靳春雷， 朱煥勉， 陳鵬龍， 雷 強

（麗水市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，浙江 麗水 323000）

耳聾是人類常見的出生缺陷之一，主要與遺傳因素和環(huán)境因素有關(guān)，其中遺傳因素所致的耳聾占60%。在遺傳性耳聾中，有30%伴有其他癥狀，被稱為綜合征性耳聾（syndromic sensorineural hearing loss，SHL）；其余70%不伴其他癥狀，被稱為非綜合征耳聾（nonsyndromic sensorineural hearing loss，NSHL）[1]。在遺傳性耳聾患者中，有80%為常染色體隱性非綜合征耳聾（autosomal recessive non-syndromic sensorineural hearing loss，ARNSHL）[2]。目前，已鑒定出70多個基因與ARNSHL有關(guān)（https：//hereditaryhearingloss.org/）。雖然導致耳聾的基因較多，但絕大多數(shù)遺傳性耳聾只與少數(shù)幾個基因有關(guān)。根據(jù)我國大規(guī)模的耳聾流行病學調(diào)查，大部分NSHL由4個基因（GJB2、SLC26A4、12SrRNA及GJB3）突變引起；而在ARNSHL中，MYO15A基因出現(xiàn)的頻率僅次于GJB2、SLC26A4，是相對常見的耳聾致病基因之一[2]。由于該基因較大，且無明顯的突變熱點區(qū)域，因此常規(guī)耳聾基因檢測并不包含此基因[3-4]。我們采用高通量測序[又稱下一代測序（next generation sequencing，NGS）]技術(shù)及Sanger測序技術(shù)對1例耳聾患者進行基因檢測，并進行家系驗證及產(chǎn)前診斷。

1 材料和方法

1.1 病例資料

某孕婦，32歲，孕13周；丈夫36歲，夫妻雙方表型正常，否認近親結(jié)婚，無家族史，產(chǎn)檢結(jié)果未見異常。因生育過先天性耳聾的兒子（先證者）來院就診。先證者，4歲，出生時聽力篩查未通過，常規(guī)耳聾基因檢測未見異常，無氨基糖苷類藥物用藥史，顳部電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）檢查未見異常。臨床診斷為非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾（左耳80 dB，右耳85 dB）。1歲之前植入人工耳蝸，聽力、語言及智力發(fā)育正常。對先證者及其家系進行分子診斷，對胎兒進行產(chǎn)前診斷。家系遺傳圖譜見圖1。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及處理 采集先證者及其父母親外周靜脈血5 mL，其中2 mL采用Qiagen Blood DNA mini kit（德國Qiagen公司）提取基因組DNA，采用Qubit dsDNA HS Assay Kit（美國Invitrogen公司）測定濃度后-20 ℃保存?zhèn)溆?。孕婦于孕19周時在超聲指導下行羊水穿刺，對胎兒進行產(chǎn)前診斷。

1.2.2 基因捕獲、建庫及測序 采用常見耳聾基因panel的捕獲oligo，采用多重聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）靶向富集目標區(qū)域序列。采用AgencourtAMPure XP磁珠（美國Beckman Coulter公司）純化捕獲產(chǎn)物。按TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina建庫試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）說明書處理純化產(chǎn)物，建庫過程中每個樣本都會加上特殊標簽[TruePrep Index Kit V2 for Illumina（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）]。文庫采用Qubit dsDNA HS Assay Kit（美國Invitrogen公司）測定濃度，采用2100 Bioanalyzer生物芯片分析系統(tǒng)（美國Agilent公司）及配套High Sensitivity DNA試劑盒分析片段大小，確定文庫合格后采用DNA Standa ds and Primer Premix定量試劑盒（美國Illumina公司）對文庫進行精確定量，確定上機樣本量。采用MiSeq系統(tǒng)（美國Illumina公司）及配套MiSeq Reagent Kit V2（300 cycles）基因測序試劑盒進行測序。

