王曼宇，劉乃新，張福順

（1黑龍江大學生命科學學院/農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150080；2黑龍江大學生命科學學院，黑龍江省寒地生態(tài)修復與資源利用重點實驗室，哈爾濱 150080；3黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，哈爾濱 150080）

0 引言

多糖又稱多聚糖(polysaccharide)，是通過醛糖或酮糖脫水形成的糖苷鍵線性或分枝連接而成的，且普遍存在于植物，動物和微生物組織中，是能夠維持生命活動正常運作的鏈狀聚合物[1-3]，也是構(gòu)成生物機體的基本物質(zhì)之一。20世紀40年代，較早研究多糖主要被用作疫苗[4]。在日本很早就有關(guān)于多糖免疫生物學的研究[5]。20世紀60年代后，隨著大量多糖的研究工作開展，多糖不僅具有重要的藥物活性，而且有一些多糖還具有營養(yǎng)保健的作用。研究表明，多糖在臨床治療有巨大的應用潛能，如免疫調(diào)節(jié)[6]、抗氧化[7]、抗腫瘤[8]、抗疲勞[9]、抗炎癥[10]及其他活性。多糖的提取方法多種多樣，不同提取方法對多糖的得率和活性都有一定程度的影響，所以多糖提取工藝的優(yōu)化和提取方法的探索一直是各界科學家致力研究的方向，一些提取方法使用的藥劑對環(huán)境有一定的危害，這與當今社會追求的綠色環(huán)保的理念所沖突，環(huán)境友好型提取方法也是科研人的最高追求。

由于多糖自身結(jié)構(gòu)的復雜性和多樣性，關(guān)于提取方法對多糖得率和生物活性影響的相關(guān)文獻較少，本研究在大量的文獻基礎(chǔ)上，歸納了一些植物多糖不同提取方法的優(yōu)缺點，總結(jié)了不同提取方法多糖提取率的差異，分析了不同提取方法對其生物活性的影響。為指導多糖提取工作提供理論依據(jù)。

1 植物多糖的提取方法

1.1 水提法

由于多糖具有大量羥基的結(jié)構(gòu)特點，與水反應容易形成氫鍵而溶出，所以植物多糖的傳統(tǒng)提法為水提法。另外多糖不溶于醇類，反應一般加入乙醇會使多糖析出。其方法操作簡單，成本低，無污染，在工業(yè)化生產(chǎn)中應用較多[11]，但耗時長，具有較低的產(chǎn)量，需要進行多次提取[12]。此外，高溫下的長時間提取過程可能導致多糖理化性質(zhì)的變化，導致多糖含量下降，降低其活性[13]。如唐森等[14]在進行白芨水溶性多糖提取研究中，利用響應面優(yōu)化工藝，進行單因素交實驗得水提法提取率為(4.27±0.05)%。根據(jù)水提方法的特點，提取溫度、料液比、提取時間及提取次數(shù)都是影響多糖提取率的因素。實驗多采用正交試驗法或者響應面分析法確定上述幾個因素的最佳比例。胡麗玲等[15]在提取香菇中多糖時，最優(yōu)工藝的提取率達38.50%，最佳工藝組合為：料液比20:1；提取溫度100℃；提取時間3.5 h。

1.2 酸提法

酸提法的主要萃取劑為適宜濃度的弱酸，如乙酸和鹽酸，也可以加入三氟乙酸通入氮氣[16]。Shakhmatov等[17]采用HCl溶液提取方法，從云杉樹綠色植物中提取多糖，單糖分析顯示其具有高含量的醛酸殘基(45%)，水和HCl溶液的連續(xù)萃取導致阿拉伯半乳糖蛋白的含量減少。但是酸性條件下容易引起多糖糖苷鍵的斷裂[18]，強酸或者提取時間過長都會降低多糖提取率，一般使用弱酸，而且廢液對環(huán)境也有一定的污染。所以利用酸提取植物多糖的報道較少，通常是在研究其特定的理化性質(zhì)的條件下才使用。如董洪新[19]用酸提阿魏側(cè)耳多糖研究其對核糖核酸酶的抑制作用時，發(fā)現(xiàn)阿魏側(cè)耳多糖對核糖核酸酶有抑制作用。Peasura等[20]利用硫酸作溶劑提取海藻體內(nèi)的多糖，目的得到抗氧化性高的硫酸多糖。

