夏坤杰,向 燕,陳淑琴,鄧 韻

(1.上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 兒科,上海,200082;2.上海市虹口區(qū)歐陽路街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心 全科門診,上海,200081)

黃芪常用于治療腦缺血損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，黃芪甲苷Ⅳ (As Ⅳ)是從黃芪中提取的主要活性化合物之一，已被證實(shí)能通過血腦屏障并在腦實(shí)質(zhì)中發(fā)揮作用[1]。As Ⅳ可通過抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)通路發(fā)揮抗炎作用。此外，黃芪甲苷還可通過增強(qiáng)肥胖大鼠下丘腦瘦素敏感性來改善機(jī)體代謝紊亂[2]。本研究探討黃芪甲苷改善炎癥反應(yīng)和瘦素抵抗性預(yù)防肥胖性高血壓的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源

雄性Wistar大鼠(35只,日齡21 d)購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)在恒溫室內(nèi)(22±2)℃,光照周期為12 h光照、12 h黑暗，可自由取食和飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK (京)2019-006,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK (京)2019-009。

1.2 試劑器材

As Ⅳ購自成都曼思特生物科技有限公司，試劑器材包塊α7nAChR選擇性拮抗劑α-BGT[(1 μg/(kg·d),Cat No.ab120542，Sigma)]、ALC-HTP系統(tǒng)(ALCBIO,China)、血糖儀(Freestyle,Abbott Diabetes Care,USA)、戊巴比妥(購自中國醫(yī)藥集團(tuán)，生產(chǎn)批號(hào)F20081216);Au5400自動(dòng)分析儀(奧林巴斯，日本)、血漿瘦素(Assay Biotech,Cat No.10638R)和胰島素(Crystal Chem,Cat No.90010)、Elisa試劑盒(購于北京四正柏生物科技有限公司)、Trizol試劑(美國Invitrogen公司,Cat No.15596-028)、Prime Script RT試劑盒(Takara BioInc，Lot No.RR047A)、LightCycler 480 Ⅱ RT-PCR系統(tǒng)(Roche)、BCA蛋白測定試劑盒(Beyotime,China,Cat No.P0012S)、FluorChem Q 3.4(美國ProteinSimple)。同時(shí)還購入p-STAT3(Cat No.ab76315,Abcam,1∶150 000)、p-PI3K (Cat No.ab182651,Abcam,1∶500);α7nAchR (Cat No.ab10096,Abcam,1∶500);p-IKKβ (Cat No.ab59195，Abcam，1∶1 000);NF-KB p65 (Cat No.1075-1-ap，Proteomes，1:500);TNF-α (Cat No.ab6617,Abcam,1∶150);IL-6 (Cat No.sc-1265,Santa Cruz Biotechnology,1∶500)和β-actin (Cat No.ab6276,Abcam,1∶5 000)。

1.3 分組與干預(yù)方法

正常飼養(yǎng)1周適應(yīng)當(dāng)前環(huán)境后將大鼠分為正常脂肪飼料組(NC組,n=10)和高脂肪飼料組(n=25)。正常脂肪類食物中含有蛋白質(zhì)(20.25%)、脂肪(7.25%)和碳水化合物(62%),高脂肪類食物中含有蛋白質(zhì)(22%)、脂肪(27%)和碳水化合物(41%)。高脂肪飲食16周后，體質(zhì)量比NC組高25%的則為肥胖大鼠。將18只肥胖大鼠隨機(jī)分為3組:對照組(n=6)、As Ⅳ組(n=6)和As Ⅳ+α-bungaratoxin(α-BGT)組(n=6)。As Ⅳ組和As Ⅳ+α-BGT組均給予As Ⅳ[20 mg/(kg·d)]。將As Ⅳ溶于1%的羧甲基纖維素溶液中，從第17周開始每日給予大鼠灌胃飲用，連續(xù)飲用6周[3]。同時(shí)，對照組大鼠給予1 mL羧甲基纖維素溶液。此外,As Ⅳ+α-BGT組大鼠每天腹腔注射α7nAChR選擇性拮抗劑α-BGT[1 μg/(kg·d)],連續(xù)6周，其余各組以同樣的方法分別給予等量生理鹽水[4]。

