徐曉敏 ，李華

（1. 中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，上海 200031；2. 國科大杭州高等研究院，浙江 杭州 310000）

目前，以T細胞受體工程化T細胞（T cell receptor-engineered T cell，TCR-T）和嵌合抗原受體T細 胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）療法為主流的過繼性T細胞免疫療法成為腫瘤免疫治療的一大熱點。通過向天然的T細胞中轉(zhuǎn)入識別腫瘤抗原的T細胞受體（T cell receptor，TCR）α/β異二聚體或嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR），T細胞便能夠高效地識別靶抗原，在體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤免疫功能。CAR-T療法是過繼性免疫療法中研究較為火熱的一員，目前已上市的產(chǎn)品以及處于臨床階段的CAR-T產(chǎn)品多針對于血液瘤，對于實體瘤的治療效果較差。分析其中原因，主要在于實體瘤的細胞療法存在不少難點，例如不同類型實體瘤的異質(zhì)性大、缺乏獨特的腫瘤相關(guān)抗原作為治療靶點、T細胞無法定向遷移到腫瘤部位、CAR-T的增殖能力和抗凋亡能力等持續(xù)性不夠以及腫瘤內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境對TCR有抑制作用等。雖然CAR-T與TCR-T都與通用的細胞治療兼容，并且能夠誘導(dǎo)有效的抗腫瘤反應(yīng)，但TCR-T顯示出一些獨特的特性，使其在治療具有挑戰(zhàn)性的實體瘤時具有獨特的優(yōu)勢，但這種優(yōu)勢背后具體的分子機制尚不完全清楚。因此本文主要針對現(xiàn)有的文獻報道，從TCR和CAR本身結(jié)構(gòu)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)差異等方面出發(fā)來理解這種臨床治療上的差異，這對于理解TCR-T針對實體瘤的治療優(yōu)勢具有重要意義。

1 T細胞受體的結(jié)構(gòu)

TCR是所有T細胞表面表達的由基因重排產(chǎn)生的天然抗原受體，它與CAR之間存在許多不同。與CAR的單鏈結(jié)構(gòu)不同，TCR由2條高度可變肽鏈組成異二聚體，包括TCR2（α/β）和TCR1（γ/δ）。由于攜帶αβ肽鏈的T細胞占了絕大多數(shù)（98%），所以接下來提及的TCR都默認為TCR2（α/β）。TCRα鏈和β鏈均各有1個可變抗原結(jié)合區(qū)、1個恒定區(qū)和1個跨膜結(jié)構(gòu)域。但TCR鏈并不具備獨立傳遞信號的能力，這是由于TCR的2條肽鏈（αβ）胞內(nèi)區(qū)很短，無法獨立傳遞信號（見圖1）。這種結(jié)構(gòu)特性使得其必須通過跨膜區(qū)（帶正電荷）與分化簇3（cluster of differentiation 3，CD3）分子帶負電的跨膜區(qū)非共價結(jié)合，形成TCR-CD3復(fù)合物，進而將TCR識別抗原的信號傳遞到胞內(nèi)，將抗原特異性識別與效應(yīng)反應(yīng)結(jié)合起來，啟動一系列信號反應(yīng)。TCR通過1個抗原識別亞基（TCRαβ）和3個CD3信號亞基（CD3δε，CD3γε和CD3ζζ）形成八聚體，而CD3γ，CD3δ和CD3ε鏈各含有1個免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosinebased activation motif，ITAM）基序，CD3ζ鏈含有3個ITAM基序，因此1個TCR-CD3復(fù)合物共含有10個ITAM基序和20個關(guān)鍵的酪氨酸磷酸化位點[1]（見圖1）。這些ITAM基序中的酪氨酸磷酸化在TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。2019年，Dong等[2]報道了配體未結(jié)合狀態(tài)下人TCR-CD3復(fù)合物的冷凍電鏡（cryo-EM）結(jié)構(gòu)，分辨率為3.7 ?，并以TCRαβ/CD3δε/CD3γε/CD3ζζ的化學(xué)計量1∶1∶1∶1進行組裝，這與生化實驗所得結(jié)果相呼應(yīng)，進一步證實了TCR-CD3復(fù)合物的結(jié)構(gòu)組成。