1.3 堿提法

堿提法是利用弱堿性溶劑提取多糖的一種方法，一般用于一些細胞壁難降解，水提法效率低的植物[21]。在堿性條件下，可以顯著增加纖維的溶脹作用和溶解性，另外還可以促進纖維之間酯鍵的斷裂，進而游離形式的多糖更容易被提取出來，提高多糖的提取率。堿提法對溶液的pH要求較高，容易引入雜質(zhì)，對其單糖結(jié)構(gòu)和活性有一定影響[22]，堿溶液常用氫氧化鈉或氫氧化鉀，以防多糖降解。如俞明君等[23]對杏鮑菇堿溶性多糖的提取。王蘭英等[24]利用多種方法提取花臉香蘑胞內(nèi)多糖時，發(fā)現(xiàn)堿液提取法的多糖得率最高，達到了(21.10±0.13)%。但使用堿液后的廢液較難處理，回收困難，比較浪費。由于多糖，蛋白質(zhì)等大分子碳水化合物對物質(zhì)的穩(wěn)定性具有重要作用，所以Ye等[25]采用堿性分離法提取花生油加工殘渣中的多糖及蛋白質(zhì)復合物，研究其穩(wěn)定性能。

1.4 酶提取法

在植物多糖的提取流程內(nèi)，酶技術(shù)應用比較廣泛，主要能于相對緩和的條件中分解組織，使內(nèi)部多糖快速放出。酶提取是一種高效、溫和高提取率的方法[26]，適用于多糖含量很低，或是溶劑影響大易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的植物多糖的提取，一般常用纖維素酶。所以開發(fā)新酶具有廣闊的前景。但是由于酶本身的性質(zhì)，對外界環(huán)境要求高，容易失活，所以實驗過程要注意，而且酶提法成本較高，不適合大量提取。Devshri等[27]研究發(fā)現(xiàn)，夏枯草多糖提取的最佳工藝為：胰蛋白酶1.0%，果膠酶2.0%，木瓜蛋白酶1.0%，溫度在50℃，pH 6.0，提取時間90 min，多糖提取率最高，總多糖含量為46.93%。

1.5 超聲輔助提取

植物中的有效成分大多被內(nèi)部薄壁細胞或胞液保護，為提取增加了難度。而超聲波具有較強的穿透力，短時間內(nèi)即可破壞植物的組織細胞壁[28]，超聲空化、機械效應和催化作用可加速多糖的釋放和擴散，縮短多糖提取間，減小料液比[29-30]。影響因素包括溫度、時間、料液比及超聲波的功率等[31]。Chen等[32]采用響應面法對蜜環(huán)菌多糖的超聲提取進行了優(yōu)化，最佳條件下：超聲功率915 W，溫度69.27℃，時間39.13 min，粗多糖(AMPs)產(chǎn)率19.5%。郭慧靜[33]在提取蒲公英多糖時研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的熱水提取法進行對比，超聲法既可節(jié)省時間，又能降低溫度，同時多糖得率也相對較高，提取率為14.27%。但是由于超聲波的強穿透力，對多糖的結(jié)構(gòu)也有一定的影響，如Lin等[34]超聲輔助提取對酸棗種子多糖時發(fā)現(xiàn)，與水提法相比超聲輔助提取酸棗種子多糖在化學結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出明顯的差異，包括形態(tài)特征、旋光性、單糖組成、分子分布。而且Chen等[35]的研究也表明，超聲輔助提取對金針菇多糖性質(zhì)有一定的影響，如產(chǎn)量、蛋白質(zhì)含量和醛酸含量均較高，但多酚含量較低，表面微觀結(jié)構(gòu)有所改變，三螺旋結(jié)構(gòu)遭到破壞，低分子的比例增加。這些可能都是超聲波功率過大造成的，在破碎細胞壁時對多糖結(jié)構(gòu)也造成了破壞，所以對超聲輔助提取多糖工藝有待優(yōu)化。