1.4 生理測量

記錄各組每周的星期三至星期五7:00—12:00的血壓、心率(HR)和體質(zhì)量。采用耦合光電傳感器測量收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)和心率。將大鼠放入ALC-HTP系統(tǒng)，置于37 ℃ delta相熱墊上擴(kuò)張尾動(dòng)脈。在使用ALC-HTP系統(tǒng)測量血壓之前，所有的大鼠均經(jīng)歷自適應(yīng)訓(xùn)練。將大鼠放入ALC-HTP系統(tǒng)后，在尾部放置尾袖光傳感器，所有大鼠3 d內(nèi)測量3次，取平均值。

1.5 收集下丘腦中下部和脂肪組織

22周后，采用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠，處死收集組織。從腹主動(dòng)脈采集血液進(jìn)行進(jìn)一步分析。血液中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)和葡萄糖水平的測定使用au5400自動(dòng)分析儀。采用開顱術(shù)將包含弓狀核和腹內(nèi)側(cè)核的中下部下丘腦[5]的腦組織取出，置于cold-Hank′s溶液中孵育3 min。收集后，將組織冷凍在液氮中，保存在-85 ℃下待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。切除附睪脂肪、腹膜后脂肪和腎周脂肪作為脂肪總重量，以體質(zhì)量與脂肪的比值計(jì)算肥胖指數(shù)。附睪脂肪保存于-85 ℃,以待進(jìn)一步檢測。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

葡萄糖耐量試驗(yàn):實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有大鼠空腹過夜，腹腔注射葡萄糖(0.5 g/kg)進(jìn)行糖耐量試驗(yàn)(GTT)。葡萄糖注射0、30、60和120 min后取尾靜脈血樣，使用血糖儀測定血糖濃度。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA):采用Elisa試劑盒檢測血漿瘦素和胰島素水平。胰島素敏感性穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估(HOMA)計(jì)算公式:HOMA=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(μU/mL)/22.5。采用相應(yīng)的Elisa試劑盒測定血漿和腎皮質(zhì)組織勻漿中去甲腎上腺素(NE)的含量以及附睪脂肪和血漿中白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的水平。

實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR):使用Trizol試劑在1 h內(nèi)提取下丘腦中下部組織樣本和附睪脂肪組織樣本的總RNA。測定RNA含量，純度按A260/A280比例測定，使用Prime Script RT試劑盒用于第一鏈互補(bǔ)DNA的逆轉(zhuǎn)錄，并按照制造商的說明進(jìn)行操作。測定下丘腦組織中細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子(SOCS3)、酪氨酸磷酸酶 (PTP1B)、瘦素受體(LepRb)、皮質(zhì)素原(POMC)和神經(jīng)肽(NPY),脂肪組織中α7煙堿乙酰膽堿受體(α7nAChR)、核因子κB激酶亞單位β(IKKβ)、核因子κB抑制劑(NF-KB)。采用LightCycler 480 Ⅱ RT-PCR系統(tǒng)(Roche)進(jìn)行RT-qPCR。所用引物如下。GAPDH-F:5′-GGAAAGCTGTGGCGTGAT-3′,GAPDH-R:5′-AAGGTGGAAGAATGGGAGTT-3′;LepRb-F:5′-GAGAGGCTGCTGAAATCGTC-3′,LepRb-R:5′-GACTCCTGAGCCATCCAGTC-3′;SOCS3-F:5′-CTTTACCACCGACGGAACCT-3′,SOCS3-R:5′-GAACTCCCGAATGGGTCCAG-3′;PTP1B-F:5′-TTTCCACTACACCACCTGGC-3′,PTP1B-R:5′-CACTGATCCTGCACTGACGA-3′;POMC-F:5′-CATAGACGTGTGGAGCTGGTG-3′,POMC-R:5′-TCAAGGGCTGTTCATCTCCG-3′;NPY-F:5′-CTGACCCTCGCTCTATCCCT-3′,NPY-R:5′-TGATGTAGTGTCGCAGAGCG-3′;7nAchR-F:5′-TCCCTCCAGGCATATTCAAG-3′,7nAchR-R:5′-CCAGTGACCACCCTCCATAG-3′;IKKβ-F:5′-GGGACCCCGAGTTTTCATGT-3′,IKKβ-R:5′-TCCTGTCGGCATTGCTTGAT-3′;NF-KB-F:5′-ACTCTTACTCGCCTCCTTCT-3′,NF-KB-R:5′-GTCTTCTTTCACCTCTGTGC-3′。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃、10 min、40個(gè)循環(huán),95 ℃、15 s、60 ℃ 1 min。GAPDH作為mRNA表達(dá)的內(nèi)參，每個(gè)樣本檢測3次，采用2-△△Ct法計(jì)算表達(dá)情況。

