楊 銳，余雍和，程水源,2,3, ，王璋倩,2,3,

（1.武漢輕工大學生命科學與技術學院武漢輕工大學國家富硒農產品加工技術研發(fā)專業(yè)中心，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學國家富硒農產品加工技術研發(fā)專業(yè)中心，湖北武漢 430023；3.武漢輕工大學硒科學與工程現(xiàn)代產業(yè)學院，湖北武漢 430023）

硒對生物體而言是一種必不可少的微量元素，日常中補充不足會增加許多慢性疾病的風險，如血漿中硒濃度較低時前列腺癌風險會增加4～5倍[1]；當人體血硒濃度低于45 μg/L以上時，其心血管疾病的發(fā)病率和病死率會增加2～3倍[2]；Peter等[3]在元素硒防治癌癥的試驗中發(fā)現(xiàn)，8年后隨訪試驗組患者癌癥病死率降低了48%。硒缺乏癥在世界各地的人群中普遍存在，因此，有必要在日糧中添加富硒食品來補充這種微量營養(yǎng)素的不足。在膳食補充中，一般添加無機硒（如亞硒酸鹽）或有機硒（如硒代半胱氨酸）。無機硒不易被人體吸收且安全劑量范圍較窄，高濃度時存在一定的毒性，有機硒吸收與安全性相對較好，但自然界中含量少，生產成本高，因此尋求安全性更高且經濟效益好的補硒方式迫在眉睫[4]。近年來，一些研究發(fā)現(xiàn)納米形態(tài)的單質硒體內活性強、毒性低、吸收好[5]。如從生物功效來看，納米硒表現(xiàn)出較高的自由基清除能力和抗癌活性，納米硒在體外清除羥基自由基的效率為無機硒的5倍，為有機硒的2.5倍[6]?；诩{米硒的特殊性質，目前對硒功能化的研究正在迅猛發(fā)展[7]。

環(huán)境中微生物在硒的生物地球化學循環(huán)中起主要作用[8]。一些水生和土壤細菌已被證明能抵抗硒氧陰離子，并將其還原為元素硒或甲基化硒形式，從而降低生物利用率和毒性，在環(huán)境修復中也具有研究意義[9]。此外，利用微生物合成納米硒，生產成本低，而且生物法生成的納米硒結構穩(wěn)定，分散性好[10]。雖然近幾年對微生物還原亞硒酸鈉生成單質硒的研究逐漸成為熱點，但是關于細菌細胞還原產生紅色單質硒的機理研究較少，不同的細菌，由于所含酶類及參與氧化還原反應物質的不同，可能存在不同的還原機理。如生物體內的蛋白質等活性硫醇基團能夠與亞硒酸鹽反應生成納米硒（selenium nanoparticles,SeNPs），這被認為是一種微生物的脫毒機制[11～12]。此外，研究表明[13]，在毫摩爾濃度的亞硒酸鹽生長的枯草桿菌中大量誘導硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶。芽孢桿菌中硒還原的機制，以bacillithiol（煙酸硫醇）的參與為先決條件[14]。有關亞硒酸鹽在微生物中的轉化機制仍在不斷探索中。研究發(fā)現(xiàn)，微生物可在胞外或胞內多個位點還原積累SeNPs，如表1所示，不同的細菌還原酶系不同，對應的酶還原活性部位也有所差異。

表1 部分微生物合成納米硒顆粒的特性Table 1 Characteristics of SeNPs synthesized by some microorganisms

芽孢桿菌（Bacillus）對外界有害因子抵抗力強，分布廣，存在于土壤、水、空氣以及動物腸道等處，大多數(shù)對人體無害，且具有利用價值。目前對芽孢桿菌亞硒酸鈉還原機理和納米硒形成機理研究較少。本文從長期施加硒肥的大豆種植基地的土壤中篩選出一株耐硒能力較高的細菌高山芽孢桿菌（Bacillus altitudinisF4），探究該菌對亞硒酸鈉的還原作用。測定該細菌對亞硒酸鹽的耐受能力并對還原過程中其生長動力學進行監(jiān)控。最后結合體外還原試驗初步探究該菌亞硒酸鹽還原和單質硒合成的可能機制，旨在為提高利用生物法合成納米硒的產率、富硒微生物的開發(fā)、富硒產品的研發(fā)提供理論指導和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