與TCR-CD3復(fù) 合 物 相比，1個CAR分 子通常由1個包含輕重鏈可變區(qū)域的單鏈可變區(qū)片段（single-chain variable fragment，scFv）抗體的胞外抗原識別結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成（見圖1）。CAR的跨膜區(qū)與T細胞的跨膜區(qū)功能一樣，具有錨定作用，可以將CAR固定在T細胞膜上，使其穩(wěn)定地發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。CAR的胞內(nèi)區(qū)則由1個（二代CAR）或2個（三代CAR）共刺激受體和CD3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。與TCR一樣，CAR信號序列上同樣具有多個ITAM，能將CAR接收到的抗原信號轉(zhuǎn)化為活化信號，激活T細胞，使其增殖并分化為效應(yīng)性的T細胞，發(fā)揮抗腫瘤等免疫應(yīng)答功效。但是與天然的TCR相比，CAR僅含有3個ITAM。一項對小鼠TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究表明，低多樣性的ITAM足以誘導(dǎo)細胞因子的產(chǎn)生，但TCR驅(qū)動的細胞增殖需要高多樣性ITAM，從而揭示了TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有分級性質(zhì)[3]。此外，更大的ITAM多樣性能夠介導(dǎo)更強的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]，以確保更高比例的細胞在抗原刺激下被激活，而不是簡單地放大單個T細胞的信號強度。因此，合適的ITAM數(shù)量也許在T細胞功能發(fā)揮中具有重要作用。表1對TCR與CAR的特性做了比較。

表1 T細胞受體和嵌合抗原受體的特性對比Table 1 Comparison of characteristics between T cell receptor and chimeric antigen receptor

圖1 T細胞受體和嵌合抗原受體的結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Structure diagrams of T cell receptor and chimeric antigen receptor

2 T細胞受體的抗原識別

TCR和CAR識別的抗原類型不同。TCR能夠識別由主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）呈遞的抗原，CAR則利用其scFv識別細胞表面分子。目前的生物信息學(xué)預(yù)測表明，大約27%的人類蛋白質(zhì)組包含膜整合結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)可能在細胞表面表達，因此這些蛋白質(zhì)能夠被CAR識別[12-13]。這同時也意味著有很大一部分表達在癌細胞內(nèi)的潛在靶點因不能被CAR有效識別而不適用于CAR-T療法。相比之下，TCR可以識別來自整個蛋白質(zhì)組的抗原表位，包括位于細胞表面、細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)的靶標分子。因此，相對于CAR，TCR可以識別更為廣泛的抗原類型，不僅僅局限于細胞表面分子。這也許正是TCR-T在治療實體瘤方面具有更好療效的原因之一。

TCR和CAR對抗原的親和力不同。在工程化的T細胞中，TCR對抗原的親和力至關(guān)重要，能夠決定T細胞治療的安全性和有效性[6]。使用scFv識別域的CAR對抗原的親和力通常在納摩爾（nmol · L-1）級別[5]。相比之下，天然TCR的親和力的數(shù)量級通常在微摩爾（μmol · L-1）級別[14]。基于此，許多學(xué)術(shù)界和工業(yè)界研究人員想利用CAR-T對抗原的高親和性來獲得良好的抗腫瘤功效。然而許多實驗結(jié)果顯示，與高親和力的CAR相比，具備低親和力CAR結(jié)構(gòu)的CAR-T顯示出更強的增殖能力和抗凋亡等持續(xù)性和抗腫瘤能力[15-16]。因此，抗原親和力是否與抗腫瘤功能呈現(xiàn)正相關(guān)仍是一個有待商榷的問題。

TCR和CAR在抗原識別的敏感性方面也不盡相同。雖然基于scFv的CAR相對于TCR對其目標抗原具有更高的內(nèi)在親和力，但TCR-T可以感受并響應(yīng)靶細胞上更少的分子，即能夠?qū)O少的抗原肽-MHC復(fù)合物（peptide-major histocompatibility complex，pMHC）產(chǎn)生反應(yīng)，甚至單一抗原pMHC即可將其激活[17]。相反，CAR修飾的T細胞需要高好幾倍數(shù)量級的抗原刺激才能實現(xiàn)與TCR-T同等水平的細胞因子釋放。Harris等[18]通過將傳統(tǒng)的α/β異二聚體或CAR與CAR胞內(nèi)信號基序結(jié)合，比較了TCR和CAR在相同靶抗原的刺激下兩者信號的差異，結(jié)果表明盡管TCR在膜表面的水平低于CAR，但TCR信號對抗原的敏感度是CAR信號的10 ～ 100倍；另外，定量的單分子活細胞成像結(jié)果顯示TCR的敏感性是CAR的1 000倍[7]。這種敏感性數(shù)量級上的差異的內(nèi)在機制尚不完全清楚，其中一種解釋為相對低親和力的TCR比相對高親和力的scFv擁有更快的抗原解離速率（off-rate），因而能夠連續(xù)不斷地與單個pMHC進行反應(yīng)從而擴大下游信號[19]。這種快速的抗原識別可能對實體瘤的殺傷更有利。

