譜都表現(xiàn)出典型的I型膠原特征（圖5），均由一條γ鏈、一條β鏈和兩條α鏈（α1和α2）組成，未觀察到UAEEC和EEC的亞基組成發(fā)生明顯變化，表明超聲波誘導(dǎo)的鯢皮組織的細(xì)胞破壞不影響膠原亞基組成的完整性[31]。UAEEC的亞基帶表現(xiàn)出明顯的拖尾現(xiàn)象，表明超聲輔助處理可能對膠原的空間結(jié)構(gòu)局部區(qū)域或二級結(jié)構(gòu)的組成有一定的影響（后續(xù)紅外光譜實驗結(jié)果也印證了這一點）。

圖5 鯢皮膠原蛋白SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE of collagen from Chinese giant salamander skin

2.7 紅外光譜分析

從紅外圖譜中（圖6A）可以看出，UAEEC和EEC都存酰胺A、酰胺B和酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的特征吸收峰，與膠原蛋白的紅外特征峰相似[32]。酰胺A與N-H伸縮振動有關(guān)，通常在3400～3440 cm-1處有一個吸收峰。當(dāng)含有N-H基團(tuán)的多肽參與氫鍵的形成時，會導(dǎo)致酰胺A的吸收峰向低頻移動，通常在3300 cm-1。UAEEC和EEC酰胺A帶的位置分別為3300.09 cm-1和3302.02 cm-1，表明UAEEC和EEC中均有氫鍵的生成，且含量基本相同[33]。酰胺B與CH2的不對稱收縮振動有關(guān)，一般出現(xiàn)在2930 cm-1處。UAEEC和EEC均在2925.92 cm-1處有一個吸收峰，表明二者均存在CH2的不對稱收縮振動。酰胺Ⅰ與多肽鏈骨架C=O的伸縮振動有關(guān)，對三螺旋結(jié)構(gòu)的變化非常靈敏，一般在1600～1700 cm-1處有吸收峰。UAEEC和EEC分別在1654.87 cm-1和1658.73 cm-1處有吸收峰，表明都存在C=O伸縮振動。酰胺Ⅱ是由平面彎曲中的N-H和C-N伸縮振動共同產(chǎn)生的，位置在1500～1600 cm-1之間。UAEEC和EEC在1543 cm-1和1548.79 cm-1處產(chǎn)生吸收峰，表明均存在酰胺Ⅱ帶的吸收峰。UAEEC和EEC在1240.19 cm-1處有一個吸收峰，為N-H形變振動引起的酰胺Ⅲ帶，表明蛋白存在三螺旋結(jié)構(gòu)。如上所述，紅外圖譜說明超聲輔助處理未明顯改變膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)。

圖6 膠原蛋白紅外光譜和酰胺I去卷積圖譜Fig.6 Collagen infrared spectroscopy and amide I deconvolution mapping

此外，紅外光譜中酰胺Ⅰ帶，通過去卷積處理，可以反映蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化（圖6B和圖6C）。1600～1640、1640～1650、1650～1660和1660～1680、1680～1690 cm-1波數(shù)處的峰分別表示β-折疊、無規(guī)卷曲、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和反平行β-折疊結(jié)構(gòu)。

從表4可以看出，UAEEC和EEC的二級結(jié)構(gòu)單元含量不同。與EEC相比，UAEEC的α-螺旋含量和β-轉(zhuǎn)角明顯降低，分別從31.96%降至22.12%、25.37%降至20.67%；β-折疊、反平行β-折疊和無規(guī)卷曲的含量均有所增加，分別由22.83%增加到26.18%、5.46%增加到12.21%、14.38%增加到18.83%。這與黃丹丹等[34]研究的超聲處理金槍魚皮提取的膠原蛋白α-螺旋含量降低，β-折疊含量增加和李可等[35]研究的超聲處理使雞胸肉肌原纖維蛋白α-螺旋含量降低，β-折疊和無規(guī)則卷曲含量提高結(jié)果相似。表明，超聲波輔助處理破壞了維持膠原二級結(jié)構(gòu)的分子間力，使膠原的一些理化性質(zhì)和功能特性發(fā)生改變。

表4 EEC和UAEEC的二級結(jié)構(gòu)含量Table 4 Content of secondary structure of EEC and UAEEC

2.8 氨基酸分析

EEC和UAEEC的氨基酸組成如表5所示，EEC中的甘氨酸含量為270.1，UAEEC中的甘氨酸含量為269.6，均占其總氨基酸的四分之一以上，與前人研究的I型膠原蛋白中甘氨酸含量相近[36-37]；EEC和UAEEC的亞氨基氨基酸含量（Pro和Hyp）分別為170.4和171.8。一般認(rèn)為，Pro與Hyp和Pro的吡咯烷環(huán)的氫鍵結(jié)合能力變化會引起膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu)變化。亞氨基酸的含量越高，螺旋的穩(wěn)定性越高，膠原蛋白的熱穩(wěn)定性也就越高[38-39]。因此，可以推測，UAEEC中α-螺旋的減少不是由于亞胺酸含量的變化引起的，而是由于Hyp的氫鍵結(jié)合能力降低所致，這可能是由于超聲的空化作用破壞了蛋白結(jié)構(gòu)里分子間氫鍵[40]。EEC和UAEEC的疏水性氨基酸含量分別為315.1和316.3，表明超聲輔助處理對蛋白溶解度無明顯影響。以上結(jié)果表明，超聲輔助處理對提取的膠原蛋白的氨基酸組成無明顯影響。

表5 鯢皮膠原蛋白氨基酸組成（殘基數(shù)/1000殘基數(shù)）Table 5 Amino acid profiles from giant salamander skin residues/1000

3 結(jié)論

在本研究中，與常規(guī)提取方法相比，超聲輔助提取能明顯提高鯢皮膠原蛋白的提取率。超聲輔助提取最佳工藝條件為：超聲功率201 W，超聲時間26 min，液固比21:1 mL/g，在此條件下，鯢皮膠原蛋白的提取率為37.36%±2.61%。超聲輔助處理能破壞鯢皮表面結(jié)構(gòu)，使溶劑更容易與鯢皮接觸，有利于膠原蛋白的溶出。超聲處理使鯢皮膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)單元α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量降低，β-折疊、無規(guī)則卷曲和β-反平行折疊含量升高，微觀結(jié)構(gòu)更加密集，氨基酸組成則無明顯變化。綜上所述，基于中國大鯢鯢皮膠原蛋白的功能、經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢和生產(chǎn)效率，超聲輔助酶法提取鯢皮膠原蛋白可以作為鯢皮膠原蛋白生產(chǎn)行業(yè)的一種有效方法。