1.6 微波輔助提取

微波提取法是利用溶劑從組織中提取多糖時在微波反應器中進行[26]。微波可以引起離子的分子運動和極點的旋轉(zhuǎn)[36]。與傳統(tǒng)的加熱方法相比，微波熱具有快速加熱速率、同步精確電子控制和清潔加熱，在具體應用中效率更高，更適合廣泛推廣和普及[37-38]。但是微波對水的穿透深度僅為2～3 cm，不適于工業(yè)化生產(chǎn)。微波法的主要問題是在加工的過程中局部會產(chǎn)生大量的熱量，而對熱敏感的植物，局部的高溫不利于有效成分的提取[39]。Abdullah等[40]利用微波法提取廢果仁多糖達到了理想的最佳條件：微波功率為515 W，pH 3.2，時間為3.1 min，料液比為1:15(g/mL)時提取多糖的最大得率為(4.71±0.02)%。Li等[41]微波輔助提取石斛多糖，提高了多糖的提取效率和提取率。

1.7 多種技術(shù)聯(lián)合使用

單一技術(shù)對于提取多糖都有一定的弊端，相比水提法耗時久，提取率低，而多種技術(shù)的聯(lián)合使用剛好可以避免這些不利因素。如超聲輔助酶提取、微波輔助酶提取及微波超聲聯(lián)合提取等。Wu等[42]利用超聲-酶提法提取南瓜多糖的工藝為：超聲功率為440 W；提取溫度為51.5℃；pH 5.0；液料比5.70 mL/g；提取時間為20 min。多糖產(chǎn)率為4.33±0.15%，這是由于酶分解了植物的細胞壁，是多糖更容易流出，大大縮短了提取時間，提高了工作效率。Abuduwaili等[43]用纖維素酶-超聲波法提取的伊貝母多糖具有最高的提取率(20.65±0.78)%，包括碳水化合物(56.16±0.38)%和醛糖酸(28.34±0.23)%，具有較好的溶解度和持油能力。所以合理地選取技術(shù)聯(lián)合，可提高工作效率。

2 植物多糖的活性研究

2.1 植物多糖抗氧化活性

許多研究表明，多糖具有很強的抗氧化活性，可以作為新型的、潛在的抗氧化劑[44]。研究發(fā)現(xiàn)，毛竹葉片水溶性多糖以劑量依賴性方式表現(xiàn)出相對較高的活性，當濃度為4.0 mg/mL時，具有最高的85.9% DPPH自由基清除率[45]。Wang[46]證明在所研究的濃度范圍內(nèi)，茯苓多糖濃度與清除羥基自由基活性之間呈正相關(guān)。Su等[47]研究的4種木耳多糖中APP對羥自由基的清除能力明顯高于其他多糖。研究表明馬黛茶對羥自由基清除活性的IC50值為3.36±0.31 mg/mL[48]。超氧自由基(·O2-)是最重要的劇毒自由基之一。該自由基是由大量的生物和光化學反應產(chǎn)生的[49]。Chen[12]證明了硫酸鹽和磷酸的引入可以增強南瓜多糖的抗氧化活性，經(jīng)過化學修飾后的苦瓜多糖，對(·O2-)的清除能力增強，這可能與多糖的水溶性和電負性有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，當歸多糖能提高血清中總超氧化物歧化酶(TSOD)、谷胱甘肽過氧還原酶(GR)的活性，降低使丙二醛(MDA)的含量[50]。Preethi和 Mary Saral評估了從杜氏豌豆果實中分離的3種多糖餾分（PDP-1，PDP-2和PDP-3）的磷鉬還原活性(PMRA)時發(fā)現(xiàn)以10 mg/mL的3個餾分具有將鉬(VI)定量還原為鉬(V)(68%～75%)的巨大潛力[51]。

2.2 植物多糖抗腫瘤活性

許多多糖的體外的抗腫瘤實驗已經(jīng)證實多糖具有抗腫瘤的活性。而且相較于腫瘤臨床治療的化療，植物多糖的毒副作用要小很多，如黃楊多糖，顯示出比5-氟尿嘧啶更好的抗癌活性。植物多糖主要通過誘導細胞凋亡作用于惡性細胞，它們通過DNA損傷、細胞周期阻滯、線粒體膜破壞和一氧化氮的產(chǎn)生來殺死癌細胞，防止轉(zhuǎn)移[52]。正如胡盼盼等[53]的研究，乳酸菌胞外多糖可通過影響凋亡相關(guān)蛋白的表達來促進Caco-2細胞凋亡。Kan等[54]從植物病原真菌孢子菌中成功分離純化出了中性多糖WM-NP-60，發(fā)現(xiàn)該多糖以劑量依賴性的方式抑制HepG2和SGC7901細胞的增殖，具有抑瘤活性，可作為一種潛在的天然抗腫瘤藥物。何俊平等[55]提取的板栗種仁多糖對人肝癌細胞HepG2的增殖具有顯著的抑制作用。Niu等[56]提取的白芨多糖組分雖然對CT26結(jié)腸癌細胞的增殖率沒有影響，但它通過刺激帶瘤小鼠脾臟CD4+T細胞的增殖而顯著抑制腫瘤移植瘤的生長?？偠灾?，白芨多糖是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑，可考慮用于抗腫瘤治療。