1.2.3 Sanger測序驗證 對發(fā)現(xiàn)的突變采用Sanger測序進行驗證。取20 ng DNA，使用待測位點的特異性引物，按照LA PCR Kit Ver.2.1（日本TaKaRa公司）說明書進行PCR。PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳分析，并切膠回收純化。將回收產(chǎn)物稀釋至10 ng/μL，按BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（美國ABI公司）說明書進行測序及純化：每孔加入10 μL Hi-Di（美國ABI公司），變性5 min，取出置于冰上冷卻，轉(zhuǎn)入上機用96孔板中，在ABI 3500XL基因分析儀（美國ABI公司）上進行測序分析。

1.2.4 生物信息學與致病性分析 在ClinVar數(shù)據(jù)庫和人類基因突變數(shù)據(jù)庫（the Human Gene Mutation Database，HGMD）中查詢有無檢測出的突變的報道，在ExAC和 1000 Genomes數(shù)據(jù)庫中查詢該突變在正常人群中的發(fā)生頻率。采用Mutation Taster軟件、PRONEAN軟件對該突變進行致病性預測。

1.2.5 母血污染鑒定 采用3130測序儀（美國ABI公司）及STR基因型檢測試劑盒[含17個短串聯(lián)重復序列（short tandem repeat，STR）][天昊基因科技（蘇州）有限公司]檢測孕婦外周血及羊水樣本，測定結(jié)果采用GeneMapper軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 NGS及Sanger測序結(jié)果

NGS分析結(jié)果顯示，先證者MYO15A基因第63、64號外顯子分別存在c.10250-10252delTCC（p.S3417del）、c.10419-10423delCAGCT（p.S3474Pfs*42）雜合突變（參考基因組hg19）。Sanger測序結(jié)果顯示，先證者的突變位點與NGS結(jié)果一致；父親63號外顯子存在c.10250-10252delTCC（p.S3417del）突變，母親64號外顯子存在c.10419-10423delCAGCT（p.S3474Pfs*42）突變。見圖2。

圖2 Sanger測序位點驗證

2.2 生物信息學分析

對突變位點進行生物信息學分析，MYO15A基因的c.10250_10252del突變，其蛋白質(zhì)第3 417位氨基酸發(fā)生缺失（p.S3417del），其下游氨基酸不發(fā)生改變。c.10419_10423del突變導致第3 474位氨基酸由絲氨酸變?yōu)楦彼?，其后因移碼突變而使終止密碼子提前產(chǎn)生（p.S3474Pfs*42），導致多肽鏈合成提前終止，產(chǎn)生截斷蛋白，造成蛋白質(zhì)無法正常折疊，從而發(fā)生降解。采用Mutation Taster軟件、PRONEAN軟件對MYO15A的c.10250_10252del、c.10419_10423del突變進行有害預測，預測結(jié)果均顯示為“有害”。

2.3 產(chǎn)前診斷

基于生物信息學分析結(jié)果，需對胎兒進行產(chǎn)前診斷。STR數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，胎兒DNA沒有母血污染，且親緣關(guān)系符合。Sanger測序結(jié)果顯示，胎兒64號外顯子存在c.10419-10423delCAGCT雜合突變，遺傳其母親。因該基因為隱性遺傳，推測胎兒出生后出現(xiàn)先證者表型的可能性不大。經(jīng)過遺傳咨詢，孕婦選擇繼續(xù)妊娠，產(chǎn)后隨訪結(jié)果顯示嬰兒聽力正常。

