謝小婉，朱馬別克·胡斯曼，加那爾·努和買提，木哈里·吾汗，王志斌

（達坂城區(qū)柴窩堡片區(qū)管理委員會獸醫(yī)站，新疆 烏魯木齊 830052）

牛環(huán)形泰勒蟲病是環(huán)形泰勒蟲引起的一種蜱傳血液原蟲病。該病在南歐、中亞和中東等地區(qū)均有不同程度的流行。我國在西北、東北、華北地區(qū)均對該病的流行情況進行過調(diào)查[1-2]，結(jié)果顯示，吐魯番為該病最為嚴(yán)重的疫區(qū)之一。雖然每年都會定期針對該病進行疫苗接種，但該病的感染率和發(fā)病率仍呈上升趨勢，其中吐魯番市發(fā)病率高達40%[3]，嚴(yán)重阻礙養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。該病的主要傳播媒介是璃眼蜱屬的璃眼蜱[4]。調(diào)查顯示，媒介蜱的區(qū)系分布、病原攜帶率和遺傳多樣性是蜱傳疾病的主要影響因素。因此，掌握璃眼蜱的區(qū)系分布、群落結(jié)構(gòu)和物種組成，對媒介蜱的防控以及蜱傳疾病的防控具有參考意義。本試驗通過體視顯微鏡對8個試驗點所采集的璃眼蜱（N=9 141）進行分子生物學(xué)鑒定，分析區(qū)系分布特點、種類組成及相對優(yōu)勢度，明確璃眼蜱種群分布和活動范圍的變化，對該地區(qū)媒介璃眼蜱及蜱傳牛環(huán)形泰勒蟲病的流行和流行區(qū)的變化提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2016～2017年是蜱類活動的高峰期。在吐魯番和阿勒泰地區(qū)的8 個試驗點，隨機抽取56 頭牛以及璃眼蜱9 141 枚。按照文獻記載采集牛體表的全部硬蜱[5-6]，記錄采集時間、地點等[7]。

1.2 試劑與儀器

ITS2璃眼蜱引物（由上海生工生物工程有限公司合成）；樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒和快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；高純度質(zhì)粒小提取試劑盒分別購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA的提取

璃眼蜱屬特異性引物[8]序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

50 μL 反應(yīng)體系：2×EcoTaq PCR SuperMix25 μL，10 μmol/L 的上游引物、下游引物各1 μL，璃眼蜱DNA 3 μL，雙蒸水加至50 μL。

PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查、PCR擴增得到結(jié)果。目的片段純化、克隆，對所獲得的菌液進行PCR驗證，將菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行同源性分析。

1.3.2 璃眼蜱群落組成參數(shù)的計算[9-16]

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測結(jié)果

2.1.1 媒介蜱分子生物學(xué)鑒定結(jié)果（見圖1）

圖1 璃眼蜱ITS2基因序列PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR product of Hyalomma ITS2 gene

由圖1 可知，以璃眼蜱屬ITS2基因序列，采用PCR 的方法擴增璃眼蜱DNA，于490 bp擴增出目的條帶。

2.1.2 重組質(zhì)粒Peasy-T1-ITS-2的序列對比結(jié)果

測序結(jié)果經(jīng)BLAST 檢索，顯示本次實驗室獲得目的片區(qū)與GenBank 中小亞璃眼蜱、殘緣璃眼蜱、嗜駝璃眼蜱和亞洲璃眼蜱核苷酸相似性在99%～100%之間，為本研究的目的片段。經(jīng)PCR鑒定：小亞璃眼蜱3 750枚，殘緣璃眼蜱2 468枚，亞洲璃眼蜱914枚，嗜駝璃眼蜱2 009枚。

2.2 新疆部分地區(qū)璃眼蜱的群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 新疆部分地區(qū)璃眼蜱相對優(yōu)勢度、染蜱率和蜱指數(shù)（見表2）

表2 采集璃眼蜱相對優(yōu)勢度、蜱指數(shù)和染蜱率Tab.2 Relative dominance,infested indexes and infested ratesof Hyalomma

由表2可知，試驗所抽檢的8個試驗點中的56頭牛，共計采集媒介璃眼蜱9 141 枚。其中，小亞璃眼蜱相對優(yōu)勢度、染蜱率及蜱指數(shù)均為最高分別為41.02%、100%、66.96；亞洲璃眼蜱的相對優(yōu)勢度最低為10.00%；染蜱率最低的是嗜駝璃眼蜱，為30.00%；亞洲璃眼蜱蜱指數(shù)最低，為16.32。

2.2.2 新疆部分地區(qū)牛體表寄生璃眼蜱群落結(jié)構(gòu)參數(shù)（見表3）

由表3 可知，采集到牛體表的璃眼蜱的物種豐富度為4，多樣性指數(shù)為1.282 3，物種均勻度指數(shù)為0.925 0，優(yōu)勢度指數(shù)為0.299 4。