3 T細胞受體的信號啟動

盡管關(guān)于TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制方面的研究層出不窮，但TCR的觸發(fā)機制仍不完全清楚，目前主要有以下幾種機制（不一定相互排斥）被提出。

3.1 動態(tài)隔離模型

當TCR復(fù)合物與pMHC復(fù)合物結(jié)合后，會與抗原提呈細胞之間形成免疫突觸。動態(tài)隔離模型（kinetic segregation model）可描述為在免疫突觸中，TCR處于中心位置并形成“緊密結(jié)合區(qū)域”（close contact zones），進而排斥一些大分子蛋白，如磷酸酶CD45分子[20]。這種機制最終導(dǎo)致的結(jié)果即為TCR/CD3近端的激酶和磷酸酶平衡失調(diào)，從而使得CD3被磷酸化，促進T細胞活化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在CAR與靶細胞特異性表達抗原結(jié)合的表面，CD45同樣處于被排除狀態(tài)以促進信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，動態(tài)隔離模型在CAR信號中也許同樣重要[21]。

3.2 動力學(xué)校對機制

動力學(xué)校對機制（kinetic proofreading mechanism）是指pMHC和不同的TCR相互作用過程中，不停地結(jié)合和解離，進行動力學(xué)校對；當TCR與pMHC相互作用的半衰期（t1/2）可以維持足夠長的時間，便可以引發(fā)下游信號事件的發(fā)生。近年來利用光遺傳學(xué)技術(shù)的研究也支持TCR的動力學(xué)校對機制，該項研究利用光來調(diào)控TCR或CAR與抗原的相互作用時間。研究表明，CAR具有類似于TCR的校對機制，因此TCR與CAR僅在其以足夠的強度與配體結(jié)合時才響應(yīng)，以確保有足夠的時間與抗原接觸[22]。這種可能性對于優(yōu)化CAR設(shè)計的靈敏度和特異性具有重要意義。

3.3 串行參與模型

串行參與模型（serial engagement model）常與動力學(xué)校對機制并列提及。該模型闡述TCR與pMHC達成緊密結(jié)合就像接力一樣，即單個pMHC可與多個TCR進行連續(xù)性的接觸，而這些連續(xù)性接觸積累起來的結(jié)果，使得TCR與pMHC達到緊密結(jié)合，最終導(dǎo)致T細胞的完全活化[23-24]。

3.4 構(gòu)象形變模型

TCR屬于精巧組裝的復(fù)合物。構(gòu)象形變模型指出，pMHC的刺激會引起TCR分子產(chǎn)生構(gòu)象形變，而微小的構(gòu)象改變都可引發(fā)不同的功能。TCR的構(gòu)象改變發(fā)生在其胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。越來越多的證據(jù)表明，TCR作為機械傳感器，當相應(yīng)配體與其特異性結(jié)合后，TCR-CD3復(fù)合物在其胞外區(qū)發(fā)生依賴于力的結(jié)構(gòu)改變[25]。這種機械力來源于細胞外和細胞內(nèi)。關(guān)于細胞外機械力（external force），一方面，位于細胞表面的TCR能夠受到血液剪切力的影響；另一方面，細胞極化會使得T細胞接收來自細胞前沿產(chǎn)生機械外力[25]。另外，在T細胞與抗原呈遞細胞（antigen presenting cell，APC）或靶細胞形成免疫突觸時，細胞骨架重組導(dǎo)致的逆行流動則會對TCR施加大量內(nèi)在機械力（internal force）[26]。TCR可以利用機械力引發(fā)pMHC構(gòu)象變化，多步級聯(lián)放大激動型和非激動型抗原的差別，從而在面臨多樣性的抗原時，保持與特定pMHC緊密的錨定，實現(xiàn)精準的抗原識別[27]。對于CAR而言，目前尚不清楚是否存在同樣的機制。但是，CAR分子結(jié)構(gòu)是支持其進行力依賴的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)改變的。TCR跨膜區(qū)的構(gòu)象改變涉及CD3ζ，TCRα以及TCRβ跨膜區(qū)。CAR的跨膜區(qū)由CD8α或CD28的跨膜區(qū)構(gòu)成，目前關(guān)于CAR跨膜區(qū)構(gòu)象形變引發(fā)其功能改變的研究尚未見報道。

