關(guān)思靜，高 靜，徐蓉蓉，葛甜甜，王 楠，顏永剛，張 崗，陳 瑩，劉阿萍，程萌格

（1陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開發(fā)工程技術(shù)研究中心，陜西西安 712046；2陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西咸陽 712083）

0 引言

生長素(auxin)是現(xiàn)已報(bào)道發(fā)現(xiàn)最早、研究最深入的植物激素，在胚胎發(fā)生、頂端優(yōu)勢、維管伸長、開花、果實(shí)發(fā)育和側(cè)根發(fā)生等多個(gè)生長發(fā)育過程中起著中心作用。分子水平分析發(fā)現(xiàn)，生長素通過一定的基因控制和應(yīng)答機(jī)制實(shí)現(xiàn)對植物生長調(diào)控作用，早期的應(yīng)答基因主要包括Aux/IAA家族、GH3家族和受生長素調(diào)控的RNA家族[1]。生長素反應(yīng)因子(ARFs)，作為植物生長中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其主要功能為在上游區(qū)獲取生長素信號后，尋找位于下游區(qū)的生長素響應(yīng)基因的啟動(dòng)子序列，與其中的生長元素響應(yīng)元件相結(jié)合，激活或抑制生長素應(yīng)答基因的表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對植物生長發(fā)育的控制[2]。研究表明，絕大多數(shù)ARF蛋白具有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)區(qū)域，N端為植物特有的B3型DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域保守性極強(qiáng)，能直接與生長素響應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)域的生長素應(yīng)答元件(AuxRE)結(jié)合；中央ARF功能域，其氨基酸組成決定了ARF蛋白是否起激活或抑制作用；以及C端Aux/IAA結(jié)構(gòu)域，具有決定ARF蛋白間的同源聚集或ARF蛋白與生長素應(yīng)答基因間的異源聚集功能，并用于確定ARF的聚集狀態(tài)[3]。

目前，模式植物擬南芥基因組中共23個(gè)ARF轉(zhuǎn)錄因子被鑒定[4]，其中部分成員的功能已得到驗(yàn)證。分析結(jié)果表明，AtARF1與AtARF2具有一些共同的功能，可能正向調(diào)控植物葉片衰老的發(fā)生以及花器官的脫落[5-6]；Kelley等[7]研究發(fā)現(xiàn)AtARF3與KANADI蛋白質(zhì)發(fā)生物理相互作用，形成蛋白復(fù)合物，構(gòu)成生長素依賴性調(diào)節(jié)模塊的一部分，是擬南芥中被膜發(fā)育和葉極性建成所必需的功能復(fù)合物；AtARF2-4和AtARF5之間有重疊和非冗余的功能，并且對擬南芥雌雄配子體的發(fā)育至關(guān)重要[8]；擬南芥生長素轉(zhuǎn)錄因子AtARF6、AtARF8和AtARF17在調(diào)節(jié)雌蕊和雄蕊的發(fā)育，果實(shí)發(fā)育、受精，花藥發(fā)育和花粉形成中起到重要作用[9-11]；AtARF7/AtARF19、AtARF11、AtARF10與AtARF16等轉(zhuǎn)錄因子則直接或間接介導(dǎo)了擬南芥?zhèn)雀男纬蒣12-15]。

烏拉爾甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)是豆科甘草屬植物，其根莖是極為重要的常用中藥材。目前甘草的全基因組測序已經(jīng)完成，這為研究相關(guān)基因的功能提供了基礎(chǔ)[16]。本研究利用生物信息學(xué)手段對甘草ARF基因家族進(jìn)行分析鑒定，對其編碼蛋白的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域及保守基序、基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行了預(yù)測和分析，并利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)研究了不同脅迫條件下的基因表達(dá)模式，旨在為深入研究甘草抗逆機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

