茍東蕓,苑夢偉,高 雁,何 莎,李 漾, 李雯玉,馬曉偉,2,孫靜娜

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,河北 石家莊,050031;2.河北省神經(jīng)退行性疾病機制研究重點實驗室,河北 石家莊,050017;3.河北醫(yī)科大學(xué),河北 石家莊,050017)

腦卒中是導(dǎo)致中國人群死亡的重要原因，其中缺血性腦卒中約占卒中總數(shù)的70%[1]。缺血性腦卒中是一種復(fù)雜的、受遺傳等多因素影響的疾病，不但發(fā)病率和病死率高，而且復(fù)發(fā)和殘疾的風(fēng)險也很高[2]。研究[3-4]表明載脂蛋白E(ApoE)基因多態(tài)性等遺傳因素參與缺血性腦卒中的發(fā)生、治療和預(yù)后，ApoE基因多態(tài)性可能通過調(diào)節(jié)血脂水平影響動脈粥樣硬化和缺血性腦卒中的發(fā)生。與高加索地區(qū)人群相比，攜帶ε4等位基因的亞洲人群發(fā)生缺血性腦卒中的風(fēng)險更高[5]。在中國人群中，研究[6-8]也證實ApoEε4等位基因攜帶者罹患缺血性腦卒中的風(fēng)險更大。此外,ApoE基因多態(tài)性不僅與缺血性腦卒中密切相關(guān)，而且與其危險因素如高血壓、糖尿病[10]、冠狀動脈粥樣硬化[11]及高膽固醇血癥[12]等疾病也密切相關(guān)，較之ε2和ε3等位基因，ε4等位基因攜帶者發(fā)生上述疾病的風(fēng)險明顯增高。

ApoE由人類19號染色體上的ApoE基因編碼，是一種主要在肝臟合成的多態(tài)性蛋白[13],在脂質(zhì)運輸和代謝過程中發(fā)揮重要作用，參與多種疾病的發(fā)生和預(yù)后。ApoE基因有2個常見、非同義多態(tài)性位點526C>T和388T>C,二者形成3種等位基因[ε2(388T-526T)、ε3(388T-526C)、ε4(388C-526C)]及6種基因表型[14](ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4)。目前有關(guān)ApoE基因多態(tài)性的研究多集中在與阿爾茲海默病[15]、腦卒中[6]、糖尿病[6]等疾病相關(guān)性方面，目前有關(guān)河北地區(qū)ApoE基因多態(tài)性與缺血性腦卒中及其危險因素的相關(guān)研究較少。本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)-熒光探針法對河北地區(qū)缺血性腦卒中患者進(jìn)行ApoE基因多態(tài)性檢測，并檢測卒中人群脂蛋白a[Lp(a)]、尿酸(UA)及血脂水平等，分析缺血性腦卒中患者ApoE基因多態(tài)性分布及其與缺血性腦卒中危險因素(如糖尿病、高血壓、高尿酸血癥、高血脂等)的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年10—12月河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診就診的1 027例缺血性腦卒中患者為研究對象。缺血性腦卒中納入標(biāo)準(zhǔn):① 年齡≥40歲者;② 缺血性腦卒中診斷參考《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[6]，腦CT或MRI檢查確認(rèn)腦內(nèi)有缺血性病變者。排除標(biāo)準(zhǔn):① 近1個月內(nèi)(通過確認(rèn)患者的病歷)服用降脂藥物者;② 合并嚴(yán)重感染、腫瘤、嚴(yán)重的肝腎功能障礙和其他影響血脂的疾病者;③ 合并阿爾茨海默病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等疾病者。

為進(jìn)一步分析ApoE基因多態(tài)性與缺血性腦卒中危險因素的相關(guān)性，篩選門診中住院的資料齊全的患者716例，將其分為3組，即ε2等位基因攜帶者(ε2/ε2、ε2/ε3)、ε3等位基因攜帶者(ε3/ε3)、ε4等位基因攜帶者(ε3/ε4、ε4/ε4)。排除ε2/ε4基因型(因其對血脂代謝的相反作用)。本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會審批(批準(zhǔn)號20190418),患者及其家屬對研究項目知情并簽署知情同意書。

1.2 儀器和試劑

PCR擴增儀及DNA提取儀:全自動核酸提純及熒光PCR分析儀Anadus9850(廈門安普利生物工程有限公司);人類SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)(武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司，批號19052008);血液基因組DNA提取試劑盒(廈門安普利生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 血液基因組DNA提取:抽取受試者空腹靜脈血2 mL置于EDTA抗凝管中，使用核酸提取試劑盒(廈門安普利生物工程有限公司)提取血液中的基因組DNA，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行提取和檢測。