在TCR-CD3復(fù) 合 物 中，CD3ε的 胞 內(nèi) 區(qū) 含有1個富含堿性氨基酸的區(qū)域（basic residue rich sequence，BRS）、1個富含脯氨酸的區(qū)域（proline rich sequence，PRS）和1個ITAM；CD3ζ的胞內(nèi)區(qū)含有3個ITAM，以及2個夾在其間的BRS；CD3γ和CD3δ的胞內(nèi)區(qū)各含1個ITAM。研究表明，帶正電的CD3ε和CD3ζ的BRS可以與質(zhì)膜內(nèi)葉中帶負電的酸性磷脂相結(jié)合，暗示兩者能夠在pMHC結(jié)合時進行動態(tài)的結(jié)合與釋放，并且這種動態(tài)化的變化與CD3ε和CD3ζ的ITAM基序的磷酸化機制密切相關(guān)。在T細胞靜息狀態(tài)下，CD3ε的BRS區(qū)域可以與細胞質(zhì)膜上的酸性磷脂發(fā)生靜電相互作用，從而使得整個CD3ε的胞內(nèi)區(qū)被屏蔽在膜脂雙層中。這種膜屏蔽機制既屏蔽了CD3ε的酪氨酸位點，同時也阻止了BRS區(qū)與淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶（lymphocyte-specific protein tyrosine kinase，Lck）的相互作用，達到抑制TCR整體磷酸化的效果[28]。當TCR與特異性的抗原肽-MHC復(fù)合物結(jié)合后，會使得TCR發(fā)生形變，CD3ε胞內(nèi)區(qū)從膜上解離下來，暴露其中的酪氨酸磷酸化位點。此外，由于T細胞活化導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣離子濃度的上升，內(nèi)流的鈣離子可以通過中和酸性磷脂負電荷的方式使得未直接接觸抗原的TCR中的CD3ε胞內(nèi)區(qū)從膜上解離[29]；于是，暴露于胞質(zhì)的游離CD3ε ITAM進一步被下游的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶磷酸化，進而發(fā)生一系列磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，從而放大TCR活化信號。另外，還有學(xué)者指出pMHC與TCR的結(jié)合會暴露CD3ε的PRS區(qū)域，這一暴露的PRS區(qū)域可以為含有SH3結(jié)構(gòu)域的非催化域酪氨酸激酶（non-catalytic region of tyrosine kinase，Nck）提供結(jié)合位點并進一步放大TCR信號[30-31]。但不管是BRS還是PRS，都暗示TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不是簡單的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，其中必定存在尚不清楚的復(fù)雜結(jié)構(gòu)變化，因此，對pMHC與TCR結(jié)合后，導(dǎo)致TCR復(fù)合物磷酸化及其結(jié)構(gòu)變化的理解仍然是一個非常大的挑戰(zhàn)。近期以機械力為參數(shù)的研究另辟蹊徑，利用TCR與激動型pMHC配體的結(jié)合具有機械力依賴性的特點，通過觀測TCR與pMHC配體結(jié)合時形成“捕獲鍵（catch bond）”還是“滑移鍵（slip bond）”，研究人員能夠推測下游信號激活的差異[32]。

受體聚集也是導(dǎo)致構(gòu)象形變的機制之一。配體結(jié)合會導(dǎo)致膜蛋白的聚集或構(gòu)象改變。Janeway于1995年首次提出TCR的活化伴隨TCR的聚集和構(gòu)象改變。由于常規(guī)T細胞的激活并不需要pMHC多聚體[33]，因此受體聚集可能并不是TCR激活的主要機制。而CAR啟動信號傳遞必須依賴CAR蛋白分子聚集[34-35]，因此這種機制可能在CAR中發(fā)揮更為關(guān)鍵的作用。