實(shí)驗(yàn)于2019年10—12月在陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心組織培養(yǎng)室進(jìn)行。甘草種子消毒滅菌后，在恒溫氣候箱中催芽1周，挑選長勢一致的幼苗移至霍格蘭營養(yǎng)液中，放置在培養(yǎng)室水培1月。分別采用15 g/L聚乙二醇(PEG-6000)、150 mmol/L氯化鈉(NaCl)、10 μmol/L磷酸二氫鉀進(jìn)行干旱、高鹽以及低磷脅迫處理。對照(CK)用營養(yǎng)液培養(yǎng)。在脅迫處理1周后采集甘草幼苗莖葉和根，每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，委托杭州景杰生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。上述處理的甘草種子和幼苗在氣候箱與培養(yǎng)室中的培養(yǎng)條件溫度為(25±2)℃，濕度為60%～70%，光周期為12 h光/12 h暗。

1.2 方法

1.2.1 甘草ARF基因的鑒定及序列分析 模式植物擬南芥的ARF序列下載自http://www.UniProt.org/，甘草的全基因組序列數(shù)據(jù)獲取自http://ngs-data-archive.psc.riken.jp/Gur-genome/。以擬南芥23個(gè)ARF家族成員的蛋白序列作為查詢序列，運(yùn)行TBtools工具的本地檢索程序，篩選閾值設(shè)為1×10-5，初步獲得候選序列。將候選ARF蛋白序列提交到NCBI，進(jìn)行在線blastp比對。去除重復(fù)序列后，利用在線網(wǎng)站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和 Pfam（https://pfam.xfam.org/）對篩選的甘草ARF蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證，并刪除不含ARF蛋白特征結(jié)構(gòu)域的基因。最后利用ExPASY-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對甘草ARF蛋白序列進(jìn)行氨基酸數(shù)目、分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)預(yù)測，同時(shí)借助Cell-PLoc2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.2.2 甘草ARF基因的結(jié)構(gòu)分析 從甘草全基因組序列信息中檢索出甘草ARF基因外顯子-內(nèi)含子位置信息，利用在線網(wǎng)站GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析甘草ARF基因完整序列得到外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。

1.2.3 甘草ARF家族保守基序分析 利用MEME 5.1.1在線工具(http://meme-suite.org/tools/meme)分析甘草ARF蛋白的保守基序，最大基序檢索數(shù)值設(shè)為10，最適基序長度為6～200個(gè)氨基酸。

1.2.4 甘草ARF啟動(dòng)子順式作用元件分析 提取甘草ARF基因上游2 kb的序列信息，使用在線工具PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測基因順式作用元件。

1.2.5 甘草ARF系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用多重序列比對軟件MAFFT 7.0對甘草、擬南芥ARF蛋白進(jìn)行序列比對計(jì)算，比對結(jié)果進(jìn)一步通過MEGA 7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中校驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為1000，其余均為默認(rèn)參數(shù)。

1.2.6 甘草ARF基因的表達(dá)模式分析 利用轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析甘草ARF基因的表達(dá)特征。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)包含對照、甘草干旱、高鹽以及低磷脅迫處理的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，以不同實(shí)驗(yàn)條件下的RPKM值為表達(dá)水平，通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，利用TBtools的HeatMap程序做熱圖分析[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草ARF基因家族的鑒定

利用本地blast比對檢索與在線blastp比對，得到初步候選序列，并進(jìn)一步利用Pfam和SMART進(jìn)行結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證，去除不含有ARF保守結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域不完整的序列，最終鑒定出10個(gè)甘草ARF基因序列，將它們命名為GuARF1～GuARF10（表1）。其中除GuARF8和GuARF10含有B3、Auxin_resp和Aux/IAA結(jié)構(gòu)域外，其余8個(gè)GuARF蛋白只含有B3和Auxin_resp結(jié)構(gòu)域（圖1）。分析甘草10個(gè)ARF蛋白序列，發(fā)現(xiàn)編碼ARF蛋白的氨基酸長度在301～945 aa之間，分子量范圍為33.07～104.37 kDa，等電點(diǎn)范圍為5.93～8.50，其中6個(gè)GuARF等電點(diǎn)小于7，4個(gè)GuARF等電點(diǎn)大于7，且平均等電點(diǎn)小于7，表明GuARF為弱酸性，推測可能在酸性亞細(xì)胞環(huán)境中發(fā)揮作用。不穩(wěn)定系數(shù)分析結(jié)果表明10個(gè)GuARF的不穩(wěn)定指數(shù)均大于40，為不穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測表明所有的GuARF均定位在細(xì)胞核（表1）。