1.3.2 PCR反應(yīng)體系和擴增條件:在2 μL待測樣本的基因組DNA(推薦濃度為5～15 ng/μL)、弱陽性對照和空白對照反應(yīng)管中分別加入裝有23 μL SLCO1B1*lb、SLCO1B1*5、ApoE2、ApoE4的反應(yīng)液，再進(jìn)行PCR 擴增檢測。PCR反應(yīng)條件:尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)處理階段為37 ℃下10 min,循環(huán)1次;預(yù)變性階段為95 ℃下5 min,循環(huán)1次;PCR階段為95℃下15 s、60 ℃下45 s,循環(huán)40次(設(shè)置在此階段結(jié)束時采集熒光信號)。

1.3.3 血液學(xué)指標(biāo)檢測:于清晨抽取患者空腹靜脈血2 mL進(jìn)行血液學(xué)指標(biāo)檢測，采用Beckman LX20全自動血生化分析儀檢測UA、Lp(a)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。高膽固醇血癥標(biāo)準(zhǔn)為TC≥5.72 mmol/L,HDL≤0.90 mmol/L,LDL-C≥3.64 mmol/L[17]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,Hardy-Weinberg平衡采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗;采用方差分析或Wilcoxon秩和檢驗評估尿酸、Lp(a)、血脂等與ApoE基因多態(tài)性的關(guān)系;通過單因素和多因素Logistic回歸分析計算95%置信區(qū)間(CI)和優(yōu)勢比(OR)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 河北地區(qū)缺血性腦卒中患者ApoE基因型和等位基因分布特點

河北地區(qū)缺血性腦卒中患者ApoE基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.87、0.27)。在漢族人群的6種ApoE基因型中,ε3/ε3型占69.52%,其余由高至低依次為ε2/ε3型(15.00%)、ε3/ε4型(12.46%)、ε2/ε4型(2.14%)、ε4/ε4型(0.49%)和ε2/ε2型(0.39%),ApoE基因型和等位基因在男性和女性患者中的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.395、0.641)。見表1。

表1 缺血性腦卒中患者等位基因和基因型頻率分布[n(%)]

2.2 缺血性腦卒中患者的臨床特征及其與危險因素的相關(guān)性

ε2等位基因攜帶組、ε3等位基因攜帶組、ε4等位基因攜帶組的高血壓、糖尿病發(fā)生率及UA、同型半胱氨酸(Hcy)水平無差異，但3組Lp(a)、TG、LDL-C及高膽固醇血癥發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003、0.042、0.019、0.013),表現(xiàn)為ε2等位基因攜帶者TG水平高于ε4等位基因攜帶者，而ε4等位基因攜帶者Lp(a)、LDL-C水平及高膽固醇血癥發(fā)生率高于ε2等位基因攜帶者。見表2、圖1。ε4等位基因攜帶組TC水平有升高趨勢,HDL-C水平有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);ε2等位基因攜帶組與ε3等位基因攜帶組TG、TC、LDL-C、HDL-C水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 ε2、ε3和ε4等位基因攜帶組患者臨床資料的比較[n(%)][M(P25,P75)]

2.3 ApoE基因多態(tài)性與高膽固醇血癥的相關(guān)性

為進(jìn)一步探討ApoE基因多態(tài)性與高膽固醇血癥的關(guān)系，以高膽固醇血癥為因變量,ApoE基因型及臨床指標(biāo)為自變量，進(jìn)行單因素Logistic回歸分析，各項變量賦值見表3。結(jié)果顯示,ApoE ε4等位基因(OR=1.924,95%CI為1.235～2.997,P=0.004)、糖尿病(OR=1.963,95%CI為1.367～2.820,P<0.001)是高膽固醇血癥發(fā)生的危險因素，見表4。

表3 高膽固醇相關(guān)危險因素的變量賦值表

表4 高膽固醇血癥相關(guān)危險因素的單因素Logistic回歸分析

在校正單因素回歸分析中P<0.10的因素后，將年齡、ε4等位基因、糖尿病、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)納入多因素回歸方程中，使用前進(jìn)法分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以ε3/ε3基因型為參照,ApoEε4等位基因與高膽固醇血癥的風(fēng)險增加相關(guān)(OR=1.943,95%CI為1.240～3.043)。見表5?；貧w分析的Hosmer-Lymeshaw檢驗顯示,χ2=12.171、P=0.144,表明該模型與原始數(shù)據(jù)吻合良好。