3 討論

耳聾是一種常見的具有表型和遺傳異質(zhì)性的疾病。在ARNSHL中MYO15A被認為是第3常見致病基因。MYO15A基因位于染色體17p11.2上，具有66個外顯子，全長71 kb，編碼3 530個氨基酸，其編碼的肌球蛋白15對維持細胞形態(tài)、細胞運動、細胞器的轉(zhuǎn)運及細胞信號的傳導具有重要的生理作用，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分為頭部、頸部、尾部3個區(qū)域：頭部區(qū)域包括N-末端結(jié)構(gòu)域和負責三磷酸腺苷活性的運動結(jié)構(gòu)域；頸部區(qū)域包括鈣調(diào)蛋白輕鏈結(jié)合相關(guān)的IQ基序；尾部區(qū)域包括2個肌球蛋白尾部同源物4（myosin tail homology 4，MyTH4）結(jié)構(gòu)域、2個FERM結(jié)構(gòu)域、1個SH3同源3結(jié)構(gòu)域、1個C末端亞型I和PDZ的結(jié)合基序[4-5]。肌球蛋白15位于耳蝸和前庭毛細胞靜纖毛的尖端，對傳遞知覺的毛細胞靜纖毛的發(fā)育和維持有著重要作用[6-8]，有研究發(fā)現(xiàn)，MYO15A蛋白缺陷的小鼠毛細胞靜纖毛之間沒有任何聯(lián)系，且毛細胞靜纖毛的長度短于野生型小鼠，可使靜纖毛之間機械傳遞機制中斷，導致耳聾的發(fā)生[9-10]。由此可見，MYO15A蛋白是維持正常聽力的重要組成部分。

在HGMD數(shù)據(jù)庫中，關(guān)于MYO15A基因突變的報道有近300種，尚未發(fā)現(xiàn)突變熱點，主要為錯義突變，其次為無義突變、移碼突變、剪切位點突變和插入/缺失突變。MYO15A基因編碼的肌球蛋白15頭部N-末端區(qū)域發(fā)生的突變，聽力表型為有殘存聽力的非重度耳聾，而非-N端區(qū)域突變，表型多為先天性或語前重度耳聾[11]。本研究結(jié)果顯示，MYO15A基因的c.10250_10252del和c.10419_10423del突變位于肌球蛋白15尾部的FERM結(jié)構(gòu)域（非-N端區(qū)域突變），該結(jié)構(gòu)域是1個蛋白結(jié)合模塊，負責細胞質(zhì)與膜之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運。有研究結(jié)果表明，該區(qū)域在不同物種之間具有高度保守性，正常的FERM結(jié)構(gòu)域?qū)o纖毛的延長和聲音的探測是必不可少的，F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域的突變可能會干擾蛋白質(zhì)的正確折疊、相鄰結(jié)構(gòu)域之間的親和力及域內(nèi)相互作用[12-13]。動物實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域缺失最后6個外顯子可導致shaker 2J小鼠異常短的靜纖毛及階梯狀結(jié)構(gòu)消失，引起耳聾[14-15]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域第63、64號外顯子的缺失突變導致先證者發(fā)生重度聽力障礙。因此，發(fā)生在FERM結(jié)構(gòu)域的突變?？蓪е轮囟壬踔翗O重度聽力損失。家系分析發(fā)現(xiàn)表型正常的父母分別攜帶這2個突變位點，符合ARNSHL表型共分離現(xiàn)象。在HGMD數(shù)據(jù)庫中，有1篇文獻報道了c.10250_10252del突變，該例非綜合征型常染色體隱性遺傳性耳聾患者攜帶此突變[16]，但ClinVar數(shù)據(jù)庫未見報道。ExAC和 1000 Genomes數(shù)據(jù)庫中未收錄這2種突變在正常人群中的發(fā)生頻率，說明這2種突變在人群中極為罕見。根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）2015年發(fā)布的指南，這2種突變評級為“可能致病”，這為產(chǎn)前診斷提供了理論依據(jù)。本研究產(chǎn)前診斷結(jié)果提示胎兒僅存在c.10419-10423delCAGCT雜合突變，遺傳自其母親，從基因水平推測胎兒發(fā)生耳聾的可能性不大。產(chǎn)后隨訪結(jié)果也顯示嬰兒聽力正常。

綜上所述，MYO15A基因的c.10250_10252del和c.10419_10423del復合雜合突變是本例先證者耳聾的致病原因。本研究為該家系遺傳咨詢及再生育指導提供了分子病理學依據(jù)，新突變位點的發(fā)現(xiàn)也擴大了該基因的突變譜。