4 T細胞受體和嵌合抗原受體免疫突觸的形成

上文提到，TCR和CAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的起始伴隨受體聚集。對于天然TCR而言，當TCR與pMHC結(jié)合后，T細胞和APC之間會形成復(fù)雜而有序的超分子結(jié)構(gòu)，稱為超分子激活聚集體（supramolecular activation cluster，SMAC），即免疫突觸。這種細胞與細胞之間的接觸包括“immunological kinapse”（IK）和“immunological synapse”（IS）。其中kinapse是TCR在受體遷移尋找相應(yīng)配體pMHC的過程中形成的一種瞬時且不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，synapse則是TCR與pMHC識別后形成的穩(wěn)定長時間接觸面[36]。TCR刺激和共刺激信號水平、T細胞的分化狀態(tài)以及靶細胞的表型共同決定了細胞是否形成對稱、穩(wěn)定的IS或瞬時的IK，或在2種模式之間過渡[37]。IS由3種不同類型的受體組成，包括TCR、黏附受體和共刺激或共抑制受體，以及它們相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。在TCR與pMHC識別過程中，T細胞和APC之間會形成約為15 nm的間隙，這為受體和配體形成IS提供了空間[38]。黏附分子通過將細胞膜緊密連接在一起來支持IS的結(jié)構(gòu)，這對于持續(xù)的抗原識別必不可少。另外，IS招募的共刺激受體或共抑制受體可以顯著調(diào)節(jié)T細胞的激活。T細胞與B細胞或平面抗原呈遞底物相互作用的免疫熒光成像顯示，SMAC由3個同心圓環(huán)組成，類似于“牛眼（bull,s eye）”[39]（見圖2）。中央SMAC（cSMAC）形成中心環(huán)，外圍SMAC（pSMAC）和遠端SMAC（dSMAC）在其外圍環(huán)繞。每個環(huán)都有自己特殊的組成和功能。cSMAC包含一定濃度的TCR和共刺激分子CD28，負責(zé)伴隨突觸形成的關(guān)鍵T細胞激活信號事件；pSMAC包含一系列黏附分子，如淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1（lymphocyte functionassociated antigen-1，LFA-1），負責(zé)穩(wěn)定細胞間的相互作用；dSMAC由絲狀肌動蛋白組成，有助于對突觸施加機械力，另外，dSAMC還聚集許多酪氨酸磷酸酶，最典型的即為CD45[40]。

CAR-T突觸并不像SMAC那樣具有高度組織性。相反，它們是雜亂無章的、零散的信號簇，缺乏明確的結(jié)構(gòu)。除了不形成較小且不典型的F-肌動蛋白環(huán)之外，CAR形成的免疫突觸缺乏黏附環(huán)并且Lck激酶簇呈散亂分布[9,41]（見圖2）。因此，CAR-T與其靶細胞形成的免疫突觸在結(jié)構(gòu)上不同于經(jīng)典免疫突觸[9,21]。這也可能是兩者具有殺傷能力差異的重要原因之一。

圖2 T細胞受體和嵌合抗原受體免疫突觸的比較Figure 2 Comparison of immune synapses between T cell receptor and chimeric antigen receptor

CAR-T突觸和經(jīng)典pMHC/TCR突觸之間的這些結(jié)構(gòu)差異會導(dǎo)致功能差異。對突觸形成后TCR-T介導(dǎo)的殺傷與CAR-T介導(dǎo)的殺傷的時程比較顯示，CAR-T的信號強度比TCR-T信號更強且上升更快，穿孔素（perforin）和顆粒酶B（granzyme B）的釋放更快，脫落也明顯更快。因此，與細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）相比，CAR-T殺死靶細胞的速度更快[9,41]。而無序的CAR-T突觸可能就是其快速殺傷活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[42]。需要指出的是，這里CAR-T的快速殺傷活性建立在高抗原密度的基礎(chǔ)上。在低抗原密度下，CAR-T近端信號弱且常受限于其活化閾值而不能夠?qū)Π屑毎M行有效殺傷[7]。這種對靶抗原的低敏感性正好能夠解釋在CAR-T免疫治療中由于腫瘤抗原低表達或無法檢測而導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)的現(xiàn)象[43]。

了解突觸的形成機制并鑒定其質(zhì)量非常有必要?；诓Ａе瞥傻钠矫嬷|(zhì)雙層系統(tǒng)的成像系統(tǒng)已被用于預(yù)測IS的質(zhì)量，并證明IS的質(zhì)量與CAR-T功能相關(guān)聯(lián)[44]。更有數(shù)據(jù)表明，在病理條件下，高IK頻率表明T細胞無能化，進入免疫耐受狀態(tài)而阻止腫瘤免疫[45]。由此可見，合適的IS形成是T細胞抗腫瘤功能發(fā)揮的必要條件。然而，目前IS在T細胞中的形成機制仍未完全了解，還有許多關(guān)鍵問題有待回答。例如CAR-T這種無序IS結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的機制尚不清楚。有研究人員將具有高親和力識別結(jié)構(gòu)的CAR與天然的TCR融合或連接后發(fā)現(xiàn)，改造后的T細胞能夠與相應(yīng)的靶細胞形成典型的穩(wěn)定的IS結(jié)構(gòu)[46-47]。因此，這種IS結(jié)構(gòu)的混亂也許并不是由于CAR對抗原的高親和力及它的非MHC限制性性質(zhì)所導(dǎo)致。鑒于IS結(jié)構(gòu)的重要性，仍需進一步了解其在抗腫瘤作用中的地位。