采樣土壤 長期施加硒肥的大豆種植基地；亞硒酸鈉（Na2SeO3） Sigma；酵母提取物、胰蛋白胨

青島海博生物；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、硫酸鎂 武漢維基生物；還原型輔酶Ⅰ（NADH）、還原型輔酶Ⅱ（NADPH） 生工生物工程（上海）股份有限公司。

HNY-2012C型恒溫培養(yǎng)振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；電子分析天平 賽多利斯科技有限公司；UV1802G型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；Eppendorf AG22331 Hamburg型PCR擴增儀 德國Eppendorf公司；DYY-7型DNA電泳儀 北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種篩選、分離及鑒定

1.2.1.1 菌種篩選及分離 土壤樣品選擇距地表10 cm深處。為了篩選得到芽孢桿菌，稱取土樣置于65 ℃的烘箱中1 h，后用無菌水進行稀釋。稀釋樣品涂布于LB平板上，33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。分離純化的菌株接種到含Na2SeO3的培養(yǎng)基中，于33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后觀察菌落顏色。挑選紅色菌落進行復篩，得到純化的亞硒酸鈉還原菌命名為F4用于后續(xù)試驗。

1.2.1.2 菌株種屬鑒定 細菌的革蘭氏染色試驗和細胞形態(tài)觀察在100×油鏡下進行；細菌的生理生化鑒定試驗按照伯杰氏細菌鑒定手冊要求進行。

以提取的基因組DNA為模板，以通用引物27-F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492-R：5’-ACGGGCGGTGTGTRC-3’進行16S rRNA基因擴增。擴增后得到的產物送上海生工生物有限公司進行測序；得到的序列提交到EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中進行比對并進行BLAST比對。利用MAGA 7.0采用鄰近法（Neighbour-Joining）構建進化樹。

細菌的革蘭氏染色試驗和細胞形態(tài)觀察在100×油鏡下進行；細菌的生理生化鑒定試驗按照伯杰氏細菌鑒定手冊要求進行。

1.2.2 菌株生長動力學 取適量菌液接種到含100 mL LB培養(yǎng)液的三角燒瓶中（OD600約為0.02），在33 ℃下培養(yǎng)，測定生長曲線并檢測菌株生長對數(shù)期。不加亞硒酸鈉作為對照。在菌株生長的對數(shù)前期加硒，測定菌株在含硒培養(yǎng)基中的生長曲線。將不同濃度的Na2SeO3加入細菌溶液中，至終濃度分別為25、50、100 mmoL/L，并在33 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)。在整個培養(yǎng)過程中，每2 h測量一次細胞濃度（OD600），并繪制生長曲線。

1.2.3 耐硒濃度測定 將菌株F4接種到LB液體培養(yǎng)基中搖培并進行生長曲線測定。待其在LB液體培養(yǎng)基生長至對數(shù)期后，調節(jié)菌液濃度后按10～106進行一系列梯度稀釋。取100 μL上述梯度稀釋菌液涂布于含50、100、150、200、250 mmoL/L亞硒酸鈉平板上，以不加硒作為對照組。涂布均勻后于33 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)72 h。待長出菌落形態(tài)后進行計數(shù)，通過公式計算菌株在不同亞硒酸鈉平板上的存活情況。

1.2.4 亞硒酸鹽還原活性分析

1.2.4.1 細胞組分蛋白的提取 取對數(shù)期菌株，6000×g下離心5 min，上清過0.2 μm濾膜，-20 ℃密封儲存?zhèn)溆?。沉淀重懸于磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，pH7.2）洗滌，并超聲處理3 min后，以6000×g離心5 min以去除細胞碎片。收集沉淀備用。再將上述菌體置于預冷后的研缽中，倒入液氮充分研磨，用預冷的PBS將破碎的菌體溶解，超聲（250 W，70次，間隔5 s）10 min，得到細胞研磨液。細胞研磨液于6000×g，4 ℃，離心5 min，得到的沉淀為細胞碎片，-20 ℃密封儲存?zhèn)溆?。將上清（細胞質和細胞膜的混合物）20000×g離心60 min，上清為細胞質，沉淀為細胞膜，-20 ℃密封儲存?zhèn)溆?。向上步得到的細胞碎片中各加? mL的0.1%的Triton×100，振蕩均勻（約1 min），然后再于6000 ×g，4 ℃，離心5 min，收集上清，此為細胞周質，-20 ℃密封儲存，備用[17]。