2.3 植物多糖抗疲勞活性

研究常用游泳參數(shù)、生化指標[血乳酸(BLA)、乳酸脫氫酶(LDH)、肝糖原(LG)和血尿素氮(BUN)]等指標來評價抗疲勞活性[57]。運動耐力是反映機體抗疲勞能力的一個直接指標。Tan等[58]利用小鼠游泳至疲憊的時間長短表明疲勞程度，中劑量組和大劑量組熟地黃多糖的疲憊游泳時間比例分別明顯增加31.48%(P＜0.05)和61.51%(P＜0.01)。乳酸會傷害某些器官并產(chǎn)生疲勞[59]。Zhu等[60]研究發(fā)現(xiàn)螺旋藻多糖的抗疲勞機制可能與血紅蛋白水平的升高有關(guān)，而且200 mg/kg的螺旋藻多糖劑量下降低血液中的乳酸，肌酐激酶和尿素氮水平效果最明顯。劉興龍等[61]在研究黑參多糖抗疲勞機制中發(fā)現(xiàn)，黑參多糖顯著提高肝臟中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活力和肝糖原含量(P＜0.05)，以此發(fā)揮抗疲勞的作用。

2.4 植物多糖免疫活性

免疫調(diào)節(jié)活性研究表明，多糖通過宿主免疫系統(tǒng)間接發(fā)揮各種生物活性，而不是直接發(fā)揮細胞毒性作用，是通過刺激因子激活適應性免疫系統(tǒng)來改善宿主免疫功能的一種行動。Sun等[62]研究發(fā)酵與未發(fā)酵的玉屏風多糖時發(fā)現(xiàn)，兩種玉屏風多糖均能改善腸道菌群平衡，并保持了腸屏障的完整性和功能性。提取的白術(shù)根莖多糖有增加動物機體免疫器官胸腺重量的作用[63]。李榮喬等[64]研究表明，槐花多糖能顯著提高抑制小鼠的脾淋巴細胞的增殖的能力。任琦琦等[65]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌胞外多糖能夠促進BALB/c小鼠骨髓來源樹突細胞的成熟，誘導骨髓來源樹突細胞分泌與輔助性T17細胞分化和增殖相關(guān)的細胞因子IL-6、TGF-β和IL-23，并且可以增強骨髓來源樹突細胞的抗原提呈能力。李婉雁等[66]研究白術(shù)多糖對雛雞脾臟淋巴細胞免疫功能的影響時發(fā)現(xiàn)，白術(shù)多糖可活化TLR4/NF-κB信號通路，促進相關(guān)基因表達，最終使NF-KB進入細胞核調(diào)控細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平，進而調(diào)控雛雞脾臟淋巴細胞免疫功能。Li等[67]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)γ射線照射的黃芪多糖處理均提高了注射環(huán)磷酰胺的十二指腸產(chǎn)生IgA的細胞數(shù)量以及白細胞介素-2(IL-2)，白細胞介素-10(IL-10)和干擾素γ的空腸mRNA表達。

2.5 植物多糖其他活性

植物多糖的生物活性很多，除上述功能外，還有許多其他如抗過敏、抗糖尿病、抑制肥胖、抑制腺體增生、降血脂、利尿等活性功能[68-71]。如研究表明[72]，在糖尿病前期長期口服低劑量酵母β-葡聚糖可抑制胰島素樣炎，并顯著延遲非肥胖糖尿病(NOD)小鼠中T1D的出現(xiàn)。Sun[10]從食用綠藻草中提取了4種純化多糖(CLGP1、CLGP2、CLGP3和CLGP4)，研究發(fā)現(xiàn)CLGP4對LPS誘導的HT29細胞具有更有效的抑制作用。Zhou[73]獲得的酸性蘆葦多糖可以保護RAW246.7巨噬細胞免受脂多糖(LPS)誘導的細胞毒性作用。