5 T細胞受體的近端信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

TCR通過其配體識別亞基與APC上特異性表達的pMHC復(fù)合物結(jié)合，激活TCR信號通路。SRC家族蛋白酪氨酸激酶Lck是TCR信號起始的關(guān)鍵因子，它能夠與CD4和CD8共受體的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并分別通過CD8或CD4與MHC I類或MHC II類復(fù)合物的共結(jié)合募集至TCR。處于活化構(gòu)象的Lck可以磷酸化ITAM，每個ITAM具有2個可被磷酸化的關(guān)鍵酪氨酸殘基，被雙磷酸化的ITAM可以招募相對分子質(zhì)量為70 000的ζ鏈相關(guān)蛋白激酶（zeta-chain-associated protein kinase-70，ZAP-70），使蛋白酪氨酸激酶ZAP-70結(jié)合到CD3鏈中[48]。這里需要說明的是，Lck激酶包括游離狀態(tài)和與共受體偶聯(lián)的2類群體，它們均能在TCR活化后磷酸化CD3，但游離狀態(tài)的激活態(tài)Lck會被更早地招募至TCR起始信號傳遞[49]。換言之，由Lck介導(dǎo)的TCR活化可以分為2個階段：首先，游離態(tài)Lck激酶最先被招募到TCR并磷酸化CD3 ITAM；接著，與共受體偶聯(lián)的Lck被招募，一方面能夠促進TCR與pMHC的結(jié)合，另一方面起到放大信號的作用[49-51]。隨后，與ITAM結(jié)合的ZAP-70被磷酸化并招募更多的ZAP-70分子且進一步傳遞信號。由此可見，Lck和ZAP-70之間存在著非常嚴格的層級關(guān)系，Lck位于ZAP-70的上游[24]。

Lck在TCR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起始中發(fā)揮非常重要的功能，它將細胞外TCR與pMHC的結(jié)合事件與細胞內(nèi)生物化學(xué)事件聯(lián)系在一起。研究發(fā)現(xiàn)，Lck的定位和構(gòu)象變化是TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要決定因素[52-53]。Lck由1個UD結(jié)構(gòu)域（unique domain）、2個調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域（SH3和SH2）和1個激酶結(jié)構(gòu)域（kinase domain）組成，它包含若干個磷酸化位點，其激酶活性受2個關(guān)鍵調(diào)節(jié)性酪氨酸位點Y394和Y505的磷酸化和去磷酸化控制。Y394位于Lck激酶環(huán)中，其自磷酸化可以穩(wěn)定催化結(jié)構(gòu)域的活性構(gòu)象。而C末端Src激酶（C-terminal Src kinase, Csk）能夠?qū)ck的活性負向調(diào)控，它通過對Lck羧基末端Y505殘基的磷酸化，促進Y505與Lck SH2結(jié)構(gòu)域的分子相互作用，從而穩(wěn)定了使催化結(jié)構(gòu)域失活的折疊構(gòu)象。CD3ε ITAM存在部分單磷酸化現(xiàn)象，這種單磷酸化的CD3ε能夠招募抑制性激酶Csk，發(fā)揮抑制性作用[54]。另外，跨膜酪氨酸磷酸酶CD45可使Lck磷酸化的Y505和Y394去磷酸化，因此，CD45可以直接調(diào)節(jié)控制Lck活性。上文中已經(jīng)提到，在T細胞活化早期，游離的活化型Lck最先被招募至TCR附近磷酸化CD3鏈以及一些關(guān)鍵的激酶來起始T細胞活化，這可能是由于游離的Lck比與共受體結(jié)合的Lck具有更高的流動性、更多的Y394磷酸化以及更強的激酶活性[55]，因而游離的Lck對于TCR的早期活化非常重要；但當共受體結(jié)合的Lck不能被招募到TCR周圍時，T細胞同樣不能被有效地活化[56]。另外，作為早期活化的重要成分，ITAM和ZAP-70的磷酸化都需要具有活性的Lck的存在，因此活化型的Lck必須位于TCR:pMHC附近足夠長的時間，以確保這些事件的發(fā)生。綜上，Lck的定位和構(gòu)象變化都將影響免疫突觸的形成和穩(wěn)定性。