Western Blot:將冷凍組織在RIPA裂解緩沖液中裂解。勻漿4 ℃孵育30 min,于4 ℃、15 000 g離心15 min。采用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。將30 μg樣品在10% SDS-PAGE上進(jìn)行電泳分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(PVDF)膜上。PVDF膜與一抗孵育，再與相應(yīng)的二抗孵育。使用的抗體如下:p-STAT3、p-PI3K、α7nAchR、p-IKKβ、NF-KB p65、TNF-α、IL-6和β-actin;然后，用相應(yīng)的二抗孵育膜。使用FluorChem Q 3.4(美國ProteinSimple)分析條帶密度,β-actin作為蛋白表達(dá)的內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 As Ⅳ對肥胖大鼠體質(zhì)量和糖脂代謝水平的影響

飼養(yǎng)16周后，對照組大鼠平均體質(zhì)量高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);測量葡萄糖耐量、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、TC和TG水平以評(píng)估As Ⅳ對糖脂代謝的作用。與NC 組相比，對照組30、60、120 min血糖水平、HOMA-IR、TC、TG水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與對照組相比,As Ⅳ組干預(yù)后葡萄糖不耐受和HOMA-IR指數(shù)改善,TC和TG水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);As Ⅳ+α-BGT組干預(yù)后As Ⅳ的作用減弱，與As Ⅳ相比，在30、60和120 min時(shí)，大鼠的血糖、HOMA-IR指數(shù)、TC和TG水平提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

2.2 As Ⅳ對肥胖大鼠交感神經(jīng)傳導(dǎo)的血壓影響

連續(xù)干預(yù)6周后，對照組大鼠SBP和DBP水平升高，As Ⅳ組SBP和DBP水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);測定血漿和腎組織中NE的含量以評(píng)估周圍交感神經(jīng)的活性。與NC 組相比，對照組血漿和腎臟組織中NE的含量升高，與對照組和As Ⅳ+α-BGT組相比,NE的含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

A:連續(xù)干預(yù)6周后，各組大鼠SBP水平變化情況;B:各組大鼠DBP水平變化情況;C:連續(xù)干預(yù)6周后，各組大鼠血漿中NE的含量比較;D:各組大鼠腎組織中NE的含量比較。與NC 組比較,*P<0.05;與對照組比較,#P<0.05;與As Ⅳ+α-BGT組比較,△P<0.05。

2.3 As Ⅳ調(diào)節(jié)下丘腦瘦素信號(hào)通路和食欲相關(guān)肽基因表達(dá)

肥胖大鼠腦中樞瘦素抵抗常導(dǎo)致交感神經(jīng)興奮增加。與NC 組相比，對照組大鼠血漿瘦素水平升高,LepRb mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，瘦素信號(hào)分子p-STAT3的表達(dá)下降，而p-PI3K、SOCS3 mRNA和PTP1B mRNA的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

As Ⅳ干預(yù)后逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象，但在As Ⅳ+α-BGT組中,As Ⅳ對瘦素抵抗性的影響減弱。瘦素通過激活JAK2/STAT3通路調(diào)控食欲相關(guān)肽包括POMC和NPY的表達(dá)，與對照組和As Ⅳ+α-BGT組相比，As Ⅳ組POMC mRNA水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),NPY mRNA水平無明顯變化。見圖3。