1.2.4.2 上清液的提取 將培養(yǎng)液4 ℃下12000×g，離心30 min，收集上清，過0.22 μm濾膜，備用。

1.2.4.3 胞外多糖（EPS）的提取 培養(yǎng)菌液于4 ℃下12000×g，離心30 min，收集上清，過0.22 μm濾膜，并用等體積預冷乙醇混合，-20 ℃下預冷沉淀。4 ℃下12000×g，離心30 min，收集沉淀即胞外多糖（EPS），用無菌ddH2O溶解。

1.2.4.4 硒還原活性檢測 使用以下反應混合物測定亞硒酸鹽還原酶的活性：培養(yǎng)上清液，細胞質和膜級分；亞硒酸鈉（終濃度為0.2 mmoL/L）；NADPH或NADH（終濃度為0.2 mmoL/L）。將反應混合物在28 ℃下孵育36 h。分別以不添加培養(yǎng)上清液，細胞質或膜級分的反應混合物作為對照[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗中的數(shù)據(jù)均為3次重復。MAGA 7.0采用鄰近法（Neighbour-Joining）構建進化樹，bootstrap設置為1000次。GraphPad Prism 8.0繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離鑒定

2.1.1 菌株形態(tài)學和生理生化特征 在電子顯微鏡下觀察細胞形態(tài)是短桿狀的結構見圖1。F4菌株在33 ℃下培養(yǎng)24 h后菌落形態(tài)為不透明，呈乳白色，表面有褶皺，邊緣完整，不粘稠。革蘭氏染色為陽性。

圖1 F4菌株在LB平板上的菌落形態(tài)（a）和100倍電子顯微鏡下細胞形態(tài)（b）Fig.1 Colony morphology of F4 strain on LB plate (a) and 100-fold electron microscopic cell morphology (b)

菌株生理生化試驗結果如表2。結果表明，菌株F4能分解利用葡萄糖、蔗糖、甘露糖和阿拉伯糖，在明膠培養(yǎng)基中能分解明膠，氧化酶試驗、枸櫞酸鹽利用、V-P試驗和接觸酶實驗為陽性。對照伯杰氏手冊符合芽孢桿菌屬的生理生化實驗結果。

表2 細菌F4生理生化特征Table 2 Biochemical and physiological characteristics of the bacterial isolate F4

2.1.2 菌種鑒定 通過16S rRNA測序鑒定，獲得的細菌16S rRNA序列在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中進行比對，發(fā)現(xiàn)與模式菌Bacillus altitudinis16S相似度為99.2%。基于Neighbour-Joining的系統(tǒng)發(fā)育分析結果如圖2，菌株與高山芽孢桿菌Bacillus altitudinis聚在同一分支中，自檢支持率達96%，表明該菌株與Bacillus altitudinis有較高的同源性。綜上將該菌株命名為Bacillus altitudinisF4。