表1 甘草ARF基因家族信息

圖1 GuARF基因家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域

2.2 甘草ARF基因的結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了進(jìn)一步了解甘草ARF基因的特征，使用在線工具GSDS2.0對甘草ARF基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析（圖2），結(jié)果表明ARF基因家族大多數(shù)成員的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，含有外顯子數(shù)量6個(gè)(GuARF2、GuARF4、GuARF5)到22個(gè)(GuARF22)不等。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，位于同一亞家族的GuARF基因具有相似的外顯子-內(nèi)含子分布模式（圖2）。

圖2 GuARF基因家族內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)

利用MEME在線數(shù)據(jù)庫對甘草ARF蛋白進(jìn)行保守基序分析，共得到10個(gè)保守基序（圖3）。10個(gè)GuARF蛋白中均含有motif 4、motif 5和motif 7，除此之外，8個(gè)GuARF蛋白含有motif 1和motif 2，7個(gè)GuARF蛋白含有motif 8，4個(gè)GuARF蛋白含有motif 3、motif 9和motif 10，3個(gè)GuARF蛋白含有motif 6。其中GuARF3、GuARF4和GuARF5含有8個(gè)基序，GuARF1、GuARF2、GuARF6、GuARF7、GuARF8、GuARF9含有7個(gè)基序，GuARF10只含有4個(gè)基序。結(jié)果表明，出現(xiàn)頻率較高的motif為GuARF蛋白結(jié)構(gòu)域中非常重要的保守基序。

圖3 GuARF蛋白保守基序分析

2.3 甘草ARF基因順式作用元件預(yù)測

提取甘草ARF基因上游2 kb的序列進(jìn)行順式作用元件分析，結(jié)果如圖4所示，甘草ARF基因上游存在5類順式作用元件：①光響應(yīng)類相關(guān)元件，如G-box元件、Box4元件等；②植物激素響應(yīng)相關(guān)元件，如響應(yīng)脫落酸代謝的ABRE元件、響應(yīng)生長素代謝的TGA-element等；③逆境脅迫響應(yīng)類元件，如干旱脅迫響應(yīng)元件MBS、低溫脅迫響應(yīng)元件LTR等；④植物生長發(fā)育響應(yīng)元件，如調(diào)節(jié)柵欄葉肉細(xì)胞分化的HD-Zip 1元件、分生組織表達(dá)相關(guān)的CTA-box等；⑤次級代謝產(chǎn)物合成類響應(yīng)元件，類黃酮生物合成基因調(diào)控元件MBSI；其中逆境脅迫響應(yīng)類元件占比20%。并在GuARF1和GuARF5的啟動(dòng)子區(qū)域檢測到3個(gè)生長素響應(yīng)原件(TGA-element)。

圖4 GuARF基因順式作用元件分析

2.4 甘草ARF系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了進(jìn)一步了解甘草ARF基因家族成員的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建了甘草、擬南芥基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）。系統(tǒng)發(fā)育分析表明甘草和擬南芥共33個(gè)ARF蛋白可以分為I、II、III三個(gè)家族，其中I家族可以進(jìn)一步分為Ia和Ib兩個(gè)亞家族。GuARF7和GuARF10屬于Class Ia；Class Ib僅為擬南芥 ARF 蛋白；GuARF1、GuARF6、GuARF8和GuARF9屬于Class II；GuARF2、GuARF3、GuARF4、GuARF5屬于Class III。其中ARF蛋白的編碼基因在Class Ia、Class II和Class III各自包含一個(gè)自展值為99的直系同源基因?qū)?GuARF9/AtARF4、GuARF2/AtARF17、GuARF7/AtARF1)；此外，從圖5中可以看出在Class II和Class III中甘草還含有兩個(gè)旁系同源基因?qū)?GuARF1/GuARF6、GuARF3/GuARF5)。