3 不同提取方法對多糖的提取率及活性的影響

植物的種類眾多，不同種類植物提取的多糖不管在提取率上，還是結(jié)構(gòu)功能上都存在著巨大差異[74-75]。盡管是同一種植物，不同的提取方法，多糖的種類和功能也不盡相同[76-77]。Wu[78]用不同方法提取連翹多糖時，發(fā)現(xiàn)其多糖的產(chǎn)率、平均分子量、醛酸含量、單糖比例和抗氧化活性都有差異。

3.1 不同提取方法對多糖提取率的影響

同種的植物，不同提取方法或不同提取工藝，多糖的提取率都有差別。如下表1所示。由表可知，同樣的方法并不適用于所有的植物，不同植物的結(jié)構(gòu)、屬性、物質(zhì)組分都有所差別，所以，不同植物多糖的提取需要研究優(yōu)化具體的提取方法。不同提取方法多糖的提取率如下表1所示。

表1 不同提取方法多糖的提取率

3.2 不同提取方法對生物活性的影響

不同方法提取的多糖在生物活性上有所差異，主要由于不同的提取方法所得多糖的結(jié)構(gòu)和單糖組分有所不同。徐叢玥等[95]研究發(fā)現(xiàn)，多糖的抗氧化活性與粗多糖的提取方法有關(guān)。高晗[96]在做水提和堿提黃秋葵多糖研究發(fā)現(xiàn)，相比較于水提多糖，堿提多糖對腸道菌群影響更顯著，更能促進腸道健康，相較于水提多糖可能堿提多糖黏度較小、組成結(jié)構(gòu)較簡單，在腸道中能得到有效降解。劉佳樂等[97]利用熱水浸提法、超聲冰浴提取法以及酶解提取法提取的棗多糖，均對RAW264.7巨噬細胞有一定的毒性，但熱水浸提法提取的多糖免疫活性最強。Chen等[98]研究發(fā)現(xiàn)，在體外降血糖活性和抗氧化活性實驗表明，用堿性溶液提取生姜多糖的生物學能力高于用其他方法提取的多糖，這可能與它們有關(guān)的醛酸含量有關(guān)。Xia等[99]從香柏中分離出水溶性酸性多糖XB-PS3。分子量為86.04 kDa，表現(xiàn)出明顯的反補償活性。此外，甲基化的XB-PS3-R活性弱于XB-PS3-2，表明半乳糖醛酸比阿拉伯糖的分支起著更重要的作用。不同提取方法對生物活性的影響如下表2所示。

表2 不同提取方法對生物活性的影響

4 展望

植物多糖作為一種毒副作用小、來源廣和成本低廉的天然活性物質(zhì)具有其獨特的優(yōu)勢。研究表明[73]，許多天然化合物具有新穎的化學結(jié)構(gòu)和獨特的生物活性治療炎癥性疾病。不光在醫(yī)藥領(lǐng)域可以作為一種抗腫瘤和抗氧化的藥物，在食品保健方面還可以提高自身免疫力，延緩衰老，所以多糖作為營養(yǎng)保健品開發(fā)利用前景廣闊。目前，對于植物多糖研究領(lǐng)域依然存有一些問題有待解決。

（1）較蛋白質(zhì)和核酸這兩個領(lǐng)域的探索和發(fā)展，對植物多糖研究的層次與水平就顯得不夠成熟，這主要是由于多糖本身在質(zhì)量標準、表征鑒定等方面存在自身的研究難度和特殊性，這些問題有待解決。

（2）多糖結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、體內(nèi)代謝過程和作用機制還未闡明，還需要進一步的研究來闡明所涉及的結(jié)構(gòu)特征、結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系和生物活性。

（3）在提取的過程中，不同的提取工藝對多糖的結(jié)構(gòu)、組成和生理活性等方面都有不同的影響，因此優(yōu)化植物多糖的提取方法還有待進一步研究。在植物多糖的提取方法中，微波法和超聲波法屬于新型的提取技術(shù)，比傳統(tǒng)的提取技術(shù)得率高，是以后提取技術(shù)應該發(fā)展的方向。

（4）多糖還具有一定的吸附性，那么多糖能否作為一種新的資源應用于環(huán)境治理領(lǐng)域，這一領(lǐng)域有待進一步探索。這也側(cè)面說明，多糖的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和多領(lǐng)域應用具有很大的發(fā)展空間。