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis

2.2 不同亞硒酸鈉濃度下菌株F4生長曲線

通過繪制生長曲線得知，菌株在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)時，經過4 h的延滯期后進入對數(shù)期。有研究表明加硒時間越早，對菌株生長的抑制作用越強[23]。前期測定了F4的生長曲線，分析得該菌株在4 h開始從延滯期過渡，在6 h進入對數(shù)期（圖3中對照組（CK）即為不加硒時菌株生長曲線）。本試驗確定在菌株生長對數(shù)前期即6 h時添加亞硒酸鈉，此時菌株生長相對較快且菌體密度可到最大。如圖3，試驗觀察到添加亞硒酸鹽后8 h內即菌株總培養(yǎng)14 h時，菌株的生長與不加硒相比較緩慢，濃度到達100 mmoL/L時幾乎停滯生長，過了該時期后菌株生長16～48 h進入對數(shù)期，50 h后到達穩(wěn)定期。如圖4，在前10 h時間內，在其生長過程中，培養(yǎng)液首先變渾濁，然后進入對數(shù)期，從14 h后開始顏色慢慢由淡黃色變?yōu)樯罴t色，且添加亞硒酸鈉濃度越高，溶液顏色越淺。但到對數(shù)后期和穩(wěn)定期可以觀察到培養(yǎng)基中均會產生紅色沉淀，表明該菌株在含亞硒酸鹽的液體中會先生長后發(fā)生還原反應，且在生長后會恢復原狀。在相對低濃度25和50 mmoL/L，其對數(shù)后期及穩(wěn)定期含Na2SeO3的吸光度值要高于不含Na2SeO3的LB培養(yǎng)液。在Avenda?o等[24]和袁永強等[25]的研究中也觀察到了同樣的現(xiàn)象，可能原因是Na2SeO3抑制細胞分裂而使細胞體積增大，在經過長時間生長后，細胞密度要大于對照，因而表現(xiàn)吸光度增加現(xiàn)象。Wang等[15]對Proteus mirabilisYC801的研究發(fā)現(xiàn)亞硒酸鹽的還原發(fā)生在指數(shù)生長期后期直到穩(wěn)定期，而且與高濃度的亞硒酸鹽相比，該菌對低濃度的還原更快。但是Fernández-Llamosas等[26]發(fā)現(xiàn)固氮弧菌屬（Azoarcus）僅在穩(wěn)定期開始消耗亞硒酸鹽和形成納米硒。

圖3 不同亞硒酸鈉濃度下B. altitudinis F4生長動力曲線Fig.3 Growth curve of B. altitudinis F4 under different sodium selenite concentrations

圖4 在含亞硒酸鈉培養(yǎng)基中菌株分別在不同時間的生長情況Fig.4 Growth of strains in a medium containing sodium selenite at different time

2.3 菌株F4耐硒能力

如圖5可觀察到，在37 ℃下培養(yǎng)72 h后，與不加硒的LB平板（圖5a）相比，菌株在100 mmoL/L的含亞硒酸鈉平板（圖5b）中，形成的紅色菌落菌落大小明顯變小。

在較低濃度50 mmoL/L亞硒酸鈉平板中，菌株菌落生長較好，存活率為37.08%（圖6）。在高濃度250 mmoL/L亞硒酸鈉平板中，觀察到3～6個單菌落，存活率較小。因此判斷B. altitudinisF4最高可耐250 mmoL/L亞硒酸鈉。濃度越高，對菌株抑制作用越強。菌落大小會隨著亞硒酸鈉濃度的升高而變小，這也表明了較高亞硒酸鈉對細菌具有毒害作用。已報道的微生物的耐硒濃度普遍在1～100 mmoL/L。沼澤紅假單胞菌N（Rhodopseudomonas palustrisN）耐硒濃度為8 mmoL/L[21]，鏈霉菌ES2-5（Streptomycessp.ES2-5）為80 mmoL/L[22]，奇異假單胞菌YC801（Proteus mirabilisYC801）最高耐硒濃度達100 mmoL/L[15]。B. altitudinisF4耐硒濃度可達250 mmoL/L，耐硒能力為較高水平。

圖6 在不同濃度亞硒酸鈉平板中B. altitudinis F4存活率Fig.6 Survival rate of B. altitudinis F4 in different concentrations of sodium selenite