2.4 As Ⅳ通過激活α7nAChR的表達(dá)抑制下丘腦炎癥反應(yīng)

為確定As Ⅳ干預(yù)可能挽救下丘腦瘦素信號(hào)的機(jī)制，本研究評(píng)估了As Ⅳ對與瘦素信號(hào)中斷和膽堿能抗炎通路活性相關(guān)局部炎癥的影響。結(jié)果表明，與NC 組比較，對照組α7nAChR蛋白和α7nAChR mRNA的表達(dá)水平均下降，而p-IKKβ、NF-KB蛋白及其mRNA表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);炎癥因子IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較,As Ⅳ組α7nAChR蛋白和mRNA表達(dá)升高,p-IKKβ、NF-KB蛋白及其mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與As Ⅳ組比較,α7nAChR阻斷劑α-BGT降低了As Ⅳ組α7nAChR mRNA和蛋白表達(dá)水平,IKKβ mRNA、NF-KB mRNA、p-IKKβ、NF-KB、IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

2.5 As Ⅳ通過激活脂肪組織中的α7nAChR表達(dá)來減輕炎癥反應(yīng)

As Ⅳ是否能通過激活肥胖大鼠脂肪組織中α7nAChR通路來減輕外周炎癥的檢測結(jié)果表明，與NC 組比較，對照組α7nAChR mRNA表達(dá)水平下降，而p-IKKβ、NF-KB mRNA表達(dá)升高，血漿和脂肪組織中的IL-1β和TNF-α水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組和As Ⅳ+α-BGT組比較,As Ⅳ組α7nAChR mRNA表達(dá)升高,p-IKKβ、NF-KB、IL-1β、TNF-α表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖5。

3 討 論

肥胖相關(guān)高血壓與中樞和外周炎癥密切相關(guān)，隨著肥胖的發(fā)展，外周組織中產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子可以反饋到大腦，強(qiáng)化和維持下丘腦炎癥。目前已有藥物存在依賴性，并出現(xiàn)停藥后反彈等臨床副作用。研究[6]指出，尼古丁通過抑制IKKβ/NF-KB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，并與免疫細(xì)胞中的α7煙堿乙酰膽堿受體(α7nAChR)結(jié)合，從而減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。研究[7]表明，尼古丁誘導(dǎo)α7nAChR激活可通過阻斷IKKβ/NF-KB通路顯著緩解外周炎癥，有助于改善肥胖大鼠的瘦素抵抗和代謝功能障礙。近年來，多項(xiàng)研究[8]表明，一些天然生物活性化合物如As Ⅳ、原花青素和人參皂苷Rb1是治療肥胖和肥胖相關(guān)炎癥的潛在藥物。本研究結(jié)果表明,As Ⅳ可以抑制中樞和外周炎癥反應(yīng)，改善瘦素抵抗，從而防止肥胖相關(guān)高血壓的發(fā)展，主要通過增加下丘腦和脂肪組織中α7nAChR的表達(dá)起作用。本研究發(fā)現(xiàn),As Ⅳ治療可減少大鼠體質(zhì)量，改善糖脂代謝水平，這與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的結(jié)果一致。然而，當(dāng)As Ⅳ與α7nAchR拮抗劑α-BGT同時(shí)干預(yù)時(shí)，上述作用均明顯減弱，表明As Ⅳ所表現(xiàn)出的改善作用與α7nAchR激活有關(guān)。