表5 高膽固醇血癥危險因素的多因素逐步法Logistic回歸分析

3 討 論

ApoE基因多態(tài)性的分布在不同種族間存在差異。本研究中，缺血性腦卒中患者中ε3/ε3基因型比率最高(69.52%),而ε2/ε2基因型比率最低(0.39%),與河北地區(qū)[18]、華中地區(qū)[19]和南部地區(qū)[20]數(shù)據(jù)相似。在等位基因分布數(shù)據(jù)方面，河北地區(qū)缺血性腦卒中患者ε2等位基因頻率(8.96%)略低于健康(9.4%)或無缺血性腦卒中(6.51%～19.40%)[2,7,21]的中國人群,ε4等位基因頻率(7.79%)亦低于既往研究[2,3,7,22]報告的數(shù)據(jù)。本研究還發(fā)現(xiàn),ApoE等位基因頻率與既往研究[23]報道的白種人等位基因頻率差異較大，后者ε4、ε2、ε3的等位基因頻率分別為15%、8%和77%。這提示不同種族和地區(qū)間ApoE基因多態(tài)性分布存在明顯的差異。作者分析本研究與既往中國人群報道存在差異的原因為:本研究對納入患者進(jìn)行了詳細(xì)的篩選，排除了合并有嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙、冠心病等與ε4等位基因比率升高密切相關(guān)的疾病，更準(zhǔn)確地反映了ε4等位基因在缺血性腦卒中人群中的分布特征。

ApoE基因多態(tài)性與缺血性腦卒中相關(guān)，但ApoE是對缺血性腦卒中有直接影響，還是通過影響其危險因素進(jìn)而間接影響疾病的發(fā)生，目前尚無定論。本研究針對缺血性腦卒中人群，分析了ApoE與其危險因素(如高血壓、糖尿病、高UA、高Hcy、高膽固醇血癥等)的相關(guān)性，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)ApoE基因多態(tài)性與高血壓、糖尿病等疾病的發(fā)生率具有相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)ε4等位基因攜帶者高膽固醇血癥的發(fā)病率及Lp(a)、LDL-C水平顯著增高，考慮到ApoE基因多態(tài)性可顯著影響脂質(zhì)代謝，而脂質(zhì)異常代謝又會造成膽固醇水平升高，不僅使患者罹患缺血性腦卒中的風(fēng)險升高，也增加了高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病等相關(guān)危險因素的發(fā)生風(fēng)險，從而進(jìn)一步影響腦卒中的發(fā)生。

本研究進(jìn)行了單因素和多因素回歸分析，發(fā)現(xiàn)在調(diào)整年齡、BMI、糖尿病和ApoE基因型后,ε4等位基因增加了患者罹患高膽固醇血癥的風(fēng)險;與ε3/ε3基因型相比,ε4等位基因使缺血性腦卒中患者發(fā)生高膽固醇血癥的風(fēng)險增加了1.943倍(OR=1.943,95%CI為1.240～3.043),這也與既往研究[12,24]相似。上述結(jié)果提示，無論是通過影響高血壓、冠狀動脈粥樣硬化、高膽固醇血癥等危險因素，還是對其產(chǎn)生直接影響,ApoE基因多態(tài)性對缺血性腦卒中的影響都與血脂代謝紊亂這一環(huán)節(jié)緊密相連,ApoE基因多態(tài)性作為脂質(zhì)代謝的重要影響因素，對缺血性腦卒中的發(fā)生產(chǎn)生一定的影響。

因此，對于攜帶ε4等位基因的缺血性腦卒中患者，應(yīng)鼓勵其控制膽固醇攝入量，堅持少食多餐的原則，倡導(dǎo)良好的生活方式，戒煙和限酒，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕顒?。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)ε2等位基因攜帶者TG水平偏高，建議患者在滿足日?；緺I養(yǎng)需求的基礎(chǔ)上，控制總能量的攝入，合理搭配各營養(yǎng)元素的組成比例，控制體質(zhì)量，戒煙限酒，并堅持定期中強度代謝運動[25],從而維持體內(nèi)血脂水平的穩(wěn)定，預(yù)防高膽固醇血癥及缺血性腦卒中等疾病的發(fā)生。