2.4 納米硒合成部位的亞細胞定位

利用體外還原試驗對亞硒酸鹽還原反應在細菌培養(yǎng)中的定位進行了研究，如圖7，分離得到的上清液組分中發(fā)現(xiàn)顏色變化明顯，有紅色沉淀生成，表明亞硒酸鹽的還原活性主要存在于上清液中，可能是含有某種生物活性分子。同時也觀察到在NADH存在的條件下，細胞質中也有略微的還原活性，推測此反應為酶促過程，因此需要電子供體。Lampis等[16]研究Bacillus mycoidesSeITE01還原活性機理發(fā)現(xiàn)在依賴于NADH亞硒酸鹽還原主要存在于膜組分，且在上清液中也有略微還原活性。因此，根據(jù)B.altitudinisF4還原亞硒酸鹽試驗，推測該菌還原可能是由于細菌細胞釋放或在質膜被激活的蛋白質的作用，且在還原合成過程中起到一種還原酶的性質。楊穎等[27]研究屬于β變形菌門的貪銅桿菌（Cupriavidussp. SHE）細胞組分合成納米硒能力的研究中發(fā)現(xiàn)，細胞上清液具有更強的合成納米硒的能力，推測可能是貪銅桿菌能分泌某些生物活性分子，例如谷胱甘肽（glutathione，GSH）等，能在胞外作為還原劑還原亞硒酸鈉為單質納米硒顆粒。有研究發(fā)現(xiàn)多種芽孢桿菌如Bacillus megaterium[11]、Bacillus selenitireducens[20]、Bacillus subtilis[13]與亞硒酸鹽作用之后能夠誘導硫氧還蛋白與硫氧還蛋白還原酶的表達。在B.altitudinisF4還原過程中硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶或其他酶系在還原過程中起作用需在未來試驗中進一步考察研究。

圖7 對具有亞硒酸鹽還原活性的不同細胞部位和培養(yǎng)液進行酶促測定Fig.7 Enzymatic assay on different cell compartments or culture broth fractions with selenite reduction activity

3 討論

本試驗篩選出了一株耐硒能力較強的高山芽孢桿菌（Bacillus altitudinisF4），確定了在平板培養(yǎng)中菌株的最高耐硒濃度，測定了菌株生長動力曲線。大多數(shù)文章在探究菌株對亞硒酸鈉的耐硒能力時，以菌株與不同濃度硒共發(fā)酵過程中的顏色變化為指標來確定菌株最高耐硒濃度，這種方法主觀性較強。本試驗在該基礎上，將一系列濃度梯度的菌液分別涂布在不同濃度的亞硒酸鈉平板上，根據(jù)平板菌落數(shù)計算存活率來確定最高耐硒濃度平板，B. altitudinisF4耐硒能力較強，這為找尋其還原的部位、還原機理提供很好的材料。圖5 菌株F4分別在LB（a）和100 mmol/L亞硒酸鈉（b）平板中菌株菌落形態(tài)

Fig.5 Morphology of bacterial F4 colonies in LB (a) and 100 mmoL/L sodium selenite plates (b)本文通過體外進行亞硒酸鹽還原試驗，初步判斷納米硒合成的機制。在試驗中觀察到上清液顏色變化明顯，有紅色沉淀，表明SeNPs合成主要存在于上清液中。同時也觀察到在NADH存在的條件下，細胞質中也有略微的還原活性。該菌合成納米硒可能是由于分泌了某種活性分子，在還原過程中起到還原酶的作用。但是關于導致亞硒酸鹽離子還原為元素硒形式的確切機制沒有闡明，推測可能是某些生化還原劑僅通過對前體“應激”的反應而被微生物排出[18]。細菌還原亞硒酸鹽的不同酶系分布在細胞不同的部位。如Burkholderia fungorum[19]存在于細胞質中；Thauera selenatis菌的周質中[28]；在Rhodobactersp. NKPB030619菌株的細胞外及EPS發(fā)現(xiàn)還原活性[29]。目前關于各種酶介導微生物還原亞硒酸鈉的可能機制主要有谷胱甘肽和谷胱甘肽還原酶途徑；硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶途徑；亞硫酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶途徑[30]，還有其他物質或酶介導，如Shewanella oneidensisMR-1周質中的富馬酸酯還原酶（Fumarate reductase）[31]。有關介導B. altitudinisF4合成納米硒的生物活性因子或酶系種類的確定，后期階段將繼續(xù)進行更多的試驗來探究亞硒酸鹽的還原過程中的機理和納米硒的合成機制。最終以期得到工業(yè)化菌株，以此能大規(guī)模利用細菌合成納米硒，應用于食品、農業(yè)和畜牧業(yè)、藥物開發(fā)等領域[32-34]。