表3 寄生璃眼蜱種群、群落組成參數(shù)Tab.3 Community structure parameters of parasitic Hyalomma

2.2.3 新疆部分地區(qū)璃眼蜱的區(qū)系分布（見表4）

由表4 可知，4 種璃眼蜱中，小亞璃眼蜱蜱指數(shù)最高，為625.00，占總體的41.02%（625.00/1 523.51），亞洲璃眼蜱蜱指數(shù)最小為10.00%（152.34/1 523.51）。由采集地點來看，吐魯番市（包括夏鄉(xiāng)、吐魯番市、伊拉湖鄉(xiāng)、博斯坦鄉(xiāng)4 個地區(qū)）蜱總指數(shù)為937.67，占蜱總數(shù)指數(shù)的61.55%（937.67/1 523.51），其中夏鄉(xiāng)的蜱總指數(shù)最高，為19.84（302.34/1 523.51）；阿勒泰地區(qū)（包括富蘊縣、清河縣、哈巴河縣和福?？h四個地區(qū)）蜱總指數(shù)為502，占總數(shù)的32.95%（502.00/1 523.51），其中青河縣的蜱指數(shù)較低，占蜱總指數(shù)的 6.12%（93.17/1 523.51）。

表4 不同生境寄生媒介璃眼蜱的蜱指數(shù)Tab.4 Infested indexes of parasitic Hyalomma in different regions

2.2.4 新疆部分地區(qū)牛體表寄生璃眼蜱群落結(jié)構(gòu)參數(shù)（見表5）

由表5可知，伊拉湖鄉(xiāng)種類豐富度為2，較其他7個試驗點低；富蘊縣多樣性指數(shù)最高，為1.171 0；伊拉湖鄉(xiāng)物種均勻度指數(shù)最高，為0.966 4。清河縣多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)均最低，分別為0.5649、0.4075；但優(yōu)勢度指數(shù)最高，為0.7089。

表5 不同生境璃眼蜱的群落結(jié)構(gòu)參數(shù)數(shù)據(jù)Tab.5 Community structure parameters of parasitic Hyalomma in different regions,Xinjiang

3 討論

璃眼蜱的鑒定主要依據(jù)形態(tài)學(xué)[17-18]。分子生物學(xué)具有操作簡單、準(zhǔn)確率高、適用范圍廣等優(yōu)勢，不僅能鑒定形態(tài)較為完整的媒介蜱外，還可以精確鑒定殘缺、飽血和不成熟的媒介蜱[18]，被廣泛運用于媒介蜱的鑒定。ITS2基因因進化速率快且GenBank 數(shù)據(jù)量豐富，被用于媒介蜱屬內(nèi)、種間或種內(nèi)的系統(tǒng)進化關(guān)系研究[6,19]。文章通過ITS2基因檢測采集的9 141璃眼蜱，共鑒定出4種璃眼蜱：小亞璃眼蜱、亞洲璃眼蜱、殘緣璃眼蜱和嗜駝璃眼蜱，分別為3 750、914、2 468、2 009枚。1959年，肖成恩[20]首次報道新疆地區(qū)媒介硬蜱分類情況。1963年和1977年，于心等[5，21]詳細(xì)地記載了新疆媒介蜱的種類、形態(tài)特征、生物學(xué)特性、地理分布、攜帶病原情況以及媒介蜱的防治，均為媒介蜱及蜱傳疫病提供詳細(xì)的參考資料。但隨著全球氣候變暖，璃眼蜱的種群分布有所變化[22]。王冰潔[23]從綿羊和山羊體表獲得了寄生于牛、馬、駱駝的殘緣璃眼蜱，在馬體表采集到了僅寄生于駱駝的嗜駝璃眼蜱。朱玉濤[24]在布爾津縣、福?？h首次采集到刻點血蜱和圖蘭扇頭蜱，在富蘊縣首次采集到銀盾革蜱和森林革蜱，在碩縣首次采集到銀盾革蜱和草原革蜱。因此，研究不同生境、不同宿主體表寄生媒介蜱的種群結(jié)構(gòu)、區(qū)系分布十分必要。通過分子生物學(xué)結(jié)合統(tǒng)計學(xué)對吐魯番和阿勒泰地區(qū)牛體表媒介蜱進行鑒定，并進行群落結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，小亞璃眼蜱蜱指數(shù)、染蜱率、相對優(yōu)勢度均最高，其相對優(yōu)勢度高達41.02%，多樣性指數(shù)為1.282 3，物種均勻度指數(shù)為0.925 0，優(yōu)勢度指數(shù)為0.299 4。吐魯番市多樣性指數(shù)和物種均勻度指數(shù)均較高，但是優(yōu)勢度指數(shù)較低，優(yōu)勢度指數(shù)和多樣性指數(shù)呈反比的關(guān)系。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，吐魯番和阿勒泰地區(qū)寄生媒介璃眼蜱無差異，豐富度均為4，分析與牛的調(diào)出、調(diào)入有直接關(guān)系，要做好調(diào)出、調(diào)入牛檢疫工作，檢測牲畜時也要做好媒介蜱檢測。此外，吐魯番市氣候類型屬于大陸性暖溫帶荒漠氣候，阿勒泰地區(qū)屬于的溫帶大陸性寒冷氣候表現(xiàn)均為降水量少，蒸發(fā)量大；吐魯番坎兒井及大范圍種植葡萄樹，而阿勒泰擁有遼闊的草原；獨特的氣候條件和復(fù)雜的地貌環(huán)境和土壤結(jié)構(gòu)，為媒介璃眼蜱的滋生提供可行、適宜的生存條件。

4 結(jié)論

本試驗采集試驗點的牛體表寄生的媒介璃眼蜱與以往記載媒介蜱的分布基本相符，通過對媒介蜱體表璃眼蜱群落結(jié)構(gòu)進行分析，為該區(qū)的媒介璃眼蜱的分類及其蜱傳疾病防治提供數(shù)據(jù)參考。