瘦素抵抗在肥胖、交感神經(jīng)過度興奮和肥胖相關(guān)高血壓之間起到重要的作用[10]。瘦素通常與神經(jīng)元中的受體LepR結(jié)合，激活JAK2/STAT3信號(hào)通路，通過刺激厭食神經(jīng)肽包括(POMC)的轉(zhuǎn)錄和抑制orexigenic NPY/agouti基因相關(guān)蛋白(AgRP)的轉(zhuǎn)錄來抑制食欲[11]。在肥胖患者中，過量的瘦素并不能有效調(diào)節(jié)食欲和能量消耗，但能夠?qū)桓猩窠?jīng)產(chǎn)生刺激作用，導(dǎo)致HR和血壓升高[12]。目前，盡管尚未完全了解瘦素抵抗的確切機(jī)制，但下丘腦神經(jīng)元中瘦素表達(dá)減少和細(xì)胞內(nèi)瘦素轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)中斷被認(rèn)為是瘦素抵抗的重要潛在機(jī)制。STAT3信號(hào)參與交感神經(jīng)介導(dǎo)的代謝活動(dòng)，但不影響腎臟交感神經(jīng)活動(dòng)，瘦素誘導(dǎo)的下丘腦神經(jīng)元中STAT3磷酸化水平的降低被認(rèn)為是肥胖大鼠瘦素信號(hào)衰減的主要標(biāo)志[13]。與STAT3信號(hào)通路相比，下丘腦神經(jīng)元中激活的PI3K信號(hào)通路在瘦素誘導(dǎo)的腎交感神經(jīng)活動(dòng)和血壓升高中起關(guān)鍵作用[14]。因此，肥胖患者中下丘腦神經(jīng)元中抑制的STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和升高的PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是下丘腦瘦素抵抗最重要的機(jī)制之一，常導(dǎo)致代謝障礙和交感神經(jīng)介導(dǎo)的高血壓。本研究中，肥胖大鼠血漿瘦素水平升高，下丘腦LepRb mRNA表達(dá)降低，同時(shí)，下丘腦組織中p-STAT3表達(dá)降低,p-PI3K相對升高，提示肥胖大鼠出現(xiàn)瘦素抵抗。同樣，肥胖大鼠的血壓和NE含量也明顯增加。As Ⅳ干預(yù)可明顯改善下丘腦神經(jīng)元的瘦素信號(hào)通路，上調(diào)LepRb和p-STAT3的表達(dá)，下調(diào)p-PI3K的表達(dá)，進(jìn)而改善肥胖大鼠的瘦素敏感性。

瘦素誘導(dǎo)的POMC-黑皮質(zhì)酮系統(tǒng)激活(瘦素激活JAK2/STAT3通路，促進(jìn)POMC肽的產(chǎn)生，激活黑皮質(zhì)酮受體，介導(dǎo)外周交感神經(jīng)流出)是肥胖相關(guān)高血壓的主要病理機(jī)制[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，肥胖誘導(dǎo)的高血壓大鼠的POMC mRNA表達(dá)下降，而As Ⅳ治療提高了POMC的表達(dá)，但未增高血壓。慢性肥胖導(dǎo)致外周脂肪組織和下丘腦IKKβ/NF-KB通路的激活，這是導(dǎo)致瘦素抵抗的最重要的潛在機(jī)制之一。本研究中肥胖大鼠下丘腦和脂肪組織中、NF-KB和促炎因子表達(dá)明顯增加，下丘腦中SOCS3和PTP1B同樣過表達(dá)。膽堿能抗炎通路表明,α7nAchR通過抑制中樞和外周組織IKKβ/NF-KB通路的激活而抑制炎癥反應(yīng)。因此，在中樞和外周組織中上調(diào)或激活α7nAchR可能是通過抑制炎癥反應(yīng)來阻斷瘦素抵抗的有效途徑。本研究結(jié)果證實(shí)了這一假說，高脂誘導(dǎo)的肥胖大鼠中下丘腦和脂肪組織中α7nAchR的表達(dá)降低,As Ⅳ干預(yù)能夠使α7nAchR的表達(dá)上調(diào)，抑制IKKβ/NF-KB通路的激活，通過降低SOCS3和PTP1B的表達(dá)來阻止下丘腦瘦素抵抗的發(fā)展。通過靶向α7nAchR抑制下丘腦IKKβ/NF-KB通路激活是預(yù)防肥胖相關(guān)高血壓發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵通路，也是As Ⅳ預(yù)防肥胖相關(guān)高血壓發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制。雖然本研究尚未探討這一現(xiàn)象的分子機(jī)制，但推測可能與膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有關(guān)。

綜上所述,As Ⅳ可通過改善炎癥反應(yīng)和瘦素抵抗來降低肥胖相關(guān)高血壓，這與下丘腦和脂肪組織中α7nAchR的表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)。As Ⅳ有望為防治肥胖相關(guān)高血壓提供一種新的選擇。