關(guān)于CAR，與TCR共享相同的CD3ζ胞內(nèi)區(qū)的同時，它還包含CD28和腫瘤壞死因子超家族成員4-1BB等共刺激結(jié)構(gòu)域。因此CAR與TCR之間，以及包含不同共刺激結(jié)構(gòu)域的CAR之間的近端信號傳導(dǎo)不盡相同。例如，在包含CD28或4-1BB的2種二代CAR中，配體結(jié)合后，CD3ζ ITAM的磷酸化雖然位置相同，但強度不同，包含CD28的CAR在早期時間點檢測到更強的磷酸化信號。這可能是因為CD28含有1個可以結(jié)合Lck的脯氨酸富含區(qū)，使其能夠像共受體一樣招募Lck[57]。有關(guān)CAR的近端信號傳導(dǎo)仍屬于活躍的研究領(lǐng)域。

6 T細胞受體的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

在上述提及的一系列酪氨酸激酶初始激活后，T細胞活化銜接因子（the linker of active T cells, LAT）和含SH2結(jié)構(gòu)域相對分子質(zhì)量為76 000的白細胞磷酸化蛋白（SH2 domain-containing leukocyte phosphoprotein of 76 000, SLP-76）被磷酸化，活化T細胞，募集多個銜接因子和效應(yīng)分子，形成LAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體來調(diào)節(jié)下游信號[58]。LAT的磷酸化由ZAP-70介導(dǎo)，而兩者的連接通過Lck激酶的SH2作為橋梁所介導(dǎo)[59]。隨后，磷酸化的LAT招募磷脂酶C-γ（phospholipase C-γ, PLC-γ）、生長因子受體結(jié)合蛋白2（growth factor receptor-bound protein 2, GRB 2）和Shc下游GRB相關(guān)接頭蛋白（GRB-related adaptor downstream of Shc, Gads）。LAT相關(guān)效應(yīng)分子的活化導(dǎo)致信號通過3種主要信號通路進行轉(zhuǎn)導(dǎo)：鈣調(diào)蛋白、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子κ-B（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路。鈣調(diào)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)會導(dǎo)致活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）發(fā)生核轉(zhuǎn)移。MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致肌動蛋白聚合以及轉(zhuǎn)錄因子FOS，JUN和激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）的激活；NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)使REL和NF-κB轉(zhuǎn)錄因子核移位；這些轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用引起T細胞增殖和遷移、細胞因子分泌、免疫突觸的形成以及相關(guān)效應(yīng)功能。由此可見，LAT是T細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的必需支架蛋白。

由于CAR是利用CD3ζ作為信號基序去激活T細胞的效應(yīng)功能，因此普遍認為CAR存在與TCR相同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。許多著眼于CAR下游的磷酸化事件的研究結(jié)果顯示CAR-T和TCR-T的磷酸化事件雖然在量級和動力學(xué)上存在差異，但CAR-T中并未出現(xiàn)新的通路[57,60-61]。CAR利用相同的分子機制去轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，包括PLC-γ，ZAP-70，LAT和Src家族蛋白激酶等。但也有研究表明，CAR和TCR擁有不同的信號通路，即CAR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以繞過LAT[10]。此外，CAR-T對抗原刺激之后的表現(xiàn)仍有無法解釋的方面。例如，與TCR相比，CAR觸發(fā)下游信號分子的酪氨酸磷酸化更快，細胞毒性顆粒釋放更快[62]。通過直接將TCR和CAR表達在同一細胞中進而比較它們的信號過程，發(fā)現(xiàn)盡管TCR信號與CAR信號相比更緩慢和更微弱，但TCR信號更為持久[9]。另外，兩者對抗原的敏感性不同。已有許多研究指出，TCR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有高度的敏感性，在只有單個抗原pMHC存在的情況下，就足以激活T細胞反應(yīng)[8,63]。然而，CAR的激活需要更多的抗原分子刺激[62]。有學(xué)者解釋這種低敏感性是由于CAR活化時近端信號明顯減弱導(dǎo)致，盡管CAR在免疫突觸內(nèi)的抗原結(jié)合親和力方面表現(xiàn)優(yōu)于TCR，但其胞內(nèi)區(qū)CD3ζ鏈的酪氨酸蛋白激酶ZAP-70的招募效率很低[7]。CAR的這種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷，一方面限制了CAR-T療法治療表面抗原密度低的腫瘤的療效；另一方面，這也許解釋了CAR-T臨床治療中患者由于腫瘤的抗原表達水平低或無法檢測到而出現(xiàn)癌癥復(fù)發(fā)的現(xiàn)象。