圖5 甘草和擬南芥ARF蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5 甘草ARF基因家族的表達(dá)分析

利用甘草在干旱、高鹽和低磷脅迫的RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，得到10個(gè)GuARF基因?qū)?yīng)轉(zhuǎn)錄本的RPKM值，做對數(shù)值轉(zhuǎn)換，利用TBtools的HeatMap程序生成熱圖（圖6）。結(jié)果顯示，對照處理中GuARF5與GuARF6在莖葉中大量表達(dá)，而在根中表達(dá)量很低；GuARF2、GuARF3、GuARF8、GuARF9在根中均有表達(dá)，且GuARF9的表達(dá)量很高，而在莖葉中均未見表達(dá)或表達(dá)量很低，其余GuARF基因在所檢測的組織中表達(dá)量很低或未檢測到。

莖葉和根中的GuARF在不同逆境脅迫下的表達(dá)呈現(xiàn)差異性。如圖6-A所示，莖葉中的GuARF基因其表達(dá)模式可以分為3類，第1類包含3個(gè)GuARF基因(GuARF2、GuARF1、GuARF10)，在低磷脅迫下大量表達(dá)，在對照和其他脅迫處理下表達(dá)量低或未見表達(dá)；第2類包含2個(gè)GuARF基因(GuARF5、GuARF6)，僅在對照中具有較高的表達(dá)量；剩下5個(gè)GuARF基因在干旱脅迫或鹽脅迫處理下表達(dá)量明顯上調(diào)，其中GuARF9在干旱脅迫處理中大量表達(dá)，GuARF4在鹽脅迫處理中大量表達(dá)，GuARF7、GuARF8、GuARF3在干旱和鹽脅迫處理中均上調(diào)表達(dá)。

脅迫處理下GuARF基因在根中的表達(dá)模式可以分為兩類（圖6-B），每一類都包含5個(gè)GuARF基因，第1類中，除GuARF9在鹽脅迫處理下表達(dá)量沒有明顯變化，其余基因在對照和鹽脅迫處理中均上調(diào)表達(dá)，而在干旱脅迫和低磷脅迫處理中表達(dá)量很低或下調(diào)。第2類中5個(gè)GuARF基因在鹽脅迫中表達(dá)量均上調(diào)，除GuARF6在干旱脅迫中上調(diào)表達(dá)，其余基因在對照、低磷和干旱脅迫處理中表達(dá)量很低或下調(diào)。

圖6 非生物脅迫下GuARF基因在甘草莖葉(A)和根(B)中的表達(dá)

3 討論與結(jié)論

近年來，隨著生物信息技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來越多的植物全基因組測序完成。本研究基于甘草全基因組序列數(shù)據(jù)，最終鑒定出10個(gè)ARF基因，比已鑒定出的擬南芥(23個(gè))、水稻(25個(gè))、番茄(22個(gè))和紫苜蓿(24個(gè))的ARF基因家族成員數(shù)目少[4,17-19]。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明10個(gè)ARF蛋白均含有保守的B3結(jié)構(gòu)域和Auxin_resp結(jié)構(gòu)域，GuARF8和GuARF10含有Aux/IAA結(jié)構(gòu)域。為了進(jìn)一步研究甘草與擬南芥的ARF同源進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示Class Ib均為擬南芥ARF蛋白，這與其他植物番茄[18]、谷子[20]、鷹嘴豆[21]中的Ib家族類似，這些成員包含擬南芥ARF假基因(ARF13)和7個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因（AtARF12-AtARF15和AtARF20-AtARF22）[22]。除Ib家族外，大多數(shù)甘草ARF蛋白和其他植物一樣，與擬南芥ARF蛋白存在對應(yīng)關(guān)系，表明這些蛋白可能與擬南芥ARF蛋白具有相似的功能。此外，甘草ARF基因家族中還含有旁系同源基因，推測在該基因家族進(jìn)化過程中，可能出現(xiàn)了基因復(fù)制事件。