CAR和TCR在激活后具有許多相似的下游信號事件，如它們都分泌穿孔素和顆粒酶B去誘導(dǎo)靶細胞的凋亡，并表達細胞因子和趨化因子來增強免疫功能或調(diào)控炎癥反應(yīng)，然而，臨床報告卻顯示出不同的結(jié)果。細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS）表現(xiàn)為CAR-T療法中最常見的毒性，其確切的機制尚不完全清楚；其潛在的原因可能是CAR異?；蜻^度活化的信號。在靜息態(tài)T細胞中，CD3ζ肽鏈對借助于其C末端的正電與質(zhì)膜上帶負電的酸性磷脂相互作用，從而達到屏蔽信號的作用[29]。而當抗原不存在時，CAR-T仍存在很強的基底信號[64]。因此，高強度的基底信號也許放大了信號而促進細胞因子的產(chǎn)生，進而進一步導(dǎo)致細胞因子風(fēng)暴的產(chǎn)生而影響CAR-T療法的療效。此外，在天然的TCR復(fù)合物中，CD3ε ITAM可被單磷酸化，從而招募Csk磷酸酶，發(fā)揮負調(diào)控功能[54]。提示除了過強的活化信號，有關(guān)負調(diào)控信號在CAR中的缺失也可能是導(dǎo)致CRS的重要原因?？傊烊籘CR復(fù)合物結(jié)構(gòu)遠比想象的更復(fù)雜，故應(yīng)當意識到其在指導(dǎo)過繼性免疫療法中T細胞設(shè)計改造方面的重要性。

7 結(jié)語

TCR-T和CAR-T療法均為過繼性免疫療法治療癌癥的前沿技術(shù)，且基本思路均為將T細胞在體外進行修飾、擴增后再植入患者體內(nèi)，2種改造過的受體都能夠介導(dǎo)T細胞發(fā)揮腫瘤殺傷作用。但兩者顯然存在許多不同：包括結(jié)構(gòu)、抗原識別機制和識別類型、對抗原響應(yīng)的敏感度等。CAR-T療法已在難治性白血病和淋巴瘤患者中誘導(dǎo)了顯著的反應(yīng)，并獲得了美國FDA的批準，因此其對血液瘤及淋巴瘤的功效毋庸置疑。但目前許多臨床數(shù)據(jù)均顯示TCR-T療法在治療實體瘤的能力方面比CAR-T療法略勝一籌?？偟膩碚f，從2種細胞本身特點出發(fā)：首先，CAR-T靶向腫瘤抗原，而TCR-T除了識別表面抗原之外，還能夠通過白細胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）提呈進而靶向細胞內(nèi)蛋白質(zhì)組，這意味著TCR-T可以識別廣泛的腫瘤抗原，不限于膜表達抗原，還包括一些由體細胞突變產(chǎn)生的新抗原（neo-antigen）。此外，從患者體內(nèi)取出的T細胞所制備的TCR-T與患者HLA等位基因匹配，避免了移植后的免疫排斥反應(yīng)。最后，TCR-T有更好的腫瘤浸潤和分布，而CAR-T由于識別表面抗原傾向于分布在腫瘤周圍，使得TCR-T在治療實體瘤時更有效[11]。盡管如此，目前對于特異性腫瘤抗原靶點的發(fā)現(xiàn)還甚少，并且從病人體內(nèi)取出的T細胞無法在體外有效地大量擴增，體外的制備工序費時費力。另外，科學(xué)家們現(xiàn)在還無法很好地解決T細胞療法治療后的大量不良反應(yīng)。綜上所述，過繼性免疫細胞療法治愈癌癥任重而道遠。不論是CAR-T療法，還是TCR-T療法都仍存在一系列問題，因此很有必要清楚理解基本的TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，并為設(shè)計更好的T細胞產(chǎn)品提出新的策略，以求其在實體瘤臨床治療中得到進一步應(yīng)用。