ARF基因具有較高的保守性，具有相同或相似功能的基因可能聚為一類，為預(yù)測該基因家族的功能提供了參考。作為模式植物的擬南芥，目前在基因研究方面研究較為深入，通過基因序列比對與聚類分析，推測與擬南芥ARF基因高度同源、處于較近分支的甘草ARF基因其功能與擬南芥中發(fā)揮的作用類似。根據(jù)AtARF4的功能推測其同源基因GuARF9在器官發(fā)育和營養(yǎng)生長中發(fā)揮重要作用[23]；GuARF2(AtARF17)可能在miR160的調(diào)控下表達(dá)，在花藥發(fā)育和花粉形成過程中的功能至關(guān)重要[11]；而Class III中與AtARF10和AtARF16處于較近分支的GuARF3和GuARF4，可能共同調(diào)控側(cè)根的形成[15]。對甘草ARF基因在不同組織的表達(dá)分析中發(fā)現(xiàn)，7個(gè)GuARF基因在莖葉中或根中均有表達(dá)，但存在明顯的差異，表現(xiàn)出組織表達(dá)特異性，這可能與基因功能具有一定的聯(lián)系。在甘草幼苗的正常發(fā)育過程中，GuARF1、GuARF4與GuARF7在莖葉與根的生長發(fā)育過程中幾乎沒有表達(dá)，推測這些基因可能在甘草的某個(gè)特定發(fā)育時(shí)期或組織中發(fā)揮作用。而Class III中的基因在莖葉與根中都有一定的表達(dá)（除GuARF4）。甘草ARF基因在不同組織和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異以及功能有待進(jìn)一步的研究與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

生長素還參與植物對生物和非生物脅迫的反應(yīng)[24]。為了進(jìn)一步了解甘草ARF基因家族在非生物脅迫下的反應(yīng)，分析了候選的10個(gè)甘草ARF基因在不同脅迫處理下的相對表達(dá)量（圖6）。結(jié)果表明，在高鹽脅迫下，莖葉和根中的ARF基因都具有明顯的變化，尤以Class III中ARF基因表現(xiàn)敏感。低磷脅迫下莖葉中的GuARF1、GuARF2、GuARF10上調(diào)表達(dá)明顯，推測這些基因可能在甘草低磷脅迫下具有正向協(xié)同作用。干旱脅迫處理下，GuARF的基因表達(dá)量差異較大，莖葉中的GuARF9、GuARF7、GuARF3上調(diào)表達(dá)明顯，而根中除GuARF6表達(dá)量較高其余均明顯下調(diào)表達(dá)。在擬南芥干旱響應(yīng)基因的鑒定中，一些編碼生長素反應(yīng)蛋白的基因被鑒定為干旱下調(diào)基因，這表明生長素可能對干旱脅迫信號產(chǎn)生負(fù)調(diào)控[25]。另一方面，也有研究結(jié)果表明，干旱和高鹽度脅迫均誘導(dǎo)了編碼生長素響應(yīng)蛋白的基因上調(diào)表達(dá)[26]；例如有研究發(fā)現(xiàn)，生長素應(yīng)答基因(IAA18)在干旱脅迫下被誘導(dǎo)上調(diào)[27-28]。因此，植物ARF的時(shí)空表達(dá)模式較為復(fù)雜，且存在物種表達(dá)特異性[1]。

本研究從甘草基因組鑒定出10個(gè)ARF基因，可分為3大家族，并綜合分析了甘草ARF基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、保守基序、外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和非生物脅迫下的表達(dá)譜。結(jié)果表明GuARF基因在非生物脅迫下呈現(xiàn)復(fù)雜多樣的表達(dá)模式，相對于干旱和低磷脅迫，高鹽脅迫下的甘草ARF基因表現(xiàn)更為敏感。雖然利用生物信息學(xué)方法對甘草ARF基因家族做了較為系統(tǒng)的分析，但由于分析手段本身存在不同設(shè)置參數(shù)的影響，且缺乏實(shí)驗(yàn)部分的驗(yàn)證，其響應(yīng)高鹽、低磷與干旱脅迫的分子機(jī)制還